栽培與野生化血丹不同部位中兩種化學(xué)成分含量分析

張傳利 馬曉 朱春梅 陳治華 李維峰 趙秀 何素明 杜華波

摘 要：? 為探討并分析栽培與野生化血丹植株中不同部位中兩種化學(xué)成分的含量差異，該研究采用超聲法提取、高效液相色譜法（HPLC）測定栽培與野生化血丹根、莖、葉、花、混合樣等部位中桃葉珊瑚苷和梓醇的含量，并進(jìn)行比較。結(jié)果表明：（1）桃葉珊瑚苷在栽培與野生化血丹植株內(nèi)均有分布，含量均以根中最高，其在栽培與野生化血丹植株內(nèi)的含量表現(xiàn)分別為根>葉>混合樣>莖>花、根>混合樣>莖>花>葉，栽培化血丹不同部位中桃葉珊瑚苷的含量均高于野生化血丹。（2）梓醇在栽培化血丹的莖中未檢出，在栽培與野生化血丹其他部位均有分布，含量均以葉中最高，其在栽培與野生化血丹植株內(nèi)的含量分別表現(xiàn)為葉>花>混合樣>根、葉>混合樣>莖>花>根，野生化血丹不同部位中梓醇的含量均高于栽培化血丹。（3）桃葉珊瑚苷和梓醇在栽培和野生化血丹植株不同部位中的含量均存在顯著差異（P<0.05），栽培與野生同一部位間總體上無顯著差異，為該瀕危藥用植物資源藥用部位選擇和合理開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)參考。

關(guān)鍵詞： 化血丹， 桃葉珊瑚苷， 梓醇， 高效液相色譜法（HPLC）， 不同部位， 分析比較

中圖分類號：? Q946

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：? A

文章編號：? 1000-3142（2020）05-0673-07

Content analysis of two chemical compositions in different parts of cultivated and wild Centranthera grandiflora

ZHANG Chuanli， MA Xiao， ZHU Chunmei， CHEN Zhihua， LI Weifeng， ZHAO Xiu， HE Suming， DU Huabo*

（ College of Tropical Crops of Yunnan Agricultural University， Puer 665099， Yunnan， China ）

Abstract：? To study and analysis the difference contents of two active ingredients in different parts of cultivated and wild Centranthera grandiflora， the contents of aucubin and catalpol in roots， stems， leaves， flowers and mixed samples of cultivated and wild C. grandiflora were determined by ultrasonic extraction and high performance liquid chromatography （HPLC） and compared. The results were as follows： （1） Aucubin was distributed in both cultivated and wild plants， with the highest contents in roots. The contents in cultivated and wild C. grandiflora were root > leaf > mixed sample > stem > flower， root > mixed sample > stem > flower > leaf， respectively. The content of aucubin in different parts of cultivated plants was higher than that in wild plants. （2） Catalpol was not detected in the stem of cultivated C. grandiflora， but was distributed in other parts of cultivated and wild C.? grandiflora， with the highest content in leaves. The contents of catalpol in cultivated and wild C.? grandiflora were leaf > flower > mixed sample > root， leaf > mixed sample > stem > flower > roots， respectively. The contents of catalpol in different parts of wild were higher than those of cultivated C.? grandiflora. （3） There were significant differences （P<0.05） in the contents of aucubin and catalpol in different parts of cultivated and wild C.? grandiflora plants， and there was no significant differences between cultivated and wild parts on the whole， which provides experimental reference for the selection and reasonable utilization of the medicinal site of the endangered medicinal plant resources.

Key words： Centranthera grandiflora， aucubin， catalpol， high performance liquid chromatography （HPLC）， different parts， analysis comparison

