益氣活血通絡方對急性腦梗死大鼠炎癥因子、氧化應激指標及神經細胞凋亡的影響?

閆振文 鄭眉光 李 梅

（中山大學孫逸仙紀念醫院，廣東 廣州 510120）

急性腦梗死（ACI）系指腦缺血發生在6～12 h之內，缺血區腦組織會產生病理改變，細胞出現明顯的缺血變化。腦細胞缺血缺氧后，腦組織將會發生氧化應激反應和炎性反應等一系列病理反應，誘導產生大量氧自由基和炎性因子，使蛋白質、氨基酸、脂質等過氧化，產生細胞毒性并破壞血腦屏障，進一步加重腦損傷，導致大腦水腫和神經細胞凋亡[1]。研究發現，腦組織缺血后，自由基可通過激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號轉導通路協同誘導神經細胞凋亡[2]。目前，臨床對ACI的治療主要以恢復血供、增加氧再灌注水平為原則，以減輕甚至避免因缺血缺氧導致的腦組織損傷，最大限度地保護腦組織。常規治療以溶栓、抗凝、抗血小板聚集等方法為主，尤其是靜脈溶栓，被醫學界公認為挽救缺血腦組織的重要方法，但均無法及時清除氧自由基等物質[3]。

急性腦梗死在中醫學上屬“內風”范疇，為內傷病證。中醫認為誘發中風的病因主要有機體腑臟失調、情志郁怒、飲食不節、勞累過度、氣候改變等，其病機多以氣血運行不暢、瘀血阻脈、久瘀化熱最常見，故治療時應以活血化瘀、行氣通絡為主[4]。益氣活血通絡方以黃芪、黨參為君藥，以當歸、丹參、川芎為臣藥，具有益氣固表、活血化瘀、行氣解毒通絡的功效，適用于中風。本研究通過復制SD大鼠急性腦梗死模型，旨在探討益氣活血通絡方對急性腦梗死模型大鼠相關炎癥因子、氧化應激指標及神經細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 50只清潔級雄性SD大鼠，7～8周齡，平均體質量（250±20）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號：SCXK-（京）2010-0015，合格證號：110011191100312。所有動物室溫飼養，自由飲水進食，符合《實驗動物管理條例》要求。

1.2 藥物與試劑 益氣活血通絡方，組成：黃芪30 g，黨參30 g，川芎10 g，當歸10 g，丹參10 g，赤芍10 g，紅花10 g，桃仁15 g，地龍10 g，甘草6 g。上述中藥飲片均由本院中藥房提供，藥材加水煎煮2次，合并藥液共200 mL，生藥含量0.7 g/mL。注射用尿激酶（廣東天普生化醫藥股份有限公司，批號20190521，規格25萬單位）；阿司匹林腸溶片（拜阿司匹林，沈陽奧吉娜藥業有限公司，批號20190323，規格100 mg）；硫酸氫氯吡格雷片（帥信樂普藥業股份有限公司，批號20180715，規格75 mg）；依達拉奉注射液（國藥集團國瑞藥業有限公司，批號91130117，規格30 mg/20 mL）；水合氯醛（分析純，天津市瑞金特化學品有限公司）；蘇木精-伊紅染色液（武漢華美生物工程有限公司）；白細胞介素-8（IL-8）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒、S100B蛋白試劑盒購于武漢博士德生物技術有限公司；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、腦源性神經營養因子（BDNF）由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 實驗儀器 RM2235型病理切片機，德國萊卡公司；BX60顯微鏡，日本Olympus Optical公司；LDZ-2型低速離心機（北京京立離心機有限公司）；AU5400全自動生化分析儀，日本奧林巴斯有限公司；ELx800酶標儀，美國伯騰儀器有限公司。

