淀粉微粒和酪蛋白酸鈉協同穩定Pickering乳狀液性質

王 然，劉 穎，劉 洋,*，劉黎紅，蔡 勇，張春玉,3，溫慧穎

（1.長春職業技術學院食品與生物技術學院，吉林 長春 130033；2.吉林大學生物與農業工程學院，吉林 長春 130022；

3.東北師范大學生命科學學院，吉林 長春 130024）

乳狀液是一種以水包油或油包水形式穩定分散相的膠體分散系統[1]，在食品工業中具有重要的地位，近年來多被研究用于荷載生物活性物質，發揮著改善生物利用率、控制有效成分釋放以及延緩脂質氧化等方面的作用[2]。乳狀液是熱力學不穩定體系，易發生相分離以降低油水界面接觸面積并減少體系自由能，因此，油水界面組成成分和結構等界面性質是影響乳狀液穩定的主導因素。

乳化劑通過延緩或阻止脂肪球聚結以維持乳狀液體系的穩定性，其作用途徑主要包括降低體系油水界面張力、改善界面膜黏彈性、增加本體相（連續相）黏度、提供空間位阻以及提供靜電排斥作用等。傳統乳化劑（如蛋白質）由于其具備親水、親油雙重性質，所以能吸附到油水界面并形成界面膜，從而發揮增加界面面積、阻礙脂肪球聚結的作用。然而，由傳統乳化劑形成的界面膜易發生陳化現象，導致乳狀液發生物理性狀或化學成分等方面的不穩定變化[2]。顆粒作為新型乳化劑，由于其較高的表面能和油水雙重潤濕性質，能夠相對快速的達到油水界面；較高的解吸能則幫助顆粒不可逆地吸附到油水界面上，形成一道空間屏障，并能防止脂肪球聚結；同時，在連續相的顆粒能通過相互作用形成三維網狀結構，進而維持乳狀液的高物理穩定性；除此之外，由顆粒穩定的乳狀液能夠適應食品加工工序，在食品工業中具有廣闊的應用前景。

近年來，國內外學者大量報道利用蛋白質、碳水化合物和脂質等生物源顆粒穩定乳狀液的相關研究[3]。然而，利用生物源顆粒和傳統乳化劑共同維持食品乳狀液穩定方面的研究還鮮見報道。目前，傳統乳化劑應用廣泛，其在使用成本和乳化效果等方面仍具有一定優勢，其中，酪蛋白酸鈉是天然乳液主要成分酪蛋白的鈉鹽，對乳狀液的結構起著重要的作用。酪蛋白酸鈉主要是通過靜電排斥作用吸附到脂肪球表面，并且形成一層保護膜，進而發揮空間位阻效應，維持乳狀液中脂肪球的良好分散狀態[4]，已有研究將酪蛋白酸鈉用于制備納米乳液并探討其對乳液穩定性的影響[5]。在實際應用中，酪蛋白酸鈉通常需要搭配多種傳統乳化劑才能共同維持乳狀液的穩定作用。作為新型乳化劑，酯化改性玉米淀粉微粒具有來源廣泛、環境友好、可再生、可降解等特點，多用于制備食品級Pickering乳液或用于制備食品活性成分載體或藥物載體[6]。有研究表明，淀粉微粒與酪蛋白酸鈉的相互作用關系會對其所在液體體系的物理性質產生重要影響[7]。因此，本研究采用酯化改性淀粉微粒[8]和酪蛋白酸鈉協同穩定Pickering食品乳狀液，探討淀粉微粒和酪蛋白酸鈉的協同穩定機制及其對Pickering乳狀液界面性質及穩定性的影響，以期為Pickering食品乳狀液的開發和應用提供新思路和方法借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酪蛋白酸鈉（蛋白質量分數95%） 鄭州華峰食品科技有限公司；棕櫚油（融點39～41 ℃） 南海油脂工業有限公司；玉米油 九三糧油工業集團有限公司；羥丙基甲基纖維素（hydroxypropyl methylcellulose，HPMC）（食品級） 濟南云飛化工有限公司；玉米淀粉微粒（粒徑100～550 nm，水分4.8%） 實驗室自制（利用醇沉法結合辛烯基琥珀酸酐酯化反應制備玉米淀粉微粒[8]）；實驗所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

