適應性進化提高淀粉酶產色鏈霉菌T17自發酸脅迫抗性的生理機制

任喜東，于 超，王晨瑩，劉新利,*

（1.齊魯工業大學（山東省科學院）生物基材料與綠色造紙國家重點實驗室，山東 濟南 250353；2.齊魯工業大學（山東省科學院）山東省微生物工程重點實驗室，山東 濟南 250353；3.齊魯工業大學（山東省科學院）食品科學與工程學院，山東 濟南 250353）

ε-聚賴氨酸（ε-poly-L-lysine，ε-PL）是一種由25～35個L-賴氨酸通過ε-氨基和α-羧基之間的酰胺鍵連接而成的同型氨基酸聚合物，具有熱穩定性好、水溶性強、安全性高及抑菌譜廣等優點，在日本、韓國及美國被廣泛用于食品防腐[1-3]。目前，ε-PL的產生菌主要為鏈霉菌，其最適的生長pH值偏中性[4]。然而，在ε-PL的生物合成過程中產生菌則面臨著自發酸脅迫（微生物在發酵過程中自發形成的酸性物質對菌體造成的酸脅迫）：隨著發酵的進行，環境pH值最終自發下降到3.0左右；而且，ε-PL合成的最適pH值（pH 4.0）對產生菌而言也是一種酸脅迫環境[3-5]。酸脅迫會引起胞內pH值（pHi）的下降，導致一些對酸敏感的酶失活，造成細胞膜和胞內大分子的結構損傷，最終引起細胞死亡[6]。因此，ε-PL產生菌對自發酸脅迫具有一定的耐受性。

目前，關于革蘭氏陽性菌對酸脅迫耐受機制的研究主要集中于乳酸菌和蠟樣芽胞桿菌等，研究表明，胞外堿性物質的合成、胞內質子（H+）的去除、細胞膜組分的改變、休克蛋白和分子伴侶的合成、轉錄調控因子的表達以及代謝途徑的改變等都能夠提高菌株的酸耐受能力[6]。然而，在同為革蘭氏陽性菌的鏈霉菌中相關研究報道較少。前期分別對Streptomyces albulus M-Z18在pH 5.0、4.0和pH 3.0分批發酵過程中細胞壁、細胞膜、胞內微環境以及全局基因轉錄水平的研究發現，細胞通過協同方式維持酸性pH值條件下細胞壁和細胞膜的正常功能、pHi值的動態平衡以及DNA和RNA的穩定；更為重要的是，隨著pH值的下降，ε-PL合成酶的轉錄水平逐漸升高，pH 3.0時ε-PL合成酶的轉錄水平相比pH 5.0時上調35.75 倍[7]。此外，在ε-PL的發酵過程中人為引入酸性pH值沖擊（短時pH 3.0脅迫），補料-分批發酵中ε-PL產量達到54.70 g/L，較對照提高了52.50%[3]。考慮到ε-PL是一種堿性的氨基酸聚合物（等電點為9.0左右），其側鏈的多NH2結構能夠在酸性條件下結合胞外游離的H+。由此推測，合成ε-PL也是產生菌應對自發酸脅迫的一種方式[7]。因此，提高ε-PL產生菌的耐酸能力并解析其如何在自發酸脅迫條件下生存，對于豐富鏈霉菌的酸脅迫耐受機制以及提高ε-PL的產量至關重要。

適應性進化，是一種研究微生物在特定環境條件下進化過程的有效方法，通過將微生物置于一定的環境壓力下，經過長期的馴化，獲得具有特定生理功能的突變菌株[8]，廣泛應用于篩選具有抗脅迫[9]、抗藥性[10]的微生物以及提高代謝產物的產量[11]等。本研究以1 株ε-PL產生菌淀粉酶產色鏈霉菌（Streptomyces diastatochromogenes）T17為原始菌株，利用酸性適應性進化的方法篩選得到3 株進化菌株，從耐酸能力、細胞膜以及胞內微環境等水平比較原始菌株和進化菌株之間的差異，分析適應性進化提高S. diastatochromogenes T17應對自發酸脅迫能力的生理機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

利用雙層瓊脂顯色法[12]從土壤中篩選得到1 株野生ε-PL產生菌株S. diastatochromogenes T17，通過酸性適應性進化的方法，篩選得到3 株進化菌株S. diastatochromogenes AE44、S. diastatochromogenes AE51和S. diastatochromogenes AE56。均保藏于齊魯工業大學生物工程學院生物制藥工程研究所。

