不同抗生素及除草劑Basta對大蔥愈傷組織分化的影響

王清華 劉澤洲 顏冬 陳偉 高莉敏

摘要：為了建立優良的大蔥遺傳轉化體系，以卡那霉素（Kana）、潮霉素（Hyg）以及除草劑Basta（Bar基因）作為抗性選擇劑，研究其對大蔥愈傷組織分化的影響。結果表明：大蔥愈傷組織分化對Kana不敏感，Kana不適宜作為大蔥遺傳轉化中抗性選擇標記，Hyg適宜的選擇濃度為50 mg/L，除草劑Basta適宜的選擇濃度為0.10 mg/L。

關鍵詞：大蔥;抗生素;除草劑Basta;愈傷組織分化

中圖分類號：S633.1 ?文獻標識號：A ?文章編號：1001-4942（2020）02-0050-04

Abstract In order to establish a genetic transformation system for bunching onion， the kanamycin （Kana）， hygromycin （Hyg） and herbicide Basta （Bar gene） were used as selective agents to study their effects on the differentiation of bunching onion callus. The results indicated that the differentiation of bunching onion callus was not sensitive to Kana， so Kana was not suitable as a selection marker for bunching onion. The results also showed that 50 mg/L Hyg and 0.10 mg/L Basta were the suitable selection concentrations for callus differentiation of bunching onion.

Keywords Bunching onion;Antibiotics;Herbicide Basta;Differentiation of callus

植物遺傳轉化技術中，農桿菌介導的轉化方法應用廣泛，是較為有效的轉化方法。該方法需要提前在轉化用的質粒載體中插入標記基因，再在選擇培養基中加入適宜濃度的抗性選擇劑。轉化細胞由于具有選擇性標記基因， 所以不受選擇劑的影響而正常生長[1] ，非轉化細胞則不能正常生長而死亡。遺傳轉化步驟主要包括農桿菌侵染、共培養、選擇培養、轉基因植株再生等，除侵染和共培養外，其余操作均需要用抗性選擇劑來篩選轉化體。一個成功的轉化體篩選體系主要取決于3個方面：適當的選擇性標記基因、適當的選擇性試劑和試劑濃度、適當的選擇時間[2]。作物、品種以及外植體類型不同，適宜的抗性選擇劑和濃度也不相同。因此，篩選一種適合特定材料的抗性選擇劑以及適宜的濃度對作物遺傳轉化研究具有非常重要的意義。

大蔥（Allium fistulosum L.）屬于百合科蔥屬植物。關于蔥屬植物遺傳轉化的研究已有不少報道，主要集中在洋蔥[3-6]、大蒜[7-10]上，關于大蔥的研究相對較少。楊俊杰[11]以潮霉素（Hyg）作為抗性選擇劑對大蔥遺傳轉化進行研究，表明Hyg濃度為50 mg/L 時，大蔥愈傷組織停止生長，并在75 mg/L時全部死亡，而以Hyg 50 mg/L進行第1次篩選、分化培養一段時間后，再以75 mg/L進行第2次篩選，效果較佳。

本試驗以卡那霉素（Kana）、Hyg以及除草劑Basta作為抗性選擇劑，設置不同濃度梯度，研究抗生素及除草劑對大蔥遺傳轉化體的篩選濃度，旨在為建立高效的大蔥遺傳轉化體系奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗大蔥品種為章丘大梧桐。

1.2 主要試劑

MS培養基、植物激素6-BA和2，4-D均購自生工生物工程（上海）股份有限公司;Kana和Hyg購自北京索萊寶科技有限公司;除草劑Basta購自北京酷來搏科技有限公司。