OCA20視頻光學接觸角測量儀 德國DataPhysics公司；BT-9300ST激光粒度分布儀 丹東百特儀器有限公司；AR500流變儀 美國TA儀器（上海）有限公司；RVDV-III黏度測定儀 美國博勒飛公司；ESFSL-500均質乳化機 上海儀馳實業有限公司；IX81熒光顯微鏡奧林巴斯（中國）有限公司；UV-2550紫外-可見分光光度計 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 酪蛋白酸鈉懸浮液與淀粉微粒懸浮液的制備

將酪蛋白酸鈉、淀粉微粒分別分散于去離子水中，以60 r/min的速率攪拌2 h，配制成質量濃度分別為10 g/100 mL和0.2 g/100 mL的懸浮液。將上述2 種懸浮液進行稀釋并混合攪拌1 h，配制成酪蛋白酸鈉與不同質量濃度淀粉微粒的混合懸浮液樣品，樣品中酪蛋白酸鈉質量濃度均為1 g/100 mL、淀粉微粒質量濃度分別為0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 g/100 mL。

1.3.2 Pickering乳狀液的制備

Pickering乳狀液由18 g/100 mL棕櫚油、1 g/100 mL酪蛋白酸鈉、1 g/100 mL HPMC以及0～0.06 g/100 mL淀粉微粒調配而成。將棕櫚油作為油相加熱至60 ℃，再將酪蛋白酸鈉、HPMC、淀粉微粒和去離子水作為水相倒入油相中，以600 r/min的速率攪拌30 min，再利用均質乳化機以10 000 r/min的速率對樣品進行均質處理5 min，制成Pickering乳狀液。將乳狀液樣品置于25 ℃水浴中冷卻，并用帶蓋樣品瓶封裝，于4 ℃貯存24 h待測[9]。

1.3.3 酪蛋白酸鈉-淀粉微粒混合液流體動力學直徑及Zeta電位的測定

采用配置納米激光粒度儀的激光多普勒測速系統以及動態光衍射技術，分別研究質量濃度0～0.06 g/100 mL淀粉微粒對酪蛋白酸鈉-淀粉微粒混合液的流體動力學直徑和Zeta電位的影響[10]。將乳狀液樣品用去離子水稀釋至蛋白質質量濃度1.0 mg/mL。取1 mL稀釋樣品分別注入透明的一次性粒徑檢測樣品池和Zeta電位檢測樣品池，待測樣品中不能有氣泡，檢測前平衡時間設置為1 min。對每個乳狀液樣品進行3 次檢測，檢測結果取平均值。

1.3.4 乳滴尺寸及分布測定

參照Zhao Qiangzhong等[11]方法，利用激光粒度分布儀檢測Pickering乳狀液中乳滴尺寸及分布情況。分散相的折射指數和吸收指數分別設置為1.414和0.001，連續相的折射指數設置為1.330。在樣品檢測池中，先用去離子水將樣品稀釋1 000 倍，然后進行乳滴尺寸及分布檢測，得到表面積平均直徑D[3,2]和體積平均直徑D[4,3]。

1.3.5 界面張力測定

利用接觸角測定儀檢測不同樣品的接觸角，并且利用Young’s方程計算得到界面張力。采用液滴法測定淀粉微粒和酪蛋白酸鈉混合液與固態油脂的靜態接觸角，測量范圍為0°～180°。由儀器控制帶有毛細針頭的微量進樣器，設置測定用液量為2 μL，每個樣品至少在固態油脂表面取5 個點進行檢測，測量結果分別去掉最大值和最小值，取剩余3 個數值的平均值[12]。