1.1.2 試劑

2’,7’-雙-(2-羧乙基)-5-(-6)-羧基熒光素-乙酰氧基甲酯（2’,7’-bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein,acetoxymethyl ester，BCECF AM） 碧云天生物技術研究所；H+-ATPase試劑盒（細菌） 上海杰美基因醫藥科技有限公司；Super-Bradford蛋白定量試劑盒 北京康為世紀生物科技有限公司。

1.1.3 培養基

種子和發酵培養基（M3G）：葡萄糖50 g/L，酵母粉5.0 g/L，(NH4)2SO410 g/L，KH2PO4·2H2O 1.4 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，K2HPO4·2H2O 0.8 g/L，FeSO4·7H2O 0.03 g/L，ZnSO4·7H2O 0.03 g/L，用1 mol/L NaOH或H2SO4溶液調節pH值至設定值，115 ℃滅菌15 min。如果配制M3G固體培養基，則添加20 g/L的瓊脂。

1.2 儀器與設備

L-20AT高效液相色譜儀 日本Shimadzu公司；L-8900全自動氨基酸分析儀 日本Hitachi公司；Trace1310 ISQ氣相色譜-質譜聯用儀 美國Thermo Fisher公司；JEM-1200EX透射電子顯微鏡 日本電子株式會社；VCX800超聲波破碎儀 美國Sonics公司；Synergy NEO2多功能酶標儀 美國BioTek公司。

1.3 方法

1.3.1 種子培養

取兩環生長成熟的孢子接種到裝有50 mL M3G培養基（初始pH 6.8）的300 mL錐形瓶中（孢子濃度約為2×105個/mL），在30 ℃、200 r/min振蕩培養24 h作為種子液。

1.3.2 酸性適應性進化

以2%的接種量將培養24 h的S. diastatochromogenes T17種子液接種至初始pH 4.0的M3G培養基中，30 ℃、200 r/min振蕩培養4 d（發酵2 d后pH值即降到3.1左右，隨后保持不變），再以2%的接種量轉接至新鮮的相同培養基中。如此不斷重復，連續轉接70 d。在進化的不同時期，挑選在pH 4.0的M3G固體平板上生長快速、產孢子能力強的菌株，即為耐酸能力提高的進化菌株。

1.3.3 酸脅迫生長性能測定

取培養24 h的原始菌株和進化菌株種子液，經梯度稀釋（100、10-1、10-2、10-3）后，點種于不同pH值（5.0、4.5、4.0）的M3G平板上，30 ℃靜置培養4 d，觀測菌落生長情況；取2 mL培養24 h的種子液接種到裝有50 mL M3G培養基（初始pH 4.0）的300 mL錐形瓶中，置于搖床中30 ℃、200 r/min培養96 h，測定菌體干質量。

1.3.4 自發酸脅迫實驗

取2 mL培養24 h的原始菌株和進化菌株種子液接種到裝有50 mL M3G培養基（初始pH 6.8）的300 mL錐形瓶中，置于搖床中30 ℃、200 r/min培養48 h，分別在第0、48小時取樣測定相關生理參數。

1.3.5 pHi值測定

取不同自發酸脅迫時間（0 h和48 h）的原始菌株和進化菌株，用50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）離心洗滌菌體3 次后（4 500×g，10 min），冰水浴超聲破碎菌絲體（功率480 W，破碎2 s、停2 s，5 min），離心收集破碎菌絲的懸浮液（600×g，4 min），按照Breeuwer等[14]報道的方法，加入BCECF AM反應，分別測定菌絲懸浮液的熒光強度Itotal和離心上清液（10 000×g，10 min）的熒光強度Ifiltrate。激發波長為490 nm和440 nm，發射波長為525 nm，測定體系為200 μL，縫隙寬度為9 nm。按照下式計算總的熒光強度I。再根據lgI的值由標準曲線計算pHi值。

式中：I490nmtotal、I440nmtotal分別為菌絲懸浮液在490、440 nm激發波長下的熒光強度；I490nmfiltrate、I440nmfiltrate分別為離心上清液在490、440 nm激發波長下的熒光強度。

