腦栓通膠囊對急性腦梗死模型大鼠炎癥因子、MMP-9和TIMP-1表達及氧化應激指標的影響?

鄭玉蘭 徐 貞 李如珊 林創明 馬盛琴 劉云松

（廣東祈福醫院，廣東 廣州 511495）

急性腦梗死是因血栓導致腦動脈閉塞進而引起腦組織局部血液供應障礙，可導致不可逆局灶性腦損傷，其發病率高、致殘率高以及死亡率高[1]。相關研究發現，急性腦梗死患者在發生和發展中多伴有炎癥反應，氧化應激被認為是導致神經功能缺損的主要因素。近年研究發現，MMP-9/TIMP-1系統與腦梗死患者中血腦屏障損傷和修復密切相關[2]，可為缺血性腦血管病的治療提供新思路。急性腦梗死屬于中醫“中風”范疇，氣虛、瘀阻、血瘀是公認的中風病病因[3]。腦栓通膠囊具有活血通絡、祛風化痰之功效。本研究通過建立急性腦梗死大鼠模型，以探討腦栓通膠囊對急性腦梗死大鼠炎癥因子、MMP-9和TIMP-1表達及氧化應激指標的影響，旨在為探討腦栓通膠囊作用機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

60只SD大鼠，體質量（200±20）g，雌雄各半，購于上海邦耀生物科技有限公司。大鼠置于（23±2）℃室溫中，12 h/12 h晝夜節律，自由飲水進食，適應環境7 d后于9∶00～17∶00進行實驗。

1.2 試藥與儀器

腦栓通膠囊（主要成分：蒲黃、赤芍、郁金、天麻、漏蘆等；廣東華南藥業集團有限公司，國藥準字Z20040093），給藥劑量參照《藥理實驗方法學》[4]中人和動物體表面積折算的等效劑量比值表計算；尼莫地平片（拜耳醫藥保健公司，生產批號：L01984）。Anti-MMP9（Sigma公司），TIMP-1抗體（ab81282）（Abcam公司），β-Actin（SANTACRUZ公司），超敏ECL化學發光試劑盒（碧云天公司），Trizol試劑盒（武漢博士德生物工程公司）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH）以及過氧化氫酶（CAT）檢測試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）以及白介素-6（IL-6）ELISA試劑盒和DAB顯色試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司；C反應蛋白（CRP）試劑盒購于上海金穗生物科技有限公司，PBS緩沖液和二抗由碧云天生物技術研究所提供；其他試劑均為分析純購于天津市廣成化學試劑有限公司；氯化鈉注射液（批號：181203）由山東康寧藥業有限公司提供，實驗用水為超純水。TD5A-WS/TD5AWS型低速離心機（湖南湘儀離心機有限公司），164-5050型電泳儀（美國Bio-Rad公司），BX61型顯微鏡（日本OLYMPUS公司），Im?age-Pro Plus 6.0圖像分析系統（麥克奧迪實業集團有限公司），pH計（北京屹源電子科技有限公司），超低溫冰箱[冠森生物科技（上海）有限公司]，電子天平（上海良平儀器有限公司），控溫水浴箱GKC（上海蘇達實驗儀器有限公司）。

1.3 造模與分組

參考文獻[5]制備急性腦缺血大鼠模型，將模型組及用藥組（陽性組和實驗組）大鼠水合氯醛麻醉，俯臥固定于手術臺，采用改良線栓法制作腦缺血大鼠模型，即分離并充分暴露大鼠的頸總動脈、頸內動脈以及頸外動脈，對頸總動脈近端和頸外動脈進行結扎，用血管夾夾閉頸內動脈，在頸總動脈剪一切口，將線栓經頸總動脈送至頸內動脈至大腦中動脈起始處，阻斷血流2 h后將線栓取出恢復灌注。參照Zea Longa[6]法評分標準進行神經功能評分，1～3分表明造模成功。分組分籠飼養，不禁食水。假手術組大鼠僅用玻璃分針游離出雙側頸總動脈不做結扎處理。