化血丹（Centranthera grandiflora）為玄參科（Scrophulariaceae）胡麻草屬 （Centranthera）一年生或越年生草本植物大花胡麻草的根，主要產(chǎn)于廣西、云南、貴州等地，是一味瀕危且種群極小的民族民間常用中草藥（中華本草編輯委員會， 1991; 中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會， 2013），在抗菌、抗癌、凝血、缺血、治療心血管疾病、白血病、降壓、降糖、保肝等方面療效顯著（王真等， 2012; 廖立平等， 2012;楊抒雨等， 2017）。目前國內(nèi)外對化血丹的研究主要集中在對化血丹根中化學(xué)成分分離鑒定、成分的功效等方面（梁鉅忠等， 1984; 廖立平， 2014; 胡瓊， 2016）;結(jié)果表明，化血丹根內(nèi)含有甘露醇、類胡蘿卜酸物質(zhì)杜鵑紅素、環(huán)烯醚萜苷類、黑蒴苷類、苯乙醇苷類、紫羅蘭酮苷類等多類豐富的生物活性物質(zhì)，其中桃葉珊瑚苷和梓醇是其中2種重要的環(huán)烯醚萜苷化學(xué)成分。桃葉珊瑚苷具有清濕熱、利小便、降壓、鎮(zhèn)痛、保肝護(hù)肝、抗腫瘤等功效（薛宏宇等， 2013; 廖立平， 2014; 韓曼飛等， 2017），梓醇具有利尿、抗炎、降血糖抗癌、神經(jīng)保護(hù)及抗肝炎病毒等功效（Ismailoglu et al.， 2002; Jiang et al.， 2004; Tong et al.， 2015; 王靜歡等， 2015， 2017; Xia et al.， 2017）;而對根部所含化學(xué)成分的定量分析及其他部位間含量比較未見報(bào)道。化血丹作為云南等產(chǎn)地少數(shù)民族民間抗癌、保肝、溶血栓道地藥材，以根泡酒作為偏方藥，以根用藥是否合理，根以外其他部位是否有藥用價(jià)值均有待研究。近年來由于桃葉珊瑚苷和梓醇等化學(xué)成分藥用價(jià)值的研究開發(fā)，目前以桃葉珊瑚苷為主要成分的杜仲平壓片和以梓醇為成分已審報(bào)兩個(gè)一類新藥臨床研究（薛宏宇等， 2013; Liu & Ling， 2004;王靜歡等， 2015），市場需求量急劇增加，加之化血丹長期以來全部依賴于野生資源和其自然繁殖率等因素，野生資源已面臨瀕危，而馴化栽培的化血丹的質(zhì)量是否能達(dá)到野生標(biāo)準(zhǔn)也有待研究?；诖?，本研究對栽培與野生化血丹不同部位中2種化學(xué)成分含量進(jìn)行測定及分析比較，旨在為其藥用部位選擇和栽培植株質(zhì)量控制及開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

野生與栽培化血丹新鮮樣品均采自于云南省紅河州屏邊縣同一生長區(qū)域，經(jīng)普洱市民族醫(yī)藥研究所張紹云主任藥師鑒定為玄參科胡麻草屬植物大花胡麻草（Centranthera grandiflora）的根、莖、葉、花，野生與栽培化血丹均引種栽培保存于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)熱帶作物學(xué)院藥用植物資源圃內(nèi)。栽培與野生化血丹全株在同一條件下自然風(fēng)干后，均置于55 ℃真空干燥至恒重，按根、莖、葉、花等部位分別粉碎過4號篩備用，并將過篩后的根、莖、葉按質(zhì)量比1∶1∶1制成混合樣備用。

1.2 儀器

安捷倫1200高效液相儀（安捷倫科技有限公司）;SK5200H型超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）;CN61M/DZF真空干燥箱（上海奧豪斯貿(mào)易有限公司）;ME204E電子分析天平（上海奧豪斯貿(mào)易有限公司）;純水/ 超純水系統(tǒng)（韓國HUMAN PowerI）。

1.3 試劑

對照品：桃葉珊瑚苷（純度≥98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號為C1603095）;梓醇（純度≥97%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號為L1210052）;乙腈（色譜純，德國 MERCK）、甲醇（色譜純，德國MERCK）、磷酸（分析純），均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.4 HPLC分析條件

以《中華人民共和國藥典》（2015年版，一部）（國家藥典委員會， 2015）、馬運(yùn)明等（2011）的測定生地黃中梓醇和桃葉珊瑚苷的高效液相色譜法為參照，對其提取方法和流動相條件進(jìn)行優(yōu)化。桃葉珊瑚苷、梓醇測定色譜柱分別為Agilent TC-C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）、SPHERI-5RP-18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）;流動相分別為乙晴-水（3∶97）、甲醇-0.1%磷酸水（1∶99）;檢測波長分別為205、210 nm;流速均為1 mL·min-1;進(jìn)樣量均為20 μL;柱溫分別為25、35 ℃;理論塔板數(shù)分別不少于5 000、9 000。

1.5 測定方法

1.5.1 對照品溶液的制備 分別取桃葉珊瑚苷、梓醇對照品適量，精密稱定，加各自流動相溶解，配制成0.108 mg·mL-1的桃葉珊瑚苷對照品溶液和0.123 mg·mL-1梓醇對照品溶液，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

