柔肝通絡湯對MCAO大鼠內源性干細胞表達的影響?

及曉夢 龍華君 劉 雨 張珊珊 帥文昊 楊 穎 伍大華

（1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南省中醫藥研究院附屬醫院，湖南 長沙410006）

缺血性腦血管病（ICD）約占全部腦血管疾病的60%～80%[1]。缺血性中風后阻礙腦組織血液供應情況，神經元因缺血缺氧發生炎癥水腫、變性以致壞死，最終導致中樞神經系統內信息傳遞功能、整合功能受到破壞甚至缺失。內源性神經干細胞（NSCs）主要分化為神經元、星形膠質細胞和少量少突膠質細胞，具有高度增殖、自我更新以維持自身數目恒定的能力，在神經發育和修復受損神經中發揮重要的作用[2-3]，被認為是修復損傷的基礎[4]。現已證明，在成年哺乳動物中，嗅球、大腦皮質、紋狀體、海馬齒狀回、室管膜下區、側腦室下區、脊髓、視網膜等部位均存在NSCs[5-6]。各項研究表明，成年人大腦內NSCs保持靜止狀態[7]，在缺血性中風等急性損傷因素的影響下，機體自身的NSCs可被激活，并在多種細胞因子、基因的調控下發生增殖、分化等，進而遷移至神經受損區域，替換損傷壞死的神經元，發揮其代償和修復功能[8-9]。

柔肝通絡湯是湖南省名老中醫周慎教授通過總結數十年的臨床經驗，所創制的治療中風的經驗方。臨床證明該方具有改善中風患者神經功能、減少后遺癥，降低致殘率、改善生活質量等作用[10]。故本實驗擬通過大腦中動脈阻塞（MCAO）所致缺血再灌注模型，檢測各組各時間點內大鼠腦組織BrdU、BrdU/NeuN、Br?dU/GFAP陽性細胞數，觀察柔肝通絡湯對缺血性腦損傷大鼠內源性神經干細胞增殖和分化的影響，探討其治療腦卒中的潛在作用途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 120只健康SD雄性大鼠，體質量250～300 g，鼠齡為8周，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SYXK（湘）2015-0003。飼養于湖南省中醫藥研究院中藥研究所SPF級實驗室，室溫18～20℃，濕度65%～70%，自由飲水進食。適應性進食1周后進行實驗。

1.2 試藥與儀器 柔肝通絡湯組方：制首烏15 g，桑椹15 g，枸杞子30 g，丹參30 g，葛根30 g，當歸尾10 g，赤芍10 g，地龍10 g，山楂10 g。藥材均購自湖南省中醫藥研究院附屬醫院，熬制成膏狀（含生藥2 g/mL）備用。10%水合氯醛、4%多聚甲醛、5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU粉末）（武漢BOSTER公司）、Anti-BrdU Mouse mAb、Anti-GFAP Rabbit pAb、Anti-NeuN Rabbit pAb、CY3標記驢抗兔IgG、Alexa488標記山羊抗小鼠IgG（武漢Servicebio公司）。RM2016病理切片機（上海徠卡儀器有限公司）、YD-A組織攤片機（浙江省金華市益迪醫療設備有限公司）、NIKON ECLIPSE TI-SR倒置熒光顯微鏡（日本尼康）、TYXH-II渦旋混合器（天悅電子）。

1.3 分組與給藥 120只大鼠隨機進行編號并分成4組，即空白組、假手術組、模型組、柔肝通絡湯組，根據缺血2 h再灌注后6 h、1 d、3 d、7 d、14 d分為5個亞組。各組大鼠數量均為6只。柔肝通絡湯組予柔肝通絡湯（2.8 g/100 g生藥含量[11]），其藥物劑量按大鼠14 mL/kg灌胃量用蒸餾水配制（當于50 kg成年人等效計量的2倍），分別按照5個時間點，每日2次灌胃直至大鼠處死。其余組用1.4 mL/100 g蒸餾水灌胃，不添加任何藥物。BrdU注射：將BrdU按照50 mg/kg的劑量，10 mg/mL的質量濃度溶于0.9%氯化鈉注射液中，每天腹腔注射2次，其中3 d組、7 d組及14 d組于手術后連續注射3 d，而6 h組、1 d組均在處死前3 d注射。