1.3 試驗方法

大蔥愈傷組織培養采用宗紅等[12]的試驗方法進行，略有改動。挑選飽滿成熟的大蔥種子，經自來水沖洗10 min、 2%次氯酸鈉浸泡消毒30 min、無菌水沖洗3～5次，接種于MS（2.0 mg/L 2，4-D +1.0 mg /L 6-BA）培養基中，誘導產生的愈傷組織40 d左右進行一次繼代培養，最后選擇黃色、致密、反光性強的愈傷組織用于本次試驗。以添加不同濃度的Kana（0、25、50、75、100 mg/L）、Hyg（0、25、50、75、100 mg/L）以及Basta（0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/L）的分化培養基（MS +1.5 mg/L 6-BA）為不同處理，分別接種大蔥愈傷組織，25℃、3 000 lx下每天光照12 h進行培養，對照不添加抗生素和Basta。每處理10瓶，每瓶接6塊愈傷。每10 d 觀察記錄一次愈傷組織分化情況，共統計4次。

1.4 數據分析

采用DPS 7.05軟件進行數據統計與顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同濃度Kana 對大蔥愈傷組織分化的影響

由表1可以看出，不同濃度Kana對大蔥愈傷組織分化的影響不大。大蔥愈傷組織死亡率僅在100 mg/L Kana濃度下培養40 d時為6.7%，其它處理條件下均為零。當Kana濃度為25 mg/L時，不同培養時間的愈傷組織分化率均較對照明顯減少，培養40 d時為20%，而隨著Kana濃度的繼續增加，愈傷組織分化率趨于平穩，不同處理培養40 d的愈傷組織分化率均為8.3%。由此可見，大蔥愈傷組織對Kana并不敏感，此抗生素不適宜作為大蔥遺傳轉化的抗性選擇劑。

2.2 不同濃度Hyg對大蔥愈傷組織分化的影響

由表2看出，隨著Hyg濃度的增加及培養時間的延長，大蔥愈傷組織死亡率逐漸升高，分化率逐漸降低。Hyg濃度為25 mg/L時，大蔥愈傷組織培養40 d的死亡率達到21.7%，分化率極顯著降低，僅為5%;濃度達到50 mg/L時，培養40 d的大蔥愈傷分化率為零，而死亡率增至75%，是25 mg/L濃度時的3.5倍。可見大蔥愈傷組織對Hyg特別敏感，適宜的選擇濃度為50 mg/L。

2.3 不同濃度除草劑Basta對大蔥愈傷組織分化的影響

分化培養基中添加除草劑Basta能明顯抑制大蔥愈傷組織分化產生不定芽。由表3可以看出，對照的愈傷組織培養10 d即開始分化產生不定芽，分化率為6.7%，培養20、30、40 d后的分化率分別為30.0%、43.3%、60.0%。大蔥愈傷組織對除草劑Basta較為敏感，與對照相比，在添加0.05 mg/L Basta的培養基中培養20 d時，分化率降低至6.7%，培養40 d時則降至10%，死亡率升至23.3%。Basta 濃度為0.10 mg/L 時，愈傷組織再分化完全被抑制，并且死亡率升高明顯，培養40 d時達到60%。由此可見，0.10 mg/L的除草劑Basta可作為大蔥遺傳轉化愈傷組織分化的選擇壓濃度。

3 討論與結論

為了初步篩選轉化體與非轉化體，植物遺傳轉化的質粒上通常帶有篩選標記基因，通過外界設置產生選擇壓力能夠有效地抑制非轉化體生長。Kana抗性基因是第一個轉化到植物中的標記基因，是植物轉化中最常用的篩選標記基因。目前已大規模應用于番茄、油菜、辣椒、擬南芥等植物的遺傳轉化中。Hyg抗性基因，在某些作物上選擇效率比Kana抗性基因高，在水稻中應用較多。除了抗生素抗性基因，抗除草劑基因也常常用于轉基因標記[13]。因此，本試驗選擇Kana、Hyg以及Basta（Bar基因）作為大蔥遺傳轉化中愈傷組織分化抗性選擇劑，再從中進行篩選。