1.3.6 胞內ATP測定

胞內ATP測定的方法參照Cichna等[13]，并稍作改動。發酵液4 500×g離心5 min棄去上清液，重懸于0.5 mol/L HClO4溶液（0 ℃）中以阻止菌體代謝。冰水浴超聲破碎菌體（功率480 W，破2 s停2 s，10 min），經12 000×g離心20 min，上清液過0.22 μm的濾膜后于高效液相色譜測定。

色譜條件：Agilent Zorbax SB-AQLAChrom C18-AQ色譜柱（250 mm×4.6 mm）；檢測波長254 nm；柱溫25 ℃；流動相5%乙腈、95% Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液（pH 7.0，0.2 mol/L）以及四丁基溴化銨（10 mmol/L）；流速1.0 mL/min；進樣體積10 μL。

1.3.7 H+-ATPase活性測定

根據H+-ATPase試劑盒提供的方法測定。酶活性單位定義：能夠在1 min內將1 μmol的NADH氧化所用的酶量為1 U。

1.3.8 胞內氨基酸含量測定

取750 μL發酵液于1.5 mL離心管中，用超純水離心洗滌3 次（8 000×g，60 s），加入750 μL的10 g/100 mL三氯乙酸溶液，37 ℃水浴10 min，然后放入沸水中煮沸30 min，12 000×g離心10 min后上清液于氨基酸分析儀測定。

1.3.9 細胞膜脂肪酸含量測定

參照Sasser[15]的方法，發酵液離心棄去上清液（4 500×g，5 min），下層菌體用生理鹽水（0.9%NaCl）洗滌2 次，順序經過皂化、甲基化、提取及堿洗后，取上層有機相利用氣質聯用色譜分析脂肪酸成分。

氣相色譜條件：TG-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：80 ℃保持1 min，以10 ℃/min的速率升溫至200 ℃，繼續以5 ℃/min的速率升溫至250 ℃，最后以2 ℃/min的速率升到270 ℃，保持3 min；進樣口溫度290 ℃；載氣流速1.2 mL/min；不分流進樣，開閥時間1 min。

質譜條件：電子電離源：電子能量70 eV；傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度280 ℃；溶劑延遲時間5 min；質量掃描范圍m/z 30～400。

1.3.10 蛋白含量測定

采用Super-Bradford蛋白定量試劑盒測定。樣品采用生理鹽水（0.9% NaCl）適當稀釋，在595 nm波長處測定吸光度。

1.3.11 菌體干質量測定

取10 mL發酵液，4 500×g離心10 min棄去上清液，經預先稱質量的濾紙過濾，105 ℃烘干至質量恒定后用于測量。

1.4 統計學分析

數據分析采用費舍爾最小顯著差異法，P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 適應性進化對酸脅迫下菌體生長性能的影響

圖1 酸脅迫條件下不同菌株的生長情況Fig. 1 Growth performance of strains under acidic stress

如圖1a所示，4 株菌在pH 5.0、4.5和4.0的M3G固體平板上的菌落生長和孢子成熟情況各不相同。雖然4 株菌在pH 5.0平板上的菌落大小相似，但是3 株進化菌株的菌落顏色呈褐色，而原始菌株的菌落顏色較淺，這說明進化菌株即使在pH 5.0條件下也能正常產孢子，而原始菌株則由于受到酸脅迫影響孢子的生成；進化菌株在pH 4.5平板上的生長情況比原始菌株更好，在稀釋倍數為10-3時可以明顯觀察到；在pH 4.0的環境中生長時，由于受到的酸脅迫更加強烈，4 株菌的生長受到明顯的限制，菌體生長緩慢且沒有孢子產生，但仍然可以看出進化菌株的菌落較原始菌株大。如圖1b所示，在pH 4.0的M3G液體培養基中生長96 h后，進化菌株AE44、AE51和AE56的菌體干質量分別為（0.33±0.02）、（0.35±0.02）g/L和（0.40±0.01）g/L，較原始菌株T17分別提高了32%、40%和60%。綜上所述，與原始菌株相比，進化菌株在酸脅迫環境中菌體生長和產孢子速度更快，證明了進化菌株對酸脅迫的耐受能力更強。