1.3.6 界面蛋白濃度測定

參照Hu Hongyan等[13]方法并適當修改。將Pickering乳狀液樣品20 g置于50 mL離心管中，10 000 r/min離心30 min。在離心力的作用下，未乳化的油脂密度最小，會浮到乳狀液的表面形成油脂層，其次是被乳化的油脂形成乳化層，而水相的密度最大。離心后，將裝有樣品的離心管平穩的移動到4 ℃環境下，靜置20 min，然后用鋁制藥勺將乳狀液上層凝固的油脂移除。采用凱氏定氮法[14]測定乳化層中界面蛋白的濃度，利用乳滴尺寸及分布數據計算界面蛋白濃度[15]，如式（1）所示。

式中：Γ為界面蛋白濃度/（mg/m2）；MP為乳化層中蛋白質量/g；ME為乳化層質量/g；A為乳滴比表面積/（m2/g）。

1.3.7 脂肪部分聚結率測定

準確稱取油紅O色素0.015 g分散于玉米油1 000 g中，在室溫（25 ℃）下，以40 r/min的速率攪拌12 h，制成油紅O溶液。將Pickering乳狀液與油紅O溶液以2∶1的體積比混合均勻，置于20 mL離心管中，10 000 r/min離心30 min。移取乳狀液樣品上層紅色油液至比色皿中，以玉米油為空白樣品，利用紫外-可見分光光度計在520 nm波長下檢測上層油液的吸光度[10]。Pickering乳狀液中部分聚結的脂肪含量會改變油紅O溶液的吸光度，因此可以計算出乳狀液中脂肪部分聚結率，即游離脂肪含量占全部脂肪含量的比例，如式（2）所示：

式中：φ為脂肪部分聚結率/%；MO為樣品中油紅O溶液的質量/g；ME為樣品中Pickering乳狀液的質量/g；A1為油紅O溶液吸光度；A2為離心后上層紅色油液吸光度；φ為Pickering乳狀液中油脂的質量濃度/（g/100 mL）。

1.3.8 流變學特性測定[16]

利用應力控制型流變儀對Pickering乳狀液樣品的流變學特性進行檢測，儀器配制直徑40 mm鋁制平行板夾具，平行板夾具間隙1 000 μm，并且配備溫度控制系統，確保所有樣品的檢測溫度相同并保持在25 ℃，檢測前的平衡時間為3 min。通過流變學參數剪切速率及表觀黏度，對含有不同質量濃度淀粉微粒的Pickering乳狀液樣品的流變學特性進行研究。

1.3.9 乳液的微觀結構[17]

取Pickering乳狀液樣品1 mL，滴加到潔凈載玻片中央，加蓋蓋玻片，置于顯微鏡載物臺上，用40 倍光學顯微鏡進行觀察，利用儀器自帶軟件Simple PCI獲得乳狀液顯微結構圖像。

1.4 數據統計

2 結果與分析

2.1 淀粉微粒質量濃度對酪蛋白酸鈉-淀粉微粒混合液流體動力學直徑及Zeta電位的影響

圖1 淀粉微粒質量濃度對酪蛋白酸鈉-淀粉微粒混合液流體動力學直徑及Zeta電位的影響Fig. 1 Effect of starch particle concentration on hydrodynamic diameter and zeta potential of sodium caseinate-starch particle mixture

由圖1可知，淀粉微粒質量濃度由0 g/100 mL增加至0.06 g/100 mL，混合液流體動力學直徑由159.30 nm增加至217.50 nm。在pH值中性條件下，淀粉微粒和酪蛋白酸鈉均帶有負電荷，易發生靜電排斥作用，導致淀粉微粒和酪蛋白酸鈉之間的熱力學不相容性，進而引發混合液流體動力學直徑增大[10]。