1.4 模型制備 手術前24 h禁食、不禁水。采用改良Longa法[12]制作大鼠MCAO模型。用10%水合氯醛（0.30 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠并將其固定在操作臺上。切開頸部正中部皮膚，依次剝離出右頸總動脈（CCA）、頸內動脈（ICA）、頸外動脈（ECA）。用線結扎右頸總動脈（CCA）近心端和頸外動脈（ECA），動脈夾夾住頸內動脈（ICA），在動脈夾和頸總動脈近心端結扎之間用眼科剪剪一“V”型小口，將線栓從CCA小口中插入，在分叉處沿著ICA方向向顱腦內上方走行，直至遇到阻力為止。當線栓插入深度約（18.5±0.5）mm時，說明線栓到達大腦前動脈，并成功阻斷大腦中動脈。然后扎緊CCA處備線，記錄大腦中動脈阻斷時間，消毒并縫合皮膚，外留10 mm線栓。于術后2 h輕輕拔出栓線約10 mm，即再灌注模型形成。術中溫度始終保持在27℃左右，100 W白熾燈照明維持肛溫37～38℃。假手術組大鼠術中操作同上述過程，線栓只插入10 mm左右，此深度不足以阻斷大腦中動脈。大鼠蘇醒后，按照缺血再灌注5個不同時間點，采用Longa[12]神經功能缺損評分法進行評分，評分1～3分為造模成功。

1.5 神經功能缺損評分 以再灌注6 h、1 d、3 d、7 d、14 d這5個時間點，按照Longa[12]神經功能缺損評分法進行評分。0分：無神經損傷癥狀。1分：不能完全伸展對側前爪。2分：向對側轉圈。3分：向對側傾倒。4分：不能自發行走，意識喪失。大鼠評分越高代表神經功能缺損越嚴重。0分和4分模型不符合實驗要求予以剔除。

1.6 標本采集與檢測 造模缺血2 h后，按再灌注6 h、1 d、3 d、7 d、14 d時間點取腦。步驟如下：用10%的水合氧醛（0.30 mL/l00 g）腹腔注射大鼠深度麻醉后將其固定在桌面，開胸，游離出心臟。用止血鉗夾住大鼠腹主動脈及下腔靜脈，經左心室插入灌流針并固定，切開右心耳，灌注0.9%氯化鈉注射直到大鼠肝肺兩臟和四肢變白，右心房流出澄清液體，需立即改換灌注4%多聚甲醛PBS 100 mL。斷頭取腦，將標本放置多聚甲醛中浸泡固定24 h后備用。采用免疫熒光雙標法檢測BrdU、BrdU/NeuN、BrdU/GFAP免疫陽性細胞。石蠟切片脫蠟至水，置于抗原修復液（pH9.0）中。PBS洗滌3次，每次5 min。加用3%BSA室溫封閉30 min。滴加鼠兔一抗，Anti-BrdU（1∶200稀釋）、Anti-GFAP（1∶500稀釋）、Anti-NeuN（1∶100稀釋），置于4℃濕盒內孵育過夜。加熒光二抗Cy3驢抗兔IgG（1∶300稀釋）、Alexa488標記山羊抗小鼠IgG，避光室溫孵育50 min。滴加DAPI染液，避光室溫孵化10 min。加入抗熒光淬滅封片劑封片。倒置熒光顯微鏡下觀察，每張切片選取5個400倍高倍鏡視野并采集圖像。采用計算機圖像分析系統軟件（Image-pro plus6.0）計數腦缺血再灌注損傷后各個時間點大腦皮質缺血區域BrdU、BrdU/NeuN、BrdU/GFAP陽性細胞。

1.7 統計學處理 采用SPSS24.0進行分析，所有計量資料以（±s）進行描述，采用多組間單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni法檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況 大鼠腦缺血再灌注后各個時間點的活動較空白組和假手術組減少，體質量減輕，飲食減少。假手術組術中及術后死亡2只，替補2只；模型組死亡5只，失敗4只，替補9只；柔肝通絡湯組死亡6只，失敗3只，替補9只。