1.5.2 供試品溶液的制備 分別精密稱量栽培與野生化血丹根、莖、葉、花等部位樣品和混合樣粉末0.50 g置于具塞錐形瓶中，精密加入40%甲醇5 mL，搖勻并稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率35 KHZ）30 min，靜置5 min，用40%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，吸取溶液，用0.45 μm的微孔濾膜濾過（崔紅梅等， 2015），即得。

1.5.3 線性關(guān)系考察 按“1.5.1”項(xiàng)下配制桃葉珊瑚苷對照品溶液：0.003 6、0.036、0.072、0.108、0.144、0.180 mg·mL-1;配制梓醇對照品溶液：0.061 5、0.092 25、0.123、0.153 75、0.184 5、0.553 5 mg·mL-1;在“1.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，以對照品濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸（李艷玲等， 2015; 楊海玲等， 2018），得桃葉珊瑚苷、梓醇回歸方程分別為Y=16 899 435.83X+1 357.34（r=0.999 9）、Y=7 097 432.35X+3 001.31（r=0.999 9）。結(jié)果表明，分別在3.6～180.0 μg·mL-1、61.5～553.5 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。對照品及樣品HPLC色譜圖見圖1。

1.5.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取“1.5.1”對照品溶液20 μL，分別在“1.4”項(xiàng)色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，測峰面積。得桃葉珊瑚苷、梓醇峰面積RSD分別為0.65%、0.69%，表明該方法具有良好精密度。

1.5.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取栽培與野生化血丹各部位和混合樣粉末各6份，每份約0.50 g，精密稱定，在“1.5.2”項(xiàng)下配制后依次進(jìn)樣，在“1.4”項(xiàng)下測定。得栽培化血丹根、莖、葉、花、混合樣桃葉珊瑚苷峰面積RSD分別為1.26%、0.96%、0.24%、1.25%、1.18%;得野生化血丹根、莖、葉、花、混合樣梓醇峰面積RSD分別為1.24%、0.52%、0.42%、1.73%、1.24%。RSD均小于2%，表明所建立方法具有良好重復(fù)性。

1.5.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取栽培與野生化血丹根供試品，在“1.5.1”項(xiàng)下配置0、2、4、8、12、24 h后依次進(jìn)樣，分別考察梓醇和桃葉珊瑚苷的穩(wěn)定性。得栽培化血丹桃葉珊瑚苷、梓醇峰面積RSD分別為0.76%、0.49%;得野生化血丹桃葉珊瑚苷、梓醇峰面積RSD分別為0.75%、0.47%。表明在24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定。

1.5.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取6份栽培化血丹葉粉末約0.25 g，精密加入桃葉珊瑚苷對照品0.90 mL（0.108 mg·mL-1）、梓醇對照品22.0 mL（0.123 mg·mL-1），分別按“1.4”項(xiàng)色譜條件下測定。得桃葉珊瑚苷、梓醇的平均回收率分別為99.89%、99.86%，RSD分別為0.35%、0.60%，具體結(jié)果見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品中桃葉珊瑚和梓醇含量的測定

按照“1.4”項(xiàng)下測定不同部位樣品桃葉珊瑚苷、梓醇的含量。用Excel2010計(jì)算2種化學(xué)成分含量，對數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 22.0對同種類型植株不同部位2種化學(xué)成分的含量進(jìn)行多重比較，栽培與野生化血丹植株不同部位桃葉珊瑚苷和梓醇含量測定結(jié)果見表2。由表2可知，在栽培化血丹植株中，桃葉珊瑚苷在各部位均有分布，以根中最高，且與其他部位間存在顯著差異;梓醇在根、葉、花等部位中有分布，在莖中未檢出，以葉中最高， 檢出各部位間均存在顯著差異。在野生化血丹植株中，梓醇和桃葉珊瑚苷在根、莖、葉、花各部位中均有分布，且在各部位間存在差異。桃葉珊瑚苷在栽培化血丹不同部位中含量總體上均高于野生化血丹;梓醇在野生化血丹不同部位中的含量均高于栽培化血丹。