表面電荷密度的變化情況能有效反映酪蛋白酸鈉和淀粉微粒兩者的靜電相互作用關系。如圖1所示，在pH值中性條件下，不含淀粉微粒的酪蛋白酸鈉檢測液的Zeta電位為-19 mV；隨著淀粉微粒質量濃度的增加，混合液的Zeta電位負電荷數呈現不同幅度的下降趨勢；當淀粉微粒質量濃度增加至0.06 g/100 mL時，混合液的Zeta電位為-14 mV。這表明淀粉微粒與酪蛋白酸鈉之間存在的靜電相互作用是導致混合液Zeta電位負電荷數下降的主要原因。Ching等[18]研究表明，在中性條件下，酪蛋白酸鈉所帶的負電荷多于顆粒所帶的負電荷，因此混合液所帶電荷受酪蛋白酸鈉主導，酪蛋白酸鈉和顆粒之間具有較強的靜電排斥作用，進而阻止復合物的形成。Consoli等[19]研究認為由于麥芽糊精等碳水化合物所帶的負電荷極少，在濕熱條件下，酪蛋白酸鈉與麥芽糊精等碳水化合物反應體系的負電荷變化主要受酪蛋白酸鈉影響。本實驗前期研究中得出淀粉微粒所帶負電荷-25 mV[8]，多于酪蛋白酸鈉所帶負電荷數，結合Ching[18]和Consoli[19]等研究結果，推斷本實驗中酪蛋白酸鈉與淀粉微粒混合液所帶負電荷主要受淀粉微粒主導，并且兩者之間產生一定的靜電排斥作用。

2.2 淀粉微粒質量濃度對酪蛋白酸鈉-淀粉微粒混合液界面張力的影響

圖2 淀粉微粒質量濃度對酪蛋白酸鈉-淀粉微粒混合液接觸角及界面張力的影響Fig. 2 Effect of starch particle concentration on contact angle and interfacial tension of sodium caseinate-starch particle mixture

界面張力是指兩相界面之間存在的分子受到不同分子力場作用，由于界面不是絕對的平整、均勻，進而界面的受力作用不均勻而產生的結果[20]。由圖2可知，所有樣品的接觸角均在0°～90°范圍內，說明混合液可以潤濕油脂；接觸角越小，說明混合液對油脂的潤濕性越好。隨著淀粉微粒質量濃度由0 g/100 mL增加至0.04 g/100 mL時，界面張力由25.66 mN/m下降至18.54 mN/m，這可能是由于淀粉微粒促進了酪蛋白酸鈉的界面活性，進而降低了界面張力，提高了乳液的穩定性[21]。當淀粉微粒質量濃度由0.04 g/100 mL增加至0.06 g/100 mL時，界面張力由18.54 mN/m增加至19.96 mN/m，表明淀粉微粒超過一定濃度反而對酪蛋白酸鈉的界面活性產生不利影響。其可能原因是淀粉微粒質量濃度增加導致混合液流體動力學直徑增大（圖1），進而導致酪蛋白酸鈉界面吸附速率下降，界面張力增加；同時，過量的淀粉微粒與酪蛋白酸鈉之間可能存在競爭吸附，這也是導致界面張力增加的主要因素。除此之外，Li Yaoxin等[22]研究表明表面活性劑不僅能夠阻止蛋白質的界面吸附，還能使已經吸附到油水界面的蛋白質發生解吸附，這也可能是淀粉微粒增大到一定程度后，界面張力增加的原因之一。

2.3 淀粉微粒質量濃度對Pickering乳狀液粒度的影響

圖3 淀粉微粒質量濃度對Pickering乳狀液粒度的影響Fig. 3 Effect of starch particle concentration on particle size of Pickering emulsions