1.4 給藥方法

造模成功后，假手術組自由飲水進食，模型組開始灌服純凈水，實驗組開始灌服腦栓通膠囊，劑量120 mg/kg，陽性組開始以10 mg/kg的劑量灌服尼莫地平。各組每天灌胃1次，連續7 d。

1.5 標本采集與檢測

1.5.1 神經功能評分 采用Bederson評分分級法，于術后7 d對各組大鼠進行神經行為學評分并記錄結果。采用改良NSS評分標準對各組大鼠神經功能進行評分（16分制），得數越高，損傷程度越重。

1.5.2 炎癥因子檢測 7 d后收集3 mL腹動脈血，離心，分離血清，ELISA法檢測TNF-α、IL-1β以及IL-6炎癥因子水平，采用免疫比濁法檢測CRP含量，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.5.3 MMP-9、TIMP-1表達檢測 進行神經功能缺損程度評分后，采用水合氯醛溶液麻醉大鼠，斷頭取腦，于-80℃條件下凍存，在研缽內研磨粉碎，組織勻漿器勻漿。1）采用RT-PCR法檢測MMP-9、TIMP-1基因表達，其中β-actin上游引物序列為5′-GAGGC CCAGAGCAAGAGAGGT-3′，下游引物序列為 5′-TTC ACGGTTGGCCTTAGGGTT-3′；MMP-3上游引物序列為5′-AAGGAGAGGCTGACATAATGA-3′，下游引物序列為 5′-ATCTGTCCATCGTTCATCATC-3′；TIMP-1 上游引物序列為 5′-GACCACCTTATACCAGCGTTA-3′，下游引物序列為5′-GTGCAAATTTCCGTTCCTTAA-3′。使用 Trizol試劑盒提取總 RNA，加入 20 μL DEPC水溶解，采用紫外分光光度計證實0.1 g瓊脂糖凝膠電泳中含有兩條帶（18 s和28 s）用于反轉錄的標本，校正每組總RNA濃度，加入181 μL Oligod（T），72 ℃條件下變性10 min，取出立即置于冰上2 min。后加入11.5 μL DEPC水，2.5 μL 5Xbuffer，0.5 μL dNTP Mix?ture，0.5 μL RNase，0.5 μL M-MLV，室溫下靜置10 min。然后42℃水浴條件下1 h，冰上放置2 min。放入熒光定量PCR儀中，采用25 μL反應體系，觀察熒光定量熔解度。2）采用Western blotting法檢測MMP-9、TIMP-1蛋白的表達，提取總蛋白質后根據BCA蛋白濃度測定試劑盒操作步驟測定蛋白質濃度。使用熒光成像儀觀察相關蛋白的表達，使用Image J分析軟件分析所得圖像中條帶的光密度值，以靶蛋白β-actin灰度比值作為蛋白的相對表達豐度。

1.5.4 氧化應激指標測定 取大鼠腦漿液，離心，取上清液，采用硫代巴比妥酸比色法檢測血清丙二醛（MDA）含量，采用黃嘌呤氧化酶法檢測血清超氧物歧化酶（SOD）含量，采用紫外吸收法測過氧化氫酶（CAT）含量，采用比色法檢測谷胱甘肽過氧化物酶（GSH），嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 各組大鼠神經功能評分和神經行為學評分比較

見表1。與假手術組比較，模型組大鼠的神經功能評分和神經行為學評分明顯高升高，具有顯著差異（P＜0.05）。給予藥物干預后，陽性組和實驗組大鼠的神經功能評分和神經行為學評分明顯低于模型組（P＜0.05），兩組比較亦有顯著性差異（P＜0.05）。

表1 各組大鼠神經功能評分和神經行為學評分比較（分，±s）

表1 各組大鼠神經功能評分和神經行為學評分比較（分，±s）

與假手術組比較，?P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與陽性組比較，△P＜0.05。下同

神經行為學評分00.00±00.00 5.72±1.12*3.28±0.49*#3.05±0.52*#△組別假手術組模型組陽性組實驗組n 15 15 15 15神經功能評分0.00±0.00 5.86±1.21*3.63±0.81*#3.12±0.76*#△