2.2 同一類型植株不同部位中桃葉珊瑚苷和梓醇含量分析

栽培植株根中桃葉珊瑚苷含量高于野生植株根中含量，栽培根中含量最高（0.930 mg·g-1），是其他部位的2.4～232.5倍，植株內(nèi)桃葉珊瑚苷含量表現(xiàn)為根>葉>混合樣>莖>花，部位間含量存在顯著性差異;栽培植株葉中梓醇含量低于野生植株葉中含量，栽培葉中含量（10.838 mg·g-1）是其他部位的5.9～69.5倍，栽培莖中未檢測到梓醇含量，各部位梓醇含量從高到低依次為葉>花>混合樣>根，部位間含量存在著顯著差異。野生植株中，桃葉珊瑚苷主要分布于根中，植株內(nèi)桃葉珊瑚苷含量表現(xiàn)為根>混合樣>莖>花>葉，根中含量最高（0.440 mg·g-1），比其他部位高22～88倍;植株內(nèi)梓醇含量表現(xiàn)為葉>混合樣>莖>花>根，且含量以葉中最高（11.095 mg·g-1），比其他部位高3.7～6.9倍，各部位間均存在顯著性差異。由以上結(jié)果可以看出桃葉珊瑚苷在化血丹植株體內(nèi)主要分布在地下部分根中，梓醇主要分布在地上部分的葉中，這對2種化學(xué)成分提取獲取原料部位有很好的參考（表2）。

桃葉珊瑚苷在栽培化血丹的根、莖、葉和混合樣中的含量均比在野生化血丹根、莖、葉和混合樣中高，其中以葉中差異最大，栽培葉中含量約是野生葉中的78倍;而在兩種類型的花中含量相近，都很微量。梓醇在野生化血丹的根、莖、葉、花和混合樣中的含量均比在栽培化血丹的相應(yīng)部位（莖未檢出）中高，其中以混合樣中差異最大，野生混合樣中含量約是栽培混合樣中的5倍;而兩種類型在葉和花中的含量約為1∶1。由以上結(jié)果可以得知栽培與野生化血丹除在個(gè)別部位存在桃葉珊瑚苷和梓醇含量差異較大外，總體上栽培（各部位2種化學(xué)成分總含量為15.255 mg·g-1）與野生化血丹（各部位2種化學(xué)成分總含量為21.875 mg·g-1） 植株內(nèi)桃葉珊瑚苷和梓醇含量分布差異不明顯，也在一定程度上說明栽培植株可以替代野生植株入藥（表2）。

3 討論與結(jié)論

3.1 測定有效成分和用藥合理部位的選擇

圍繞梓醇和桃葉珊瑚苷在神經(jīng)保護(hù)、降壓、預(yù)防心腦血管方面的作用成為領(lǐng)域研究熱點(diǎn)之一，如能將梓醇和桃葉珊瑚苷開發(fā)為具有抗帕金森、老年癡呆和治療白血病等方面的新藥應(yīng)用于臨床，將會有廣闊的前景。在玄參科、忍冬科、車前科、杜仲科等很多中藥植物中都含有一定量的梓醇和桃葉珊瑚苷，目前在歷版《中國藥典》中對藥材的質(zhì)量控制和評價(jià)多以環(huán)烯醚萜苷成分的梓醇作為指標(biāo)，同屬于玄參科植物的生地黃以梓醇和毛蕊花糖苷為主要質(zhì)量控制指標(biāo)，以梓醇和桃葉珊瑚苷同時(shí)作為質(zhì)量控制指標(biāo)的藥用植物未見報(bào)道;衛(wèi)生部《藥品標(biāo)準(zhǔn)》收錄的有些藥品已將桃葉珊瑚苷作為重要指標(biāo)之一來進(jìn)行質(zhì)量控制（如復(fù)方荔枝草顆粒劑生產(chǎn)中），云南民間常以根作為其藥用部位是否合理，其他部位是否也具有相應(yīng)的開發(fā)價(jià)值，從研究結(jié)果來看，以梓醇和桃葉珊瑚苷作為化血丹植物的指標(biāo)成分是可行的。

3.2 樣品來源數(shù)量和生長環(huán)境對研究結(jié)果的影響

桃葉珊瑚苷和梓醇均屬于環(huán)烯醚萜苷類化合物，在開發(fā)治療心腦血管藥物方面有很大的潛力，此試驗(yàn)中栽培植株葉中這2種化學(xué)成分的含量和比野生植株的含量約高1.15%（11.228 mg·g-1>11.1 mg·g-1），另外試驗(yàn)只分析比較了來源同一產(chǎn)地的栽培與野生不同部位中梓醇和桃葉珊瑚苷的含量差異，但不同生態(tài)環(huán)境對生物活性成分的有效積累影響較大，產(chǎn)生上述現(xiàn)象的原因可能是受自然生長條件的影響，使得同一產(chǎn)地不同生境條件下相同物種活性成分的含量也會出現(xiàn)一定的差異，其他產(chǎn)地和不同栽培條件下栽培與野生化血丹中梓醇和桃葉珊瑚苷的含量是否在植株內(nèi)符合本試驗(yàn)的研究結(jié)果，需要進(jìn)一步研究。

LIAO LP， 2014. Chemical constituents and antivities research of Centranthera grandiflora Benth? [D]. Shanghai： Shanghai University of Traditional Chinese Medicine： 5-7.? [廖立平， 2014. 化血丹化學(xué)成分與活性研究? [D]. 上海： 上海中醫(yī)藥大學(xué)： 5-7.]