2.2 自發酸脅迫對原始菌株和進化菌株pHi值的影響

如圖2所示，在第0小時（環境pH（pHex）值為6.5），4 株菌的pHi值之間沒有明顯差別，均維持在7.7以上。隨著發酵過程的進行，環境pH值自發下降，第48小時（pHex3.2），4 株菌的pHi值均呈現不同程度的下降：原始菌株下降到5.19±0.15，進化菌株則保持在6.27～6.53之間。由此可見，與原始菌株相比，進化菌株在自發酸脅迫條件下的pHi值明顯高于原始菌株。pHi值能夠影響細胞中營養物質的吸收、蛋白質的合成、糖酵解作用以及核酸的合成。在正常的生長代謝中，微生物的pHi值必須維持動態平衡，否則當pHi值下降到一定范圍后，會引起蛋白質以及DNA的損傷，可能導致細胞死亡[16]。因此，保持pHi值的相對穩定對微生物的生長代謝至關重要。前期研究發現，S. albulus M-Z18在pH 5.0、4.0、3.0分批發酵27 h，其pHi值都在7.7左右，由于菌株在酸脅迫環境中所處時間短，pHi值還未開始下降[7]。Wu Chongde等[17]比較了Lactobacillus casei Zhang及其耐酸進化菌株在pH 5.0、3.3的酸脅迫環境中處理1 h后的pHi值，發現進化菌株的pHi值比原始菌株高，而且這種差距會隨著脅迫pH值的降低而增大。此外，據Yamanaka等[18]報道，ε-PL合成酶的最適pH值為8.5，酸性pH值能夠顯著抑制其酶活性；因此，較高的pHi值也有利于胞內ε-PL的合成。綜上所述，在自發酸脅迫條件下，進化菌株能夠維持更高的pHi值，為菌體的正常生長和代謝以ε-PL的合成提供有利的pHi值環境。

圖2 不同酸脅迫時間下原始菌株和進化菌株的pHi值Fig. 2 Comparison of pHi values at different acid stress times between the original and evolutionary strains

2.3 自發酸脅迫對菌株胞內ATP含量和H+-ATPase活性的影響

胞內ATP含量和H+-ATPase活性在維持pHi值穩定方面發揮最重要的作用，H+-ATPase主要通過消耗ATP將胞內H+排出胞外[6]。如表1所示，在第0小時，原始菌株和進化菌株的胞內ATP含量和H+-ATPase活性沒有明顯區別；第48小時，與原始菌株相比，進化菌株始終保持較高的胞內ATP含量和H+-ATPase活性：其中，進化菌株AE44、AE51、AE56的胞內ATP含量是原始菌株T17的1.7 倍以上，H+-ATPase活性分別比原始菌株提高79.87%、85.53%和100.63%。因此，在自發酸脅迫條件下，進化菌株始終比原始菌株保持較高的胞內ATP含量和H+-ATPase活性，從而能有效地將胞內H+泵出胞外，維持pHi值的穩定，提高菌株在酸脅迫環境下的存活率。此外，Yamanaka等[19]的研究表明，ε-PL合成酶作用的發揮需要消耗大量的ATP；自發酸脅迫條件下，進化菌株胞內ATP含量更高，這也為ε-PL合成酶提供更多的能量，有利于ε-PL的合成。

表1 不同酸脅迫時間下原始菌株和進化菌株的胞內ATP含量和H＋-ATPase活性Table 1 Comparison of ATP concentration and H＋-ATPase activity at different acid stress times between the original and the evolutionary strains

2.4 自發酸脅迫中原始菌株與進化菌株胞內氨基酸含量的差異

氨基酸代謝在調控pHi值、代謝產能或還原力以及增強細胞對環境脅迫的抵抗力等方面發揮重要的作用[20]。因此，考察自發酸脅迫條件下（48 h，pHex3.2），原始菌株和進化菌株胞內所有氨基酸含量的變化。如圖3所示，在自發酸脅迫條件下，與原始菌株相比，進化菌株胞內天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、賴氨酸、甘氨酸以及脯氨酸含量明顯增加，這說明它們可能在S.diastatochromogenesAE44等3 株進化菌株抵抗酸脅迫中發揮作用。

圖3 自發酸脅迫條件下原始菌株與進化菌株胞內氨基酸含量的變化Fig. 3 Comparison of intracellular contents of amino acids between the original and evolutionary strains under spontaneous acidic stress conditions