2.2 各組大鼠神經功能缺損評分比較 見表1。空白組和假手術組大鼠神經功能缺損評分均為0分。與空白組和假手術組比較，造模后大鼠6 h、1 d、3 d、7 d、14 d的神經功能缺損評分顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，柔肝通絡湯大鼠6 h、1 d神經功能缺損評分無顯著差異（P＞0.05），3 d、7 d、14 d的神經功能缺損評分較模型組降低（P＜0.05）。

表1 各組大鼠不同時間點肢體神經功能缺損評分比較（分，±s）

表1 各組大鼠不同時間點肢體神經功能缺損評分比較（分，±s）

與同時間點的模型組比較，?P＜0.05；與空白組、假手術組同時間點比較，△P＜0.01

組別空白組假手術組模型組柔肝通絡湯組n 6 6 6 6 6 h 1 d 3 d 7 d 14 d 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3.000±0.000△2.667±0.817△2.833±0.408△2.667±0.516△2.333±0.516△1.333±0.516△2.167±0.408△1.167±0.408△2.000±0.632△1.000±0.000△

2.3 各組大鼠大腦皮質缺血區Brdu、Brdu/Neun、Brdu/GFAP鏡下表達比較 BrdU陽性細胞呈紅色（圖中顯示白色），代表增殖細胞，綠色（圖中顯示暗灰色）代表神經元和星形膠質細胞，BrdU/NeuN、BrdU/GFAP雙標陽性細胞均顯示呈橘紅色（圖中顯示淺灰色），代表新生的神經元和星形膠質細胞。見圖1～圖3。

圖3 BrdU/GFAP陽性細胞表達（400倍）

2.4 各組大鼠BrdU單標免疫陽性細胞數比較 見表2，圖1。空白組和假手術組在各時間點均可見一定量的BrdU陽性表達，但差異無統計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，柔肝通絡湯組大鼠在3、7、14 d的BrdU陽性細胞表達數增加（P＜0.05），尤以3、7 d更顯著（P＜0.01），在術后第7日BrdU陽性細胞數達到峰值，隨后呈下降趨勢，但仍高于模型組。

表2 各組大鼠不同時間點BrdU陽性細胞表達的影響比較（±s）

表2 各組大鼠不同時間點BrdU陽性細胞表達的影響比較（±s）

與同時間點空白組和假手術組比較，#P＜0.01；與同時間點的模型組比較，?P＜0.05；與本組術后其他時間點比較，△P＜0.01。下同

14 d 35.83±4.02 33.67±4.27 96.50±7.26#117.17±10.83#*組別空白組假手術組模型組柔肝通絡湯組n 6 6 6 6 6 h 34.33±4.27 34.67±1.97 36.83±4.40 39.17±4.54 1 d 35.17±2.40 35.83±4.02 55.17±6.77#65.67±12.80#3 d 33.33±2.16 34.50±6.34 74.00±9.10#94.17±9.47#*7 d 36.00±2.68 34.83±7.68 127.50±5.61#△141.17±6.91#*△

2.5 各組大鼠BrdU/NeuN雙標免疫陽性細胞數比較見表3，圖2。各時間點空白組、假手術組大腦皮質區均可見少量的BrdU/NeuN表達，但差異無統計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，柔肝通絡湯組在6 h、1 d的BrdU/NeuN免疫陽性細胞數均無顯著差異（P＞0.05），術后3、7、14 d的BrdU/NeuN免疫陽性細胞數均明顯增加（P＜0.05）。其中第3～7天增殖迅速，隨后增殖緩慢。

表3 各組大鼠不同時間點BrdU/NeuN陽性細胞表達比較（±s）

表3 各組大鼠不同時間點BrdU/NeuN陽性細胞表達比較（±s）

組別空白組假手術組模型組柔肝通絡湯組n 6 6 6 6 6 h 14.50±1.64 14.00±2.53 16.33±1.75 16.50±1.76 1 d 15.83±1.83 14.50±3.21 24.00±2.10#26.50±3.21#3 d 15.00±1.79 15.00±1.79 32.83±3.31#37.33±3.08#*7 d 15.67±3.20 14.17±2.14 43.67±2.58#△53.50±3.45#*△14 d 13.50±1.38 15.67±2.25 37.00±4.00#53.83±4.36#*

