芍藥苷對巨噬細胞炎癥因子表達的影響

劉子菁 張嘉文 姜沛彧 尹 智 劉韻祎劉乙萱 王小燕 劉文濤 許 陽

1南京醫科大學第一附屬醫院皮膚科，南京，210029；2南京醫科大學基礎醫學院藥理學,南京，211100

玫瑰痤瘡是一種慢性炎癥性皮膚病，世界范圍內各國報道發病率不一，總體在2%～22%。其典型臨床表現為面中部陣發性潮紅、持久性紅斑、毛細血管擴張、丘疹、膿皰、水腫、增生肥大等不同表型的組合，影響患者日常生活及社交[1]。目前認為玫瑰痤瘡發病機制與遺傳、微生物感染、神經血管失調、免疫系統失衡等有關。近來，越來越多研究著重于探討玫瑰痤瘡中的天然免疫，有研究發現玫瑰痤瘡皮損中存在大量天然免疫細胞浸潤，包括巨噬細胞、肥大細胞和中性粒細胞[2]。其中不同研究提示玫瑰痤瘡皮損處巨噬細胞顯著增多，與玫瑰痤瘡炎癥反應密切相關[3-5]。芍藥苷(paeoniflorin，PF)是一種具有抗炎作用的中藥成分，其對于巨噬細胞的炎癥反應的作用提示其是否可能為玫瑰痤瘡潛在的治療藥物選擇。

本研究擬通過組織病理及免疫組化探討玫瑰痤瘡中巨噬細胞相關炎癥分子表達，并在細胞水平初步探討芍藥苷對于脂多糖誘導的巨噬細胞炎癥反應的影響。

1 材料與方法

1.1 組織、細胞及試劑 9例玫瑰痤瘡皮膚組織來源于南京醫科大學第一附屬醫院皮膚科經臨床及組織學診斷為肉芽腫型玫瑰痤瘡患者皮膚活檢標本。巨噬細胞為小鼠單核細胞系Raw 264.7細胞(ATCC號:TIB-71)。DMEM高糖培養基購自美國ThermoFisher Scientific公司，10%胎牛血清購自美國Gibco公司；芍藥苷購自MCE公司；LPS購自sigma公司；CCK8試劑盒購自上海東仁化學科技有限公司；兔抗鼠SOCS3、p38、ASK1購自美國CST公司，兔抗鼠Tlr2、LL37、CD68、IL-1β購自美國Abcam公司，小鼠單抗β-actin購自Santa Cruz公司。HiScript II Select qRT SuperMix和SYBR Premix Ex TaqII購自南京諾唯贊生物科技有限公司。石蠟包埋機、石蠟切片機購自武漢俊杰電子有限公司，倒置顯微鏡購自日本尼康公司。

1.2 方法

1.2.1 組織病理學及免疫組化染色 皮膚組織標本經甲醛固定、石蠟包埋、切片、脫蠟后行HE 染色，光學顯微鏡下觀察形態學特征并采集圖像。另取空白切片采用CD68、SOCS3、LL37和IL-1β行免疫組化染色(1∶1000稀釋)，光學顯微鏡下采集圖片并分析皮損及非皮損區域陽性染色區域差異。

1.2.2 巨噬細胞及分組 將2×105Raw 264.7細胞在含10%胎牛血清無鈣DMEM培養基于37℃和5%CO2培養箱中培養至細胞融合度達70%時進行下一步實驗。將不同濃度(10-9～10-2mol/L)PF加入Raw 264.7細胞培養基后16 h檢測細胞增殖活性，篩選出不影響巨噬細胞增殖的合適PF實驗濃度。此后Raw 264.7細胞分為三組，包括對照組、LPS誘導組(培養基中加入1μg/mL LPS，即為LPS組)以及干預誘導組(預先加入10-5mol/L PF培養4 h后，再加入1μg/mL LPS，即PF+LPS組)，繼續培養Raw 264.7細胞12h以上進行后續實驗。

1.2.3 巨噬細胞形態學檢測及增殖活性測定 在倒置顯微鏡下觀察對照組、LPS組以及PF+LPS組細胞形態學改變并采集圖片。細胞增殖活性采用CCK-8試劑盒按說明進行操作測定。