天冬氨酸能夠消耗胞內H+轉化為丙氨酸，同時，天冬氨酸還可以生成精氨酸，進入精氨酸脫亞胺酶系統產生ATP和NH3[21]。此外，氨基酸脫羧酶系統在微生物抵御外界酸脅迫中發揮重要作用[22]。在酸脅迫中，胞外的谷氨酸被轉運到胞內，在谷氨酸脫羧酶的作用下被轉化成γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）和CO2，同時消耗胞內H+；隨后，合成的GABA被釋放到胞外。由于GABA比谷氨酸的酸性弱，因此，這一過程不僅減少了胞內H+的濃度，也導致外界環境的堿化[23]。許多研究表明，賴氨酸也能夠通過賴氨酸脫羧酶的作用消耗胞內H+，維持pHi值穩定并增強細胞對酸脅迫抗性[24-26]。甘氨酸和脯氨酸也可能通過脫羧酶的作用維持pHi值的穩定，作者前期研究也表明胞內甘氨酸的積累可能與ε-PL產生菌的耐酸機制有關[7]；脯氨酸則被發現能夠在脅迫條件下降低植物細胞酸性和維持生物大分子結構穩定等[27]。此外，賴氨酸為ε-PL合成的前體，天冬氨酸則是賴氨酸合成的前體，而谷氨酸則為賴氨酸的合成提供氨基[28]，所以胞內賴氨酸、谷氨酸和天冬氨酸含量的增加也有利于ε-PL的合成。

2.5 自發酸脅迫條件下菌株細胞膜脂肪酸含量的差異

細胞膜可以依靠脂肪酸組分的變化應對外界的酸脅迫環境[29]。細胞膜脂肪酸包括飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸，改變其比例和鏈長能夠直接影響細胞膜的流動性與穩定性[30]。考察在自發酸脅迫條件下（48 h，pHex3.2），原始菌株和進化菌株細胞膜脂肪酸成分的變化，結果見圖4。S.diastatochromogenesT17的細胞膜脂肪酸主要由飽和脂肪酸肉豆蔻酸（C14:0）、十五烷酸（C15:0）、棕櫚酸（C16:0）和硬脂酸（C18:0）以及不飽和脂肪酸棕櫚油酸（C16:1）和油酸（C18:1）組成。在自發酸脅迫條件下，與原始菌株相比，進化菌株的細胞膜中飽和脂肪酸（C14:0、C15:0、C16:0和C18:0）相對含量下降；而不飽和脂肪酸（C16:1和C18:1）相對含量增加，其中增加最明顯的為C16:1，進化菌株AE56的C16:1相對含量是原始菌株T17的6.04 倍。因此，進化菌株細胞膜脂肪酸具有更高的不飽和度（圖5），從而增加細胞膜的流動性，更加有利于細胞膜的物質運輸以及能量代謝等功能的發揮，以保證細胞在酸脅迫條件下的生存與功能行使。由圖4可知，C16:0和C16:1在原始菌株和進化菌株的脂肪酸組成中所占比例較大，在自發酸脅迫條件下，雖然進化菌株中C16:0相對含量明顯減少，C16:1相對含量明顯增加，但是進化菌株的細胞膜脂肪酸的鏈長與原始菌株相比沒有顯著變化（圖5）。

圖4 自發酸脅迫條件下原始菌株與進化菌株細胞膜脂肪酸成分的變化Fig. 4 Comparison of contents of membrane fatty acids between the original and evolutionary strains under spontaneous acidic stress conditions

圖5 自發酸脅迫條件下原始菌株與進化菌株細胞膜脂肪酸不飽和度和平均鏈長的變化Fig. 5 Comparison of ratio of unsaturated/saturated fatty acids and mean chain length between the original and evolutionary strains under spontaneous acidic stress conditions

3 結 論

與原始菌株相比，酸性適應性進化得到的進化菌株在自發酸脅迫條件下能夠在胞內保持更高的ATP含量和

H+-ATPase活性，積累更多的天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、賴氨酸、甘氨酸以及脯氨酸，從而使pHi值維持在較高水平；同時，進化菌株中細胞膜脂肪酸的不飽和度升高，從而增強了細胞膜的流動性。這些變化減輕了自發酸脅迫對菌體的損傷。此外，進化菌株中較高的pHi值、胞內ATP、天冬氨酸、谷氨酸以及賴氨酸濃度也有利于ε-PL的合成。目前，其他研究者只注意到ε-PL的合成需要依賴酸性pH值環境[4]，而忽略了這種酸性環境對產生菌而言是一種脅迫環境，本研究有利于充實革蘭氏陽性菌對酸脅迫的響應機制，同時也為揭示ε-PL在酸性環境中合成的生理意義提供參考。