由圖3可知，未添加淀粉微粒乳狀液的D[3,2]值和D[4,3]值分別為4.04 μm和2.13 μm；添加0.01 g/100 mL淀粉微粒的乳狀液，其D[3,2]值和D[4,3]值均小于未添加的樣品。當淀粉微粒質量濃度從0.01 g/100 mL增加至0.06 g/100 mL時，乳狀液的D[3,2]值和D[4,3]值均呈現先降低后升高的趨勢，在0.04 g/100 mL時，乳狀液的D[3,2]值和D[4,3]值均達到最小，分別為3.50 μm和1.97 μm。本研究中，淀粉微粒對Pickering乳狀液的D[3,2]值和D[4,3]值產生了明顯的影響。相關研究表明，在低離子濃度和體系pH值遠離等電點條件下，酪蛋白酸鈉主要通過靜電斥力維持乳液穩定性[18]；當在乳狀液中添加淀粉微粒時，適量的淀粉微粒可以吸附到酪蛋白酸鈉的表面，與酪蛋白酸鈉產生協同作用，促進其在油水界面的平衡；當添加過多的淀粉微粒，淀粉微粒會包埋酪蛋白酸鈉分子或者與酪蛋白酸鈉在油水界面上產生競爭吸附，進而導致乳狀液不穩定，發生D[3,2]值和D[4,3]值增加的現象[23]。Hu Hongyan等[13]研究發現再生纖維素顆粒的添加量對Pickering乳狀液穩定性有顯著影響，與本實驗結果一致。

2.4 淀粉微粒質量濃度對Pickering乳狀液界面蛋白濃度的影響

本研究制備的Pickering乳狀液，在乳化過程中，酪蛋白酸鈉從水相吸附到脂肪球表面，防止小脂肪球聚集和大脂肪球的產生，進而維持乳狀液的穩定性。如圖4所示，未添加淀粉微粒的樣品，其乳狀液體系界面蛋白濃度最低（2.08 mg/m2）；當淀粉微粒質量濃度從0.01 g/100 mL增加至0.04 g/100 mL時，乳狀液體系界面蛋白濃度呈現上升趨勢，并在淀粉微粒質量濃度為0.04 g/100 mL時達到最大（3.90 mg/m2）；然而，當淀粉微粒質量濃度從0.04 g/100 mL增加至0.06 g/100 mL時，體系界面蛋白含量由3.90 mg/m2下降至3.40 mg/m2，表明淀粉微粒與界面吸附蛋白發生協同吸附作用或競爭吸附作用，進而影響乳狀液的穩定性[5]。實驗結果進一步說明，適量的淀粉微粒有助于提高油水界面酪蛋白酸鈉的濃度，對酪蛋白酸鈉的界面活性具有促進作用，然而當淀粉微粒質量濃度超過一定范圍時，大量的淀粉微粒可能會包埋酪蛋白酸鈉分子，導致酪蛋白酸鈉表面活性降低，進而表現為油水界面酪蛋白酸鈉濃度下降[24-25]。

圖4 淀粉微粒質量濃度對Pickering乳狀液界面蛋白濃度的影響Fig. 4 Effect of starch particle concentration on surface protein concentration of Pickering emulsions

2.5 淀粉微粒質量濃度對Pickering乳狀液脂肪部分聚結程度的影響

乳析是乳狀液不穩定的主要形式之一，主要表現為脂肪球上浮。在乳狀液體系中，脂肪球的上浮速率與其直徑呈正比。乳狀液中分布著大量的小脂肪球，小脂肪球相互靠近發生黏結或相互碰撞導致脂肪球膜破裂，脂肪分子流出而發生聚結，產生大脂肪球。因此，脂肪球的黏結或聚結均可能導致乳析，進而影響乳狀液的穩定性。Moens[26]和Petrut[27]等研究發現，乳液體系界面的組成成分及成分含量對脂肪部分聚結率起著至關重要的作用。

本實驗中淀粉微粒能夠提高乳狀液連續相的黏度和分散相的分散程度，從而降低因脂肪球聚結而導致的乳狀液體系不穩定現象。如圖5所示，未添加淀粉微粒樣品的乳狀液體系脂肪部分聚結率為6.31%；當淀粉微粒質量濃度從0.01 g/100 mL增加至0.06 g/100 mL時，乳狀液體系的脂肪部分聚結率呈現先升高再降低的趨勢；當淀粉微粒質量濃度為0.04 g/100 mL時，乳狀液體系的脂肪部分聚結率達到最大（7.98%），與2.3節研究結果一致。淀粉微粒穩定乳狀液的效果受淀粉微粒質量濃度的影響，當淀粉微粒質量濃度高于某一臨界值（0.04 g/100 mL）時，淀粉微粒與酪蛋白酸鈉之間的關系由界面協同吸附作用轉變成界面競爭吸附作用，這會增加乳狀液體系脂肪球的聚集，進而導致脂肪部分聚結率降低。