1.4 模型制備 大鼠隨機分為對照組10只、假手術組10只、手術組30只。參照Zealand-Longa線栓法[5]復制大腦中動脈缺血模型（MCAO）。將手術組30只大鼠用5%水合氯醛（400 mg/kg）行腹腔麻醉，將實驗大鼠側臥固定于手術臺上，頸正中線切口，分離右側頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈，分別結扎頸外動脈與頸總動脈。在頸總動脈分叉下方開一切口，將線栓從切口處插入頸內動脈，有明顯阻力感時停止插入，剪去線栓尾端部分，并在頸內動脈根部固定，逐層縫合皮下組織及皮膚。術后腹腔注射2萬單位青霉素，大鼠保持側臥位，體溫維持在37℃左右，注意吸痰保持呼吸道通暢。動物清醒后明顯有對側Horner征及偏癱體征，包括：1）身體向左傾倒或轉圈；2）左側軀體對疼痛刺激無反應；3）提尾懸空時左前肢前伸現象消失；顯示造模成功。神經功能缺損評分1～3分為合格，不合格者剔除。假手術組10只大鼠將栓線由ECA斷端插入ICA，保留約1 min后將栓線拔出，結扎ECA斷端，其余步驟同模型組。

1.5 分組及給藥 成模大鼠分為模型組、西藥組、聯合組（西藥組+益氣活血通絡方），于建模后第10日開始給藥。對照組、假手術組和模型組給予生理鹽水灌胃，劑量為5 mL/kg。西藥組給予注射用尿激酶靜滴，劑量5萬U/kg；阿司匹林腸溶片和氯吡格雷灌胃，劑量各1 mg/kg；依達拉奉靜滴，劑量0.15 mg/kg。聯合組在西藥組基礎上給予益氣活血通絡方灌胃，劑量5 mL/kg。各組均每天灌胃1次，連續治療10 d。

1.6 標本采集與檢測 1）炎癥因子測定：于末次給藥后，心臟取血，離心，取上層血清，采用酶聯免疫吸附法（ELISA）測定各組大鼠血清IL-8和TNF-α水平，嚴格按說明書操作。2）氧化應激指標測定：心臟取血，離心，取上層血清，采用黃嘌呤氧化酶法測定各組大鼠SOD水平，采用ELISA測定MDA水平，嚴格按說明書操作。3）神經功能指標測定：心臟取血，離心，取上層血清，采用放射免疫法檢測血清S100B蛋白、BDNF水平，嚴格按說明書操作。4）腦組織病理切片：末次給藥后處死各組大鼠，4℃下快速斷頭取腦，0.9%氯化鈉注射液清洗后，置于4%多聚甲醛中固定48 h，二甲苯脫脂，酒精梯度脫水，石蠟包埋，切片，每片厚約5 μm，蘇木精-伊紅染色，觀察各組大鼠的腦組織病理變化。

1.7 統計學處理 應用SPSS22.0統計軟件。計量資料以（±s）表表示，組間或組內數據比較采用t檢驗；采用χ2檢驗進行計數資料的比較，以n（%）表示計數資料。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組腦組織病理學比較 見圖1。各組大鼠腦組織病理學切片顯示：聯合組少數神經細胞死亡，細胞質疏松及腫脹明顯減輕；西藥組細胞核少見固縮，腦組織水腫有減輕；模型組腦組織周圍神經元腫脹并出現皺縮，細胞核固縮，梗死灶內細胞和血管壞死，正常組織消失，結構模糊、間質水腫；對照組及假手術組細胞形態正常，分布均勻，未見皮質部蒼白梗死。

圖1 各組大鼠腦組織病理學切片（HE染色，400倍）

2.2 各組炎癥因子水平比較 見表1。對照組和假手術組大鼠的IL-8、TNF-α水平相比無明顯差異（P＞0.05）。與對照組比較，模型組IL-8、TNF-α水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，西藥組和聯合組IL-8、TNF-α水平均顯著降低（P＜0.05）；與西藥組比較，聯合組IL-8、TNF-α水平顯著降低（P＜0.05）。

表1 各組大鼠IL-8、TNF-α水平比較（ng/L，±s）

表1 各組大鼠IL-8、TNF-α水平比較（ng/L，±s）

與對照組比較，?P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與西藥組比較，△P＜0.05。下同

TNF-α組別n IL-8 6.14±0.86 6.82±1.04 22.31±1.58*11.59±1.25*#8.37±1.12#△對照組假手術組模型組西藥組聯合組10 10 10 10 10 18.40±3.91 19.12±4.03 43.52±15.48*30.36±12.35*#22.27±9.56#△?