1.2.4 qRT-PCR檢測炎癥因子基因表達 引物序列如表1所示,具體采用△Ct 法進行數據分析，以Actin為內參對照，計算三組Raw 264.7細胞中Camp、Tlr2和p38炎癥因子基因相對表達量。

1.2.5 Western Blot檢測炎癥因子蛋白表達 提取對照組、LPS組以及PF+LPS組Raw 264.7細胞蛋白后經Western blot分別檢測SOCS3、p38、ASK1、Tlr2(1∶1000稀釋)蛋白表達，提取上清蛋白檢測LL37(1∶1000稀釋)蛋白表達，β-actin為對照。

1.2.6 統計學方法 免疫組化圖像根據陽性細胞數×染色強度，進行IRS評分分析[6]。Western Blot蛋白條帶采用imageJ軟件分析灰度，采用SPSS17.0統計軟件進行統計分析，計量資料的兩組間比較采用t檢驗,多組間比較采用方差齊性檢驗及單因素方差分析 (ANOVA)，所有分析均采用雙側檢驗，P<0.05為有統計學差異。

表1 RAW細胞引物序列表

2 結果

2.1 玫瑰痤瘡組織標本中巨噬細胞及炎癥因子 皮膚組織經HE染色鏡下可見真皮內大量炎癥細胞浸潤，多為淋巴細胞，另可見結節樣分布的上皮樣細胞肉芽腫(圖1)。CD68免疫組化染色可見皮損區大量棕色顆粒，較皮損周邊區域顯著增強，提示玫瑰痤瘡皮損區有大量巨噬細胞浸潤，另皮損區LL37、IL-1β和SOCS3表達較周邊增強，即提示玫瑰痤瘡皮損區域炎癥因子中LL37、IL-1β和SOCS3表達增高，且較周邊非皮損區存在統計學差異(圖2)。

圖1真皮內大量炎癥細胞浸潤，多為淋巴細胞，另可見結節樣分布的上皮樣細胞肉芽腫(HE,×100)

2.2 PF對LPS誘導巨噬細胞活化及合成炎癥因子的影響

2.2.1 無細胞毒性PF實驗濃度的篩選 不同組Raw 264.7細胞培養基中加入10-9～10-2mol/L 不同濃度PF后培養16 h檢測細胞增殖活性，發現與10-2mol/L及10-3mol/L PF共同培養的Raw 264.7細胞增殖活性較空白對照組細胞顯著下降(P<0.05)，而不高于10-5mol/L PF則對Raw 264.7細胞增殖活性無顯著影響(圖3)。

圖2玫瑰痤瘡皮損組織免疫組化染色 a～c,d～f,g～i,j～k分別為CD68，LL37，IL-1β和SOCS3免疫組化染色及其對應的陽性染色率IRS定量分析圖，N=9，*P<0.05(a,d,g,j:×100;b,e,h,k:×400)

2.2.2 PF對LPS誘導巨噬細胞活化的影響 倒置顯微鏡下正常Raw 264.7細胞呈大小均一的圓或類圓形，無明顯樹突狀反應，LPS誘導后的Raw 264.7細胞則出現胞體增大，細胞周邊偽足伸出，細胞形狀變不規則而呈樹突狀改變。而LPS+PF組中Raw 264.7細胞鏡下可見樹突狀改變細胞比例較LPS組明顯減少，仍多呈圓或類圓形細胞(圖4)。

2.2.3 PF可抑制LPS誘導的巨噬細胞合成LL37 培養基中加入1μg/mL LPS的Raw 264.7細胞培養12 h后qRT-PCR結果提示LL37基因camp mRNA表達較對照組明顯增高，而10-5mol/L芍藥苷處理組Raw 264.7細胞加入LPS后LL37基因camp mRNA表達較對照組增高，較LPS組下降(P<0.05)。Western Blot檢測細胞上清液LL37蛋白結果趨勢與之類似(圖5)。