圖5 淀粉微粒質量濃度對Pickering乳狀液脂肪部分聚結率的影響Fig. 5 Effect of starch particle concentration on fat partial coalescence rate of Pickering emulsions

2.6 淀粉微粒質量濃度對Pickering乳狀液流變學特性的影響

圖6 淀粉微粒質量濃度對Pickering乳狀液流變學特性的影響Fig. 6 Effect of starch particle concentration on rheological behavior of Pickering emulsions

如圖6所示，隨著淀粉微粒質量濃度的增加，乳狀液的黏度呈現升高的趨勢。當剪切速率從0.02 s-1增加至200 s-1，所有乳狀液樣品的黏度呈現下降的趨勢，表現為非牛頓流體剪切稀釋特性，這是由于剪切應力使乳狀液中各成分分子發生拉伸，并且不同成分分子之間發生解纏作用，導致乳狀液體系流動阻力減小，表現為黏度降低[28]。在乳狀液體系中，提高淀粉微粒質量濃度能夠促使淀粉分子纏結率增加，阻礙乳狀液的流動，導致乳狀液黏度增加。Tzoumaki等[29]研究甲殼素納米晶穩定的水包油乳狀液的流變學特性發現，當剪切速率小于200 s-1時，乳狀液的黏度與甲殼素納米晶的濃度呈正比；裴亞瓊[30]研究發現在低剪切速率下，乳液體系的黏度與淀粉微粒質量濃度呈正比，均與本實驗結果一致。

2.7 不同淀粉微粒質量濃度Pickering乳狀液的顯微結構

如圖7所示，未添加淀粉微粒的乳狀液樣品中分布著大量的大脂肪球，在顯微鏡視野中，最大的脂肪球直徑為36.86 μm；隨著淀粉微粒的添加，乳狀液樣品中大脂肪球的數量呈現先減少后增大的趨勢，當時，乳狀液樣品中的脂肪球直徑發生大幅度減小，最大脂肪球直徑僅為4.11 μm。這表明低濃度淀粉微粒對酪蛋白酸鈉的界面活性起到促進作用，并且幫助酪蛋白酸鈉有效的吸附到油水界面上阻止脂肪球的聚結，且0.04 g/100 mL時淀粉微粒作用效果最好。

圖7 不同淀粉微粒質量濃度的Pickering乳狀液樣品及其光學顯微鏡觀察圖Fig. 7 Optical microscopic images of Pickering emulsions with various concentrations of starch particles

3 結 論

本實驗采用淀粉微粒和酪蛋白酸鈉協同穩定Pickering食品乳狀液，通過調節淀粉微粒質量濃度，改變酪蛋白酸鈉的界面吸附活性。結果表明，Pickering乳狀液的穩定性受淀粉微粒質量濃度的影響。在淀粉微粒質量濃度由0 g/100 mL增加至0.06 g/100 mL的過程中，Pickering乳狀液的粒度、分散相脂肪球直徑均呈現先下降再升高的趨勢，而體系界面蛋白濃度和脂肪部分聚結率則呈現先升高再下降的趨勢；淀粉微粒與酪蛋白酸鈉之間存在靜電相互作用，隨著淀粉微粒質量濃度增加，酪蛋白酸鈉與淀粉微粒混合液流體動力學直徑增大，體系負電荷數減少，界面張力呈現先下降再升高的趨勢；當淀粉微粒質量濃度為0.04 g/100 mL時，Pickering乳狀液的粒度、分散相脂肪球直徑、體系界面張力最小，體系界面蛋白濃度和脂肪部分聚結率最高。因此推斷，當淀粉微粒質量濃度為0.04 g/100 mL時，其與酪蛋白酸鈉維持的Pickering乳狀液具有較強穩定性。