2.3 各組氧化應激指標比較 見表2。對照組和假手術組大鼠的SOD、MDA水平比較無明顯差異（P＞0.05）。與對照組比較，模型組SOD水平顯著降低、MDA水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，西藥組和聯合組SOD水平均顯著升高、MDA水平均顯著降低（P＜0.05）；與西藥組比較，聯合組SOD水平顯著升高、MDA水平明顯降低（P＜0.05）。

表2 各組大鼠SOD、MDA水平比較（±s）

表2 各組大鼠SOD、MDA水平比較（±s）

組別對照組假手術組模型組西藥組聯合組n 10 10 10 10 10 SOD（U/L）138.41±8.03 137.36±8.17 74.52±5.28*100.86±6.42*#123.77±7.86#△MDA（μmol/L）6.14±0.87 6.79±0.94 21.64±1.36*11.32±1.23*#8.27±1.02#△

2.4 各組神經功能指標比較 見表3。對照組和假手術組大鼠的S100B、BDNF水平比較無明顯差異（P＜0.05）。與對照組比較，模型組BDNF水平顯著降低、S100B水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，西藥組和聯合組BDNF水平均顯著升高、S100B水平均明顯降低（P＜0.05）；與西藥組比較，聯合組血清BDNF水平明顯升高、S100B水平顯著降低（P＜0.05）。

表3 各組大鼠S100B、BDNF水平比較（ng/mL，±s）

表3 各組大鼠S100B、BDNF水平比較（ng/mL，±s）

組別對照組假手術組模型組西藥組聯合組n 10 10 10 10 10 S100B 0.54±0.17 0.58±0.15 2.52±0.28*1.46±0.23*#0.83±0.19#△BDNF 6.82±0.31 6.75±0.34 2.73±0.46*4.32±0.38*#5.94±0.22#△

3 討 論

急性腦梗死具有發病急、致殘率和死亡率均較高而治愈率低等特點[6]，嚴重威脅人類的生命健康。ACI發病后腦組織會發生不可逆損傷，嚴重者還可能出現腦組織缺血性壞死，易引發神經系統功能性異常[7]。

研究發現，腦缺血性損傷的發生發展與氧化應激、炎性反應均密切相關[8]。氧化應激系指機體受到刺激后，氧化和抗氧化能力失衡，傾向于氧化，導致中性粒細胞炎性浸潤，蛋白酶分泌增加，進而產生大量氧化中間產物，是自由基大量堆積所致的負作用，其和炎癥通常緊密相連、相伴而生[9]。研究證明，氧自由基的大量堆積是引發急性缺血性神經細胞死亡的重要原因之一[10]，所以有效減少氧自由基，減輕氧化應激反應并抑制炎性反應是治療急性腦梗死的重要手段。SOD作為體內重要的抗氧化酶，是氧自由基的自然天敵，是清除氧自由基的頭號物質，可對抗甚至逆轉氧自由基對細胞的損害，修復自由基引起的細胞損傷。有研究表明，SOD能通過磷酸化AKT減弱缺血損傷導致的細胞凋亡[11]。

當生物體內產生大量的氧自由基時，會大量消耗SOD，使SOD水平降低；而MDA是由細胞膜中脂質氧化后形成的，是氧化應激反應與氧自由基升高的重要標志物，因此MDA水平的高低直接反映了生物體內氧自由基的水平以及氧化應激反應的程度，是評估氧自由基水平及氧化應激的重要指標[12]。目前臨床已逐漸重視腦缺血早期對腦組織的炎性損傷，意識到IL-8和TNF-α等炎癥因子在誘發炎性反應的過程中起著重要作用[13]。其中IL-8屬于趨化因子家族的一種細胞因子，利于趨化免疫效應細胞，通過對中性粒細胞的細胞趨化作用而實現對炎癥反應的調節，并能促使多種生物活性物質釋放[14]。TNF-α是一種單核因子，屬前炎細胞因子，主要由活化的單核細胞和巨噬細胞產生，促進中性粒細胞吞噬，誘導肝細胞急性期蛋白合成，是重要的炎癥因子，且IFN-γ對TNF-α的生成有刺激作用。當腦組織缺氧缺血時，TNF-α水平將會升高，并能誘導中性粒細胞和單核細胞產生IL-8，引發炎性反應，進而相互影響，共同作用造成細胞損害[15]。因此，有效降低IL-8和TNF-α等炎癥因子水平對減輕炎性反應、控制炎性損傷有重要意義。

