新疆漢、維、哈三民族人群酒精依賴者糖缺陷轉鐵蛋白含量的測定與差異分析

黃培培 艾克拜爾·熱合曼 米爾孜合買提·買買提明 阿爾孜古麗·木塔力甫 謝 輝＊

（1、齊魯醫藥學院機能學實驗中心，山東 淄博255000 2、寧德師范學院化學與材料學院，福建 寧德352100 3、烏魯木齊市第四人民醫院戒酒科，新疆 烏魯木齊830000 4、新疆維吾爾自治區人民醫院臨床檢驗中心，新疆 烏魯木齊830001 5、新疆醫科大學法醫學教研室，新疆 烏魯木齊830011）

酒精濫用嚴重危害個人健康，長期飲酒會引起慢性肝臟損害和精神認知障礙及其它身體障礙，同時產生酒精依賴，導致個人和社會公共安全問題[1]。在酒精依賴患者的治療監測和司法鑒定中，需要新的可靠的、準確的生化指標物，這對個體健康和社會安全具有重要意義。然而，眾所周知，酒精飲用傳統的生化指標物如丙氨酸轉氨酶（ALT）、天門冬氨酸轉氨酶（AST）、谷胺酰轉肽酶（GGT）和平均紅細胞體積（MCV）[2]，均缺乏敏感度和特異性。所以，迫切需要用于早期檢測酒精攝入過多的新的標志物。

CDT 是無唾液酸轉鐵蛋白、單唾液酸轉鐵蛋白和二唾液酸轉鐵蛋白的總和[3，4]，其中二唾液酸轉鐵蛋白含量最多。研究表明，糖缺陷轉鐵蛋白（CDT）水平與酒精飲用度有密切的關系。飲酒會增加血清CDT 含量，尤其是無唾液酸和二唾液轉鐵蛋白[4]，每天飲酒60-80g 持續至少10-15 天時，該值明顯升高，而戒酒治療2 周或3 周時，則CDT 值恢復到正常水平。自1976 年[3]被首次發現后，CDT 已經迅速成為基礎和臨床研究中用于檢測重度酒精的焦點[3，4]。

最近二十年，一個基于Sebia（Every，France）分析原理的完全自動的毛細管區帶電泳法（CZE）技術迅速發展起來[3-7]。CZE可以檢測所有轉鐵蛋白及其基因變異體。有研究證實檢測CDT的毛細管電泳法目前已擁有了良好的精密度、可靠的線性范圍[3，4]。這篇文章，我們將測試新疆未飲酒健康者、偶爾飲酒者、酒精依賴者的CDT 含量并進行差異分析，為酒精依賴臨床診斷、治療監測和司法鑒定提供科學檢測數據和參考依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

毛 細 管 區 帶 電 泳Capillarys （Sebia， 法 國）。 冰 箱（FCD-217SE，海爾電冰柜）。低速大容量離心機（TDL-50B，上海安亭科學儀器廠）。羅氏cobas c311 全自動生化分析儀（Mannheim，德國），貝克曼庫爾特LH750 血細胞分析儀（Coulter，美國）。Capillarys CDT 試劑盒（Sebia 公司）：CDT 正常質控品（批號：23022/01）和高值質控品（批號：07062/01）、堿性緩沖液（批號：07055/80）、樣品稀釋液（批號：26055/01）、洗液（批號：01065/80）和CDT 洗液（批號：06015/01）；質控條形碼、稀釋小杯、濾器、CDT 清洗杯。一次性使用真空貯血管（贛達醫療器械有限公司）。

1.2 研究對象及分組

新疆烏魯木齊市第四人民醫院戒酒科提供漢族、維吾爾族、哈薩克酒精依賴患者血樣141 份和漢族、維吾爾族、哈薩克偶爾飲酒者血樣154 份，新疆醫科大學附屬醫院檢驗科提供73份未飲酒健康人血樣。共368 份血樣。研究對象分成三組：未飲酒健康人組（23 個漢族人、21 個維吾爾族人、29 個哈薩克族人）、偶爾飲酒者組（57 個漢族人、65 個維吾爾族人、32 個哈薩克族人）和酒精依賴者組（72 個漢族人、31 個維吾爾人、38 個哈薩克族人）。新疆醫科大學第一附屬醫院倫理委員會允許進此項研究。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