2.2 各組大鼠炎癥因子比較

見表2。與假手術組比較，模型組大鼠的TNF-α、CRP、IL-1β以及 IL-6水平明顯升高（P＜0.05）。給予藥物干預后，陽性組和實驗組大鼠的炎癥因子水平明顯降低（P＜0.05），兩組比較有顯著差異（P＜0.05）。

表2 各組大鼠炎癥因子比較（μg/mL，±s）

表2 各組大鼠炎癥因子比較（μg/mL，±s）

組別假手術組模型組陽性組實驗組n 15 15 15 15 TNF-α 39.89±6.16 54.75±7.08*47.09±7.14*#41.28±7.32*#△CRP 32.14±4.59 51.23±3.12*40.12±3.74*#35.47±5.26*#△IL-1β 4.53±0.67 6.72±0.85*4.66±0.54*#4.69±0.71*#△IL-6 21.12±2.67 30.47±3.86*23.57±3.45*#23.87±3.09*#△

2.3 各組大鼠MMP-9和TIMP-1表達比較

見表3，圖1。與假手術組比較，模型組大鼠的MMP-9基因表達和MMP-9蛋白表達的相對豐度值明顯升高，TIMP-1基因表達和TIMP-1蛋白表達的相對豐度值明顯降低，具有顯著差異（P＜0.05）。給予藥物干預后，陽性組和實驗組大鼠的MMP-9基因表達和MMP-9蛋白表達的相對豐度值明顯低于模型組，TIMP-1基因表達和TIMP-1蛋白表達的相對豐度值明顯高于模型組（P＜0.05），兩組比較亦有顯著差異（P＜0.05）。

表3 各組大鼠MMP-9和TIMP-1表達比較（±s）

表3 各組大鼠MMP-9和TIMP-1表達比較（±s）

組別假手術組（n=15）模型組（n=15）陽性組（n=15）實驗組（n=15）基因表達蛋白表達的相對豐度值基因表達蛋白表達的相對豐度值基因表達蛋白表達的相對豐度值基因表達蛋白表達的相對豐度值MMP-9 0.656±0.045 0.597±0.084 1.572±0.206*0.942±0.091*0.908±0.108*#0.734±0.041*#0.723±0.10*#▲0.617±0.037*#▲TIMP-1 10.471±1.716 0.743±0.094 8.037±1.038*0.483±0.027 9.053±1.101*#0.548±0.100*#9.721±1.526*#▲0.619±0.091*#▲

圖1 各組大鼠MMP-9、TIMP-1蛋白表達

2.4 各組大鼠氧化應激指標比較

見表4。與假手術組比較，模型組大鼠的MDA水平明顯升高，SOD、GSH以及CAT水平明顯降低，具有顯著差異（P＜0.05）。給予藥物干預后，陽性組和實驗組大鼠的MDA水平明顯低于模型組，SOD、GSH以及CAT水平明顯高于模型組（P＜0.05），兩組比較有顯著性差異（P＜0.05）。

表4 各組大鼠氧化應激指標比較（±s）

表4 各組大鼠氧化應激指標比較（±s）

組別假手術組模型組陽性組實驗組n 15 15 15 15 MDA（mmol/mL）5.27±1.13 10.81±2.53*7.24±1.34*#6.32±1.51*#△SOD（U/mL）180.81±20.27 116.68±15.46*142.85±21.32*#136.89±13.31*#△GSH（U/mg）46.07±2.57 18.63±1.84*34.53±0.78*#29.56±0.81*#△CAT（U/mg）5.67±1.08 1.93±0.65 3.19±0.36 2.50±0.21*#△