2.6 大鼠BrdU/GFAP雙標免疫陽性細胞數比較 見表4，圖3。各時間點空白組、假手術組均可見少量BrdU/GFAP免疫陽性細胞表達，但差異無統計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，柔肝通絡湯組大鼠在術后1、3、7、14 d的BrdU/GFAP免疫陽性細胞數均減少（P＜0.05），但仍高于空白組和假手術組。

表4 各組大鼠不同時間點BrdU/GFAP陽性細胞表達比較（±s）

表4 各組大鼠不同時間點BrdU/GFAP陽性細胞表達比較（±s）

組別空白組假手術組模型組柔肝通絡湯組n 6 6 6 6 6 h 21.17±3.92 21.33±3.32 23.00±3.52 21.17±3.66 1 d 21.00±2.10 21.17±2.64 30.83±3.49#26.00±2.61#*3 d 21.17±2.14 20.83±1.83 41.17±3.49#32.67±1.63#*7 d 22.17±1.83 22.67±3.01 58.67±3.39#△40.83±2.86#*△14 d 20.83±1.72 20.67±2.66 46.50±3.94#27.83±2.86#*

3 討論

BrdU是一種胸腺嘧啶核苷類似物，NSCs發生分裂增殖時，它能夠代替胸腺嘧啶（T）滲入正在復制的DNA分子中，利用抗BrdU單克隆抗體，經過ICC染色，顯示活性增殖細胞，用以標記腦內增殖細胞。既往研究證明，Brdu所標記的陽性細胞中，具有自我更新和分化能力的NSCs占據90%，剩余10%是沒有分化能力的神經祖母細胞[13]。所以采用BrdU標記的陽性細胞可表達NSCs增殖情況。

NeuN是一種表達在大多數神經元胞核和胞漿中的一種特異性蛋白質，是新生神經元的標記物；GFAP是一種中間絲蛋白，主要存在于星形膠質細胞內，是中樞神經系統星形膠質細胞的標志物[14]。神經元具有聯絡和整合輸入信息并傳遞信息的作用，是構成神經系統最基本的結構和功能單位[15]。研究證明，在發生急性損傷如缺血性中風時，可以激活內源性干細胞增殖分化為神經元、星形膠質細胞和少量少突膠質細胞，分化的新神經元能替代和修復受損的神經元，從而改善神經功能[16-17]。星形膠質細胞是腦組織膠質細胞中數量最多、具有重要功能的細胞。其不僅具有營養支持和保護神經元的作用，同時在維持突觸周圍環境穩態、參與信息傳遞等方面發揮功能[18]。但星形膠質細胞在促進神經元再生方面具有“雙重”作用，在缺血早期，通過抑制炎癥因子的擴散，促進神經再生，但在缺血后期，膠質細胞大量增殖重疊，形成膠質疤痕，形成不可逆性組織重構，不僅影響正常局部神經回路，還阻礙神經再生[19]。

缺血性腦血管疾病在中醫學屬“中風”范疇，本病起病急，變化快，臨床癥狀變化多端，多以突然神昏撲倒地、半身不遂、肢體麻木、口舌歪斜、言語不利，甚者神志不清等為主要表現。中風病位在腦，其主要致病因素歸結于風、火、痰、瘀、虛諸端，肝腎虧虛或氣血虧虛為其致病根本。周老認為中風之虛主要在于肝腎陰虛，中風之實主要歸于瘀血阻滯。方中制首烏為君藥，桑葚、枸杞二者同歸肝腎經，為臣藥，協助均藥滋肝補腎陰、養血益精。赤芍、丹參、當歸尾、葛根、地龍、山楂均為佐藥，共通活血散瘀通絡，全方共奏滋補肝腎、育陰息風、活血通絡之功效。研究表明，柔肝通絡湯經過多年臨床療效觀察，柔肝通絡湯對于改善中風患者肢體神經功能有顯著療效[11]。綜合以上實驗結果，說明柔肝通絡湯可以促進缺血性腦損傷后內源性干細胞的增殖分化為成熟神經元，抑制膠質細胞的過度增殖，從而促進神經再生。