護士在清早人員空腹時收集靜脈血樣于不含抗凝劑的真空采血管中。樣品取回后，用離心機（TDL-50B）3000r/min 離心5分鐘。離心后，取上清液保存于-20℃冰箱中，直至測量。

1.3.2 毛細管區帶電泳檢測CDT 含量

毛細管電泳儀配備有8 個毛細管，17.5cm×25mm。毛細管電泳儀可以同時檢測7 個樣品，其中8 號位置放樣品稀釋液。毛細管電泳法依據不同轉鐵蛋白亞型電荷差異進行區分，可提供可見的轉鐵蛋白亞型條帶，并對不同亞型分別進行定量，毛細管電泳法是在200 nm 處檢測肽鍵的紫外（UV）吸收峰[3，5]。二唾液酸轉鐵蛋白等電點PI 為5.7，無唾液酸轉鐵蛋白PI 為5.9，單唾液酸轉鐵蛋白PI 為5.8[8，9，10]。在毛細管區帶電泳系統中（Sebia，France），帶電分子在具有一定pH 的堿性緩沖液中根據電解液的pH 和電滲流的不同，而遷移分離開。CDT 值以無唾液酸轉鐵蛋白和二唾液酸轉鐵蛋白峰面積之和（A0+A2）占無唾液酸轉鐵蛋白到五唾液酸轉鐵蛋白峰面積之和（A0+A2+A3+A4+A5）的 百 分 比 形 式 表 達[11]，即CDT=（A0+A2）/（A0+A2+A3+A4+A5）×100%。毛細管電泳法主要將各亞型分離后再進行吸光度檢測，依據峰面積來計算出CDT 與轉鐵蛋白總量的百分比[3，5，12]。所有操作根據制作商提供的說明書的操作步驟完成。根據制作商的指令，CDT 值＞1.6%為陽性，1.3%＜CDT 值≤1.6%需要再次檢查，CDT≤1.3 為陰性[11]。電泳分析使用軟件CAPILLARYS release 6.1.2 完成。

1.3.3 精密度實驗

準備低、中、高濃度的CDT 血清樣品，每種濃度的樣品分別連續進樣5 次，按1.3.2 毛細管電泳條件進行檢測，測得CDT值，其RSD 值為1.245 0%～5.826 8%。見表1。

表1 毛細管電泳儀測量糖缺陷轉鐵蛋白的精密度

1.4 統計學方法

應用SPSS21.0 統計軟件進行統計學分析，正態分布的計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 漢、維、哈三民族健康未飲酒者和酒精依賴者CDT 含量

CDT 包括無唾液酸轉鐵蛋白和二唾液酸轉鐵蛋白。正常人，CDT 含量極少，主要是二唾液酸轉鐵蛋白，幾乎不含無唾液酸轉鐵蛋白或單唾液酸轉鐵蛋白[3，5]，如表2、圖1。飲酒后，尤其是酒精依賴者體內轉鐵蛋白所含的唾液酸分子減少，使二唾液酸轉鐵蛋白、無唾液酸轉鐵蛋白的轉鐵蛋白亞型水平升高[4]。酒精依賴者體內的二唾液酸轉鐵蛋白含量明顯增加[13]，且出現無唾液酸轉鐵蛋白，如表3、圖2。無唾液酸轉鐵蛋白、二唾液酸轉鐵蛋白、三唾液酸轉鐵蛋白、四唾液酸轉鐵蛋白、五唾液酸轉鐵蛋白在圖表中分別使用0-sialo、2-sialo、3-sialo、4-sialo、5-sialo來表示。表2、表3 中各唾液酸值均以其占所有唾液酸百分含量來表示。

表2 CZE 法健康未飲酒者血清CDT 檢測結果值

圖1 未飲酒者血清CDT 毛細管電泳檢測圖

表3 CZE 法酒精依賴者血清CDT 檢測結果值

圖2 酒精依賴者血清CDT 毛細管電泳檢測圖

2.2 新疆三個民族健康未飲酒者組、偶爾飲酒者組、酒精依賴者組CDT 含量差異分析

表4 新疆漢、維、哈三個民族未飲酒者組、偶爾飲酒者組、酒精依賴者組CDT 水平的比較

健康未飲酒者、偶爾飲酒者和酒精依賴者三組之間的CDT含量差異有統計學意義（P＜0.001），見表4。健康未飲酒組與偶爾飲酒者組之間的CDT 水平差異沒有統計學意義（P＞0.05），健康未飲酒者組與酒精依賴者組間的CDT 水平差異有統計學意義（P＜0.001）,偶爾飲酒者組與酒精依賴者組間的CDT 水平差異有統計學意義（P＜0.001），見表6。