圖3不同濃度PF對Raw 264.7細胞增殖的影響(N=3，與對照組比，10-2mol/L及10-3mol/L PF預處理組細胞增殖存在統計學差異，*P<0.05)

2.2.4 PF對LPS誘導的巨噬細胞炎癥因子的影響 培養基中加入1μg/mL LPS的Raw 264.7細胞培養12 h后qRT-PCR結果提示Tlr2和p38表達較對照組明顯增高，而PF預處理則可緩和這一改變，PF+LPS組Tlr2和p38基因表達較對照組增高，而較LPS組為低。Western Blot檢測對照組、LPS組和 PF+LPS組胞內蛋白，結果趨勢與mRNA結果類似，LPS組Raw 264.7細胞ASK1、TLR2和p38表達增加，SOCS3表達降低，而PF的預處理則可緩和LPS誘導的炎癥因子改變，PF可抑制LPS誘導的Raw 264.7細胞的ASK1、TLR2和p38表達增加及SOCS3表達降低(P<0.05)，見圖6。

3 討論

玫瑰痤瘡是臨床常見慢性炎癥性皮膚病，依據典型表現，玫瑰痤瘡常分為四種臨床亞型，包括紅斑毛細血管擴張型(erythematotelangiectatic rosacea，ETR)、丘疹膿皰型(papulopustular rosacea，PPR)、肥大增生型(phymatous rosacea，PhR)和眼型(ocular rosacea，OR)，但由于亞型間存在癥狀重疊并可相互轉化，故近年來逐步采用表型描述取代了臨床分型[7]。

玫瑰痤瘡具體發病機制仍不清楚，可能是在一定遺傳背景基礎上，多因素誘導的以天然免疫和血管舒縮功能異常為主導的慢性炎癥性疾病。有文獻認為玫瑰痤瘡與天然免疫細胞包括巨噬細胞、肥大細胞和中性粒細胞密切相關[2]，而其中巨噬細胞是重要的免疫調節細胞。

圖4不同組Raw 264.7細胞顯微鏡下形態 a：對照組，×400；b：LPS組，×400；c：LPS+PF組，×400

圖5 PF可抑制LPS誘導巨噬細胞合成camp基因和LL37蛋白(N=3，與對照組相比，*P<0.05，與LPS組相比，# P<0.05)

圖66a～6g：PF可抑制LPS誘導巨噬細胞合成Tlr2和p38基因，并抑制LPS誘導的巨噬細胞ASK1、TLR2和p38表達增加及SOCS3表達降低(N=3，與對照組相比，*P<0.05；與LPS組相比，#P<0.05)

Buhl等[3]發現ETR、PPR及PhR三種臨床亞型的玫瑰痤瘡皮損中均存在顯著巨噬細胞和肥大細胞浸潤。Smith等[5]同樣在20例玫瑰痤瘡皮損樣本中發現類似的顯著巨噬細胞局部浸潤，同時伴有血管內皮細胞因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、VEGF受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)1和VEGFR2的高表達。Georgala等[4]研究有類似結果，并推測增多的巨噬細胞可能與局部毛囊蠕形螨過度增殖有關。近有研究證實在玫瑰痤瘡患者皮損及LL37誘導的玫瑰痤瘡樣小鼠模型皮損中解聚素金屬蛋白酶家族癸蛋白1(Disintegrin Metalloprotease ADAM-like Decysin-1，ADAMDEC1)均表達增高，且細胞學實驗進一步證實ADAMDEC1可通過促進巨噬細胞經典活化而參與玫瑰痤瘡炎癥反應[8]。經典活化的巨噬細胞可由LPS或Th1細胞因子等誘導，進而分泌大量促炎因子和趨化因子包括白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-6、IL-12和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)而參與炎癥反應[9]。這些結果均提示巨噬細胞的活化與玫瑰痤瘡炎癥反應密切相關，且抑制巨噬細胞經典活化的分子或成分可能是治療玫瑰痤瘡的潛在藥物選擇。