LIAO LP， ZHANG ZJ， HU ZB， et al.， 2012. Iridoid glycosides from Centranthera grandiflora? [J]. Chin Trad Herb Drug， 43（12）： 2369-2371.? [廖立平， 張紫佳， 胡之壁， 等， 2012. 大花胡麻草環(huán)烯醚萜苷類化學(xué)成分研究? [J]. 中草藥， 43（12）： 2369-2371.]

LIU J， LING JY， 2004. Development of iridoids in recent years? [J]. Strait Pharm J， 28（8）： 987-993.

MA YM， GUO JH， TIAN CW， et al.， 2011. Determination of catalpol and aucubin in fresh Rehmannia glutinosa by HPLC? [J]. Chin Trad Herb Drug， 42（7）：1348-1351.? [馬運(yùn)明， 郭建華， 田成旺， 等， 2011. HPLC法測定鮮地黃中梓醇和桃葉珊瑚苷? [J]. 中草藥， 42（7）： 1348-1351.]

TONG SQ， CHEN L， ZHANG Q， et al.， 2015. Separation of catalpol from Rehmannia glutinosa Libosch. by highspeed countercurrent chromatography? [J]. J Chromatogr Sci， 53（5）： 725-729.

WANG JH， LIU K， WAN D， et al.， 2017. Study of anti-aging protective effect of catalpol on cultured cortical neurons from rats? [J]. Chin Pharmacol Bull， 33（12）：1696.? [王靜歡， 劉珂， 萬東， 等， 2017. 梓醇對大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的抗衰老保護(hù)作用研究? [J]. 中國藥理學(xué)通報(bào)， 33（12）：1696.]

WANG JH， ZOU L， WAN D， et al.， 2015. Research progress of catalpol on related signal pathways [J]. Chin Pharmacol Bull， 31（9）：1189-1194.? [王靜歡， 鄒利， 萬東， 等， 2015. 梓醇多效性相關(guān)信號通路研究進(jìn)展? [J]. 中國藥理學(xué)通報(bào)， 31（9）： 1189-1194.]

WANG Z， WANG Q， YAN JL， et al.， 2012. Chemical consti-tuents and antivities research of Centranthera grandiflora Benth? [C]. Kunming： Yunnan Pharmacy Conference： 1-4.? [王真， 王瓊， 閆俊嶺， 等， 2012. 大花胡麻草的化學(xué)成分及其活性研究? [C]. 昆明： 云南省藥學(xué)大會： 1-4.]

XUE HY， HAN Z， LI GK， et al.， 2013. The extraction of aucubin and the protective effects of aucubin in the oxidative cell damage? [J]. Chin J Spectr Labor， 30（5）：2202.? [薛宏宇， 韓震， 李光坤， 等， 2013. 桃葉珊瑚苷提取及對細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用? [J]. 光譜實(shí)驗(yàn)室， 30（5）： 2202-2205.]

XIA ZM， WANG FF， ZHOU S， et al.， 2017. Catalpol protects synaptic proteins from beta-amyloid induced neuron injury and improves cognitive functions in aged rats? [J]. Oncotarget， 8（41）： 69303-69315.

YANG HL， LAI SF， NONG HN， et al.， 2018. Simultaneous determination of three ingredients in Malus doumeri（Bois.）Chev by HPLC? [J]. Food Res Dev， 39（24）： 129-133.? [楊海玲， 賴少鳳， 農(nóng)海妮， 等， 2018. HPLC法同時(shí)測定廣山楂中3種活性成分含量? [J]. 食品研究與開發(fā)， 39（24）： 129-133.]

YANG SY， HAO GX， 2017. Study on anti-myocardial ischemia and anti-coagulation effect of Vicia faba root? [J]. Lishizhen Med Mat Med Res， 28（9）：2099-2103.? [楊抒雨， 侴桂新， 2017. 民族藥野蠶豆根抗心肌缺血和抗凝血作用研究? [J]. 時(shí)珍國醫(yī)國藥， 28（9）： 2099-2103.]

ZHANG JN， LIU KX， 2019. The research progress of catalpol? [J]. Dr Eval Res， （8）： 1680-1684.? [張江南， 劉克辛， 2019. 梓醇的研究進(jìn)展? [J]. 藥物評價(jià)研究， （8）： 1680-1684.]

（責(zé)任編輯 周翠鳴）