各民族受試正常健康人群CDT 含量之間的差異無統計學意義（P＞0.05），各民族偶爾飲酒人員CDT 含量之間的差異無統計學意義（P＞0.05），酒精依賴者組漢、維、哈三民族間的CDT水平差異有統計學意義（P＜0.05），見表4。漢族與維吾爾族之間CDT 水平差異有統計學意義（P＜0.05），漢族與哈薩克族之間CDT 水平差異有統計學意義（P＜0.05），維吾爾族與哈薩克族之間CDT 水平差異沒有統計學意義（P＞0.05），如表5。

表5 酒精依賴者組CDT 的兩兩比較結果

2.3 轉鐵蛋白遺傳變異的頻率

在368 個新疆人的血清CDT 中，15 個血清樣品有轉鐵蛋白的遺傳變異（B 型或D 型），變異率為4.07%。毛細管電泳變異圖如圖3，2-sialo=0.6%，變異體97.9%，變異體1.5%。

圖3 血清CDT 毛細管電泳遺傳變異圖

3 討論

毛細管電泳法由于其固有的高選擇性、易操作、高生產率、自動化、省時省力等特點，被臨床優選確認使用。本文選擇此方法檢測新疆漢族、維吾爾族、哈薩克族未飲酒健康人、偶爾飲酒者和酒精依賴者血清中CDT 的含量。結果顯示漢、維、哈三個民族中酒精依賴人群血清CDT 水平之間具有統計學差異（P＜0.05）。CDT 是一個靈敏度、特異性最佳的標記物，將作為司法鑒定酒精依賴的標記物。

表6 未飲酒健康人組、偶爾飲酒者組、酒精依賴者組CDT 兩兩比較結果

人轉鐵蛋白的38 個遺傳變異會引起氨基酸替換[3，5]。常見的等位基因型是陽極B 型和陰極D 型等位基因。D 型-轉鐵蛋白可以引起非濫用者的假陽性結果，B 型-轉鐵蛋白可以引起慢性酒精濫用的假陰性結果。CZE 可以檢測所有轉鐵蛋白及其基因變異體，避免不準確的CDT 測量。據報道，白種人的遺傳變異率是低的（＜1%），而非洲裔美國人、非洲黑人和美國南部土著人的遺傳變異率是高的[3，5]。本文研究結果顯示新疆人轉鐵蛋白變異的頻率是4.07%，這比Hee-Won Moon[5]和Binbin Song[3]的研究變異率稍低。Hee-Won Moon[5]研究顯示在韓國人中，變異率為4.1%。Binbin Song[3]研究顯示在中國漢族人中，變異率為4.14%。

盡管有大量研究試圖解釋飲酒為何能使轉鐵蛋白中的唾液酸含量減少，但是目前具體機制仍不明確[4]，確定其中并不是一個簡單的過程，而是由多種酶類參與、多步驟的過程[15]。在健康的對照組中尚未發現無唾液酸轉鐵蛋白和單唾液酸轉鐵蛋白。這證實了酒精濫用會引起轉鐵蛋白的唾液酸缺失，這可能是由于糖基轉移酶改變，特別是唾液酸轉移酶。

本次研究，不能準確地評估飲酒習慣，因為我們的評估是基于回顧性研究。然而，長期飲酒的前瞻性實驗可能會發生倫理問題，這對進一步研究造成一定困難。另外，部分研究對持續飲用量定義不明，比如有關文獻報道在持續酒精飲用（50-80g/d）中至少一周后血CDT 的濃度增加[5]，而另一份報道卻顯示酒精飲用（60g/d）至少兩周后CDT 濃度增加[14]，戒斷期間，CDT 值慢慢恢復正常。盡管在CDT 水平和慢性酒精飲用間有一個清晰的關系，但如何用CDT 值來診斷酒精濫用程度尚未清楚，迫切需要更多的研究來解決這個問題。