S100B蛋白是一種腦特異蛋白，主要分布于神經系統星形膠質細胞、垂體前葉細胞。當星形膠質細胞發生損傷時，S100B蛋白的釋放量會明顯增加，并進一步刺激星形膠質細胞、小膠質細胞產生大量炎性因子及NO，誘導神經細胞凋亡而損傷神經功能，因而S100B蛋白水平的高低與急性腦缺血損傷的程度密切相關[16]。BDNF是在腦內合成的一種內源性腦神經營養因子，主要在中樞神經系統內表達，對神經元的分化和生長再生具有維持和促進作用。ACI發病后，在神經元損傷的早期，BDNF釋放量會顯著增加，以保護神經功能[17]；但后期，當神經元損傷因素持續大量存在時，會過度消耗BDNF，同時還能使BDNF合成減少，導致生物體內BDNF水平降低。故提高BDNF水平對減輕腦缺血損傷后期神經元損傷，降低神經細胞凋亡有著重要作用。

中醫學認為ACI屬于“中風病”范疇，其病機主要為氣血不足、血瘀阻絡，多因氣滯血行不暢或氣虛運血無力，導致腦絡痹阻而引發該病，因此益氣活血、行氣祛瘀通絡是治療該病的基本原則[18]。益氣活血通絡方以黃芪、黨參為君藥，益氣固表、補氣升陽；配以當歸、丹參、川芎，活血化瘀、行氣止痛、祛風通絡；加赤芍、紅花、桃仁、地龍，以破血逐瘀、清熱涼血、通經活絡；配甘草以補脾益氣、緩急解毒、調和諸藥，達到益氣活血、化瘀通絡的功效。現代藥理學研究表明[19-20]，丹參可改善血流動力學指標，且具有抗炎作用，能減輕炎癥因子對腦神經細胞的損傷，并促進組織修復再生，從而恢復神經功能；川芎能抑制血小板聚集，增強纖溶系統活性，產生抗血栓作用，還能擴張血管、改善微循環、抑制神經細胞炎癥反應，降低血管內皮細胞和神經細胞凋亡，促使中樞神經營養因子表達，保護缺血損傷的神經細胞；當歸、紅花能抗血小板聚集，并擴血管改善微循環，保護腦神經元；赤芍能緩解腦缺血后引起的腦組織損傷；桃仁可抗血栓形成；地龍中含有纖維蛋白酶和纖維蛋白原激活酶，具有一定的溶栓作用。

本研究發現，手術組和假手術組大鼠的各項指標相比較，無顯著差異。與對照組比較，模型組IL-8、TNF-α水平顯著升高；與模型組比較，西藥組和聯合組IL-8、TNF-α水平顯著降低；與西藥組對比，聯合組各指標顯著降低。與對照組比較，模型組SOD水平顯著降低、MDA水平顯著升高；與模型組比較，西藥組和聯合組SOD水平均顯著升高、MDA水平均顯著降低；與西藥組比較，聯合組SOD水平顯著升高、MDA水平顯著降低。與對照組比較，模型組BDNF水平顯著降低、S100B水平顯著升高；與模型組比較，西藥組和聯合組BDNF水平均顯著升高、S100B水平均顯著降低；與西藥組比較，聯合組BDNF水平顯著升高、S100B水平顯著降低。結果表明益氣活血通絡方能有效減輕炎癥，降低氧化應激反應，促進神經功能恢復，保護腦組織。

綜上所述，益氣活血通絡方可降低急性腦梗死模型大鼠IL-8、TNF-α等炎癥因子水平，減輕炎性反應；能有效升高SOD水平并降低MDA水平，改善氧化應激反應；能緩解神經細胞凋亡，促進神經功能恢復，保護缺血損傷腦組織。