人抗菌肽LL37是玫瑰痤瘡致病過程中的重要因子，皮內注射LL37是誘導玫瑰痤瘡小鼠模型的經典方法[10]。玫瑰痤瘡患者皮損處角質形成細胞高表達的TLR2可通過促進KLK5的合成及活性，進而使LL37表達上調[11]。Toll樣模式識別受體(Toll-like receptor，TLR)可表達于角質形成細胞、巨噬細胞表面。TLR2識別皮表微生物如表皮葡萄球菌、痤瘡丙酸桿菌產物如LPS促發炎癥反應，LL37、TNF-α、IL-1β等炎癥因子升高，進而誘發玫瑰痤瘡相關的血管擴張、增生及炎性皮疹表現。已有研究證實玫瑰痤瘡患者皮膚中TLR2和LL37表達明顯增高[2]。

我們實驗中玫瑰痤瘡皮損組織病理提示皮損區顯著炎癥細胞浸潤，免疫組化結果提示巨噬細胞浸潤明顯，且炎癥因子LL37、IL-1β表達顯著增高，與此前文獻報道結果均相符合。

TLR2介導的p38和細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)活化對于鏈球菌M1蛋白[12]、表皮葡萄球菌LP01脂肽[13]等刺激皮膚后產生的炎癥和抗菌反應過程密切相關。p38蛋白激酶是細胞絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPK)家族中控制炎癥反應最重要的成員，可進一步激活與炎癥反應相關的蛋白激酶和轉錄因子。Wladis等[14]發現眼型玫瑰痤瘡患者較正常健康人群眼瞼皮膚組織活化的p38和ERK表達增高。Yamasaki等[10]研究發現LL37可促進玫瑰痤瘡皮膚炎癥反應，而抑制p38則可選擇性抑制LL37所誘導角質形成細胞合成IL-36γ[15]。細胞凋亡信號調節激酶 1(Apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1)是細胞絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase kinase kinase，MAP3Ks)家族成員之一。活性氧(reactive oxygen species, ROS)可經ASK1進而激活p38誘導巨噬細胞表達人β防御素(humanβ-defensins，hβD)1-3和LL37促進炎癥反應[16]。這些結果均提示TLR2、ASK1和p38在抗菌肽介導的玫瑰痤瘡皮膚炎癥中具有重要作用。

細胞因子信號抑制蛋白3(suppressor of cytokine signaling3, SOCS3)是一種常見的抑制性信號調節蛋白，參與負反饋調節MAPK等多條重要的信號通路。但多種細胞因子如IL-2、INF-γ、IL-6等可反饋性促進SOCS3表達[17,18]。

PF是一種單萜類糖苷化合物，為白芍總苷的主要成分，具有一定抗炎和免疫抑制作用。在銀屑病模型小鼠中的研究[19]發現PF可減少銀屑病皮損中嗜中性粒細胞和巨噬細胞的浸潤，并進而減少相關炎癥因子表達。我們的細胞學實驗結果發現PF的預處理可緩解LPS誘導的巨噬細胞合成TLR2、ASK1、p38的增高和SOCS3的降低，提示PF可抑制LPS誘導的巨噬細胞炎癥反應。而在玫瑰痤瘡組織病理中，我們研究發現玫瑰痤瘡皮損區較周邊區域SOCS3表達明顯增高，推測可能因玫瑰痤瘡皮損中多種炎癥因子增高反饋性促進抑炎因子SOCS3表達有關。

我們的研究進一步驗證了玫瑰痤瘡皮損中存在大量巨噬細胞浸潤，且炎癥因子LL37、IL-1β和SOCS3表達增強，并在細胞學水平初步探討了PF對于LPS誘導的巨噬細胞炎癥反應的影響，發現PF的抑制作用通過減緩TLR2、ASK1、p38表達增高和SOCS3表達降低而實現，但實驗亦存在一定不足，如能在玫瑰痤瘡小鼠模型中進一步驗證我們的結果為最佳。

綜上所述，玫瑰痤瘡與巨噬細胞及炎癥因子密切相關。芍藥苷通過影響TLR2、SOCS3、ASK1和p38炎癥分子的表達可抑制脂多糖誘導的巨噬細胞炎癥反應，可能是潛在治療玫瑰痤瘡的藥物選擇。