食管鱗癌組織中lncRNA UCA1 表達及其對癌細胞黏附和遷移影響

王獻　王海兵

[摘要] 目的 探討長鏈非編碼RNA（lncRNA）尿路上皮癌相關基因1（UCA1）在食管鱗癌中表達及其對癌細胞黏附和遷移影響。

方法 以我院接受手術治療的52例食管鱗癌病人作為研究對象，取原發灶處部分癌組織及距離原發灶邊緣3～5 cm的癌旁組織，檢測兩者lncRNA UCA1表達水平及其對食管癌細胞侵襲和遷移能力的影響。

結果 PCR檢測表明，原發灶癌組織的UCA1表達水平為（1.52±0.56） HU，癌旁組織為（0.95±0.36） HU，兩者比較差異有顯著性（t=6.174，P<0.01）。低表達UCA1基因能夠抑制食管鱗癌細胞Eca109、KYSE170的遷移能力和侵襲能力，過表達UCA1基因能促進食管鱗癌細胞TE1和TE13的遷移能力和侵襲能力，差異均有顯著性（F=133.00～1 252.32，P<0.01）。

結論 lncRNA UCA1能夠促進食管癌細胞侵襲和遷移，通過影響細胞周期而影響癌細胞的增殖。

[關鍵詞] 食管鱗狀細胞癌;RNA，長鏈非編碼;尿路上皮癌相關基因1;腫瘤侵潤;腫瘤轉移

[中圖分類號] R735.1;R342.2

[文獻標志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2020）03-0355-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.103

[開放科學（資源服務）標識碼（OSID）]

[網絡出版] http：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200528.0827.002.html;2020-05-28 11：45

EXPRESSION OF THE LONG NON-CODING RNA UROTHELIAL CARCINOMA ASSOCIATED 1 IN ESOPHAGEAL SQUAMOUS CELL CARCINOMA AND ITS EFFECT ON THE ADHESION AND MIGRATION OF CANCER CELLS

WANG Xian， WANG Haibing

（Department of Chest Surgery， Clinical Medical College， Henan University of Science and Technology （The First Aff-

iliated Hospital of Henan University of Science and Technology）， Luoyang 471000， China）

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the expression of the long non-coding RNA （lncRNA） urothelial carcinoma asso-

ciated 1 （UCA1） in esophageal squamous cell carcinoma and its effect on the adhesion and migration of cancer cells.

MethodsA total of 52 patients with esophageal squamous cell carcinoma who underwent surgical treatment in our hospital were enrolled as subjects. The cancerous tissue of primary lesion and the adjacent tissue 3-5 cm away from the edge of the primary lesion were collected to measure the expression of the lncRNA UCA1 and observe its effect on the invasion and migration abilities of esophageal cancer cells.

ResultsThe results of PCR showed that there was a significant difference in the expression of UCA1 between the tissue of primary lesion and the adjacent tissue （（1.52±0.56） HU vs （0.95±0.36） HU;t=6.174，P<0.01）. Low expression of UCA1 inhibited migration and invasion abilities of esophageal squamous cell carcinoma cells Eca109 and KYSE170， while overexpression of UCA1 promoted the migration and invasion abilities of esophageal squamous cell carcinoma cells TE1 and TE13 （F=133.00-1 252.32，P<0.01）.

ConclusionThe lncRNA UCA1 can promote the invasion and migration of esophageal cancer cells and affect cell proliferation by influencing cell cycle.

[KEY WORDS]esophageal squamous cell carcinoma; RNA， long noncoding; urothelial carcinoma associated 1; neoplasm invasiveness; neoplasm metastasis