3 討論

急性腦梗死是一種炎癥相關性疾病[7-8]，腦缺血后存在炎癥反應，而炎癥反應釋放大量的氧自由基、一氧化氮、興奮性氨基酸等毒性物質，可明顯造成腦組織不可逆的損傷，可誘發神經細胞凋亡，加重腦損傷[9]。研究證實，TNF-α、IL-1β、IL-6以及CRP均參與急性腦梗死的發生發展過程。TNF-α是炎癥反應的起始因子，可誘導動脈粥樣硬化的形成，促進腦神經細胞凋亡[10]。IL-1β通過激活內皮細胞促使血栓形成，或增加誘導細胞間黏附分子表達，使大量中性粒細胞浸潤到腦組織，誘發炎性反應，是腦缺血損傷的病理生理基礎。CRP與低密度脂蛋白特異性結合后，可刺激黏附分子大量產生，進而損害血管內皮功能。

研究發現，MMP-9/TIMP-1與急性腦梗死患者腦梗死的梗死面積、出血轉化及預后密切相關[11-12]，是其損傷和修復的關鍵啟動因素。研究MMP的特殊抑制劑或提高內源性TIMP水平，開發具有調控MMP/TIMP平衡的治療方法，將為缺血性腦卒中的治療提供新的思路。MMPs作為金屬蛋白酶參與BBB完整性以及腦梗死溶栓后出血轉化，其中MMP-9與BBB完整性破壞的關系最為密切[13]。TIMP-1由巨噬細胞和結締組織細胞產生，其分泌受多種細胞因子影響，可對MMP-9產生抑制作用。

氧化應激是缺血性腦血管疾病中尤為重要的一個發病機制。急性腦梗死可使氧自由基大量產生，增加氧化應激反應，誘導神經毒性損傷導致神經元死亡[14]。SOD為清除氧自由基的特異性酶，是清除自由基連鎖反應的標志物[15]。MDA是細胞膜脂質過氧化產生的穩定代謝物。CAT是抗氧化酵素系統的重要一員，可發生過氧化氫的歧化，使細胞免于遭受H2O2的毒害[16]。GSH是一種含γ-酰胺鍵和巰基的三肽，與SOD一起參與細胞中抗氧化作用。

中醫認為急性局灶性腦缺血因痰瘀互結、腦脈不通所致，兼夾氣血、脾胃升降失調，治宜活血醒腦開竅。腦栓通膠囊由蒲黃、赤芍、郁金、天麻、漏蘆組成，具有活血通絡，祛風化痰之功效，用于風痰瘀血痹阻脈絡引起的缺血性中風病中經絡急性期和恢復期。方中蒲黃、赤芍化瘀止痛；郁金活血行氣、止痛解郁；天麻熄風止痙、平抑肝陽、祛風通絡；漏蘆清熱解毒散結，諸藥合用具有活血通絡，祛風化痰之功效。現代藥理學研究發現[17]，腦栓通膠囊可降低血瘀模型大鼠的全血黏度、全血還原黏度、血漿黏度，延長血栓形成時間，可有效抑制對結扎雙側頸總動脈致實驗性不完全缺血模型大鼠的腦血管通透性，改善大腦中動脈阻塞致局灶性腦缺血模型大鼠的神經癥狀，降低腦梗死范圍。

本研究結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠的神經功能評分和神經行為學評分、TNF-α、CRP、IL-1β以及IL-6水平、MMP-9基因表達和MMP-9蛋白表達的相對豐度值以及MDA水平明顯高升高，TIMP-1基因表達和TIMP-1蛋白表達的相對豐度值、SOD、GSH以及CAT水平明顯降低，具有顯著差異。藥物干預后，陽性組和實驗組大鼠的神經功能評分和神經行為學評分、炎癥因子、MMP-9基因表達和MMP-9蛋白表達的相對豐度值明顯低于模型組，TIMP-1基因表達和TIMP-1蛋白表達的相對豐度值、SOD、GSH以及CAT水平明顯高于模型組，兩組比較均有顯著差異。提示腦栓通膠囊能有效地降低急性腦梗死大鼠的神經功能評分和神經行為學評分，降低炎癥因子和自噬相關蛋白水平，減輕氧化應激反應。

綜上所述，腦栓通膠囊可有效地降低急性腦梗死模型大鼠炎癥因子水平，改善MMP-9和TIMP-1表達，減輕其氧化應激指標。