Kana抗性基因在蔥屬植物中的應用相對較少。徐啟江等[6]認為洋蔥遺傳轉化中，Kana作為抗性選擇劑的適宜濃度為150 mg/L。但也有研究表明，Kana不適宜作為蔥屬植物遺傳轉化的抗性選擇劑。Wilmink等[14]認為基于Kana抗性建立起來的選擇系統通常不適用于單子葉植物，因為它們的細胞和組織對Kana相對不敏感;Eady等[3]對洋蔥遺傳轉化研究表明，當Kana濃度達到200 mg/L時，與對照相比僅有15%的影響，可見洋蔥愈傷組織對Kana并不敏感;Park等[7]在利用基因槍轉化大蒜愈傷組織的研究中發現，大蒜愈傷組織對Kana的耐受性比較強。本研究結果也表明，當Kana達到100 mg/L、培養時間為40 d時，愈傷組織死亡率僅有6.7%，可見大蔥愈傷組織分化對Kana抗性并不敏感。

蔥屬植物遺傳轉化利用Hyg作為抗性基因的研究相對較多。Eady等[3]通過對洋蔥遺傳轉化選擇壓的研究表明Hyg水平在50～100 mg/L時比較適宜;Zheng等[15]在做大蒜遺傳轉化時，利用25 mg/L Hyg作為選擇壓;Kondo等[8]在大蒜莖尖分生組織轉化研究中的結果表明，Hyg濃度從10～40 mg/L逐漸增加，逐級篩選轉基因植株的效果最佳;Park等[7]在基因槍轉化大蒜愈傷組織的研究中發現，大蒜愈傷組織對Hyg的篩選比較敏感，未轉化的愈傷組織在含有50 mg/L Hyg的培養基上生長2個月后死亡;唐巧玲等[10]通過對未轉化的大蒜愈傷組織進行Hyg耐受性測試，結果表明Hyg濃度在50～70 mg/L 時進行愈傷組織的篩選比較適宜;Zheng等[4]研究洋蔥和青蔥的遺傳轉化時推薦Hyg的選擇壓濃度為50 mg/L。對于大蔥遺傳轉化的研究僅有1篇報道：楊俊杰[11]通過對大蔥遺傳轉化時愈傷組織分化對Hyg 的抗性研究表明選擇壓為50 mg/L時比較適宜，本研究結果與此一致。說明大蔥愈傷組織對Hyg的選擇壓力比較穩定。

Basta是一種有機磷類除草劑，其有效成分是膦絲菌素（PPT）。它主要通過抑制谷氨酰胺合成酶（GS）活性，使植物體內氮代謝紊亂、細胞內氨含量過高而中毒，葉綠素解體，光合作用受到抑制，最終導致植物死亡[16，17]。由于Basta對植株的傷害相對較小[18]，同時能提高選擇效率，比較適用于大規模的遺傳轉化研究[13]。現在很多遺傳轉化開始利用除草劑作為抗性選擇基因。Eady等[3]通過對洋蔥遺傳轉化選擇壓的研究表明，Basta水平在10～30 mg/L時比較適宜;Nada[13]通過對大麥和擬南芥的遺傳轉化研究表明，Basta涂刷大麥葉片的的適宜篩選濃度為7 mg/L;利用MS培養基篩選擬南芥的研究證實Basta的適宜添加濃度為7.5 mg/L;王慧中等[19]研究了除草劑Basta對6個水稻品種愈傷組織的生長和分化的影響，水稻愈傷組織在分化階段對Basta相當敏感，品種之間差異較大，完全抑制愈傷組織分化的Basta濃度為2.5～3.0 mg/L。李倩等[20]通過對甘薯遺傳轉化抗性選擇劑的研究表明川薯164與西成薯007葉片抗Basta的最適選擇壓均為1.0 mg/L。由以上研究可以看出Basta的使用濃度差異較大，這主要與使用方法以及作物不同有關。本研究表明，完全抑制大蔥愈傷組織分化的Basta濃度為0.10 mg/L，達到0.25 mg/L、培養40 d的愈傷組織在分化培養基中完全死亡。可見，大蔥愈傷組織對Basta相當敏感。

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