食管癌發病是由多種因素共同作用的結果，隨著基因高通量測序技術的發展，長鏈非編碼RNA（lncRNA）被認為在多種癌癥發展中扮演重要角色[1-2]。已有研究結果表明，lncRNA參與人體細胞增殖、分化、轉移、凋亡等生物學活動，其在多種惡性腫瘤發展中也發揮作用[3-6]。尿路上皮癌相關基因1（UCA1）是癌癥調節耐藥基因，參與多種腫瘤的惡性發展[7-12]，如胃癌、肺癌、直腸癌等。UCA1是一種來源于人類內源性逆轉錄病毒（HERV-H）家族的lncRNA分子，其基因定位于人類第19號染色體（19p13.12），全長為1.4 kb。lncRNA UCA1最初在膀胱癌被發現，并能夠促進腫瘤細胞增殖和轉移[13]。目前，lncRNA UCA1在食管癌中表達及其作用研究報道較少。本文對lncRNA UCA1在食管鱗癌中表達及其對癌細胞黏附和遷移的調控進行分析，探討lncRNA UCA1用于食管鱗癌病人早期診斷及術后監測的臨床價值。現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2016年5月—2018年5月，收集在本院接受手術治療的52例食管鱗癌病人作為研究對象，男性28例，女性24例，年齡48～72歲，平均（62.8±7.6）歲。納入標準：所有病人均經術后組織病理檢查證實為食管鱗癌，手術前均未給予化療及放療處理。排除標準：肝腎功能異常、免疫缺陷、其他惡性腫瘤，以及并發高血壓、糖尿病等全身系統疾病者。該組病人均自愿接受手術，對本次研究均知情同意。本研究經過我院醫學倫理委員會批準。

1.2 儀器和試劑

1.2.1 主要儀器 全自動組織包埋機（日本櫻花集團）;光學顯微鏡（日本OLYMPUS公司）;實時熒光定量PCR（qRCR）儀（CFX96型，美國Bio-Rad公司）;Eppendorf Research移液器（德國Eppendorf公司）;臺式低溫超速離心機（德國Eppendorf公司）;-80 ℃冰箱（美國Thermo公司）;CO2培養箱（美國Thermo公司）等。

1.2.2 主要試劑 蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（索萊寶（中國）公司），Trizol試劑盒（美國Invitrogen公司），All-in-OneTM miRNA qRT-PCR Detection kit（美國Gene Copoeia公司），PCR擴增引物、DEPC水（生工生物工程（上海）技術有限公司），氯仿、異丙醇、無水乙醇（中國國藥集團），胎牛血清（德國PAN公司），2.5 g/L的胰蛋白酶、青霉素/鏈霉素注射液（新賽美生物科技有限公司），人食管鱗癌細胞系Eca109、KYSE170、KYSE150、KYSE9706、KYSE30、TE1和TE13（上海弘順生物科技有限公司），質粒si-uca1、si-nc和pc-dna-uca1（上海吉凱基因化學技術有限公司合成）。

1.3 實驗方法

1.3.1 標本獲取及處理 取病人原發灶處部分癌組織及距離原發灶邊緣3～5 cm正常組織。標本切除后立即分為兩部分：一部分在新鮮狀態下用RNA保存液保存以提取RNA;另一部分用40 g/L甲醛溶液固定，做成蠟塊保存，用于HE染色。

1.3.2 lncRNA UCA1表達的qPCR檢測 Trizol法提取總RNA，采用qPCR兩步法進行檢測。設計lncRNA UCA1引物，然后使用反轉錄試劑盒進行反轉錄得到cDNA，配制qPCR反應體系，設置反應程序（95 ℃預變性 10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s）進行qPCR擴增。通過軟件得到Ct值，單位為HU。

1.3.3 食管癌細胞遷移和侵襲實驗 采用劃痕試驗和Transwell侵襲實驗分別檢測UCA1基因對食管癌細胞遷移能力和侵襲能力的影響。構建表達載體并提取重組質粒，對重組質粒si-UCA1/pc-DNA UCA1進行鑒定，隨后進行大量的提取和純化，測定其濃度和純度，保存備用。將重組質粒進行轉染，轉染后提取RNA進行熒光定量驗證轉染效率。以腫瘤細胞膜著色判斷為陽性，根據陽性細胞數及陽性細胞染色強度判斷基因表達結果，其中≥3+為過表達，<3+為低表達。按操作說明進行劃痕試驗，在倒置顯微鏡下觀察劃痕后0、12、24 h的劃痕間距，計算細胞遷移率。根據操作說明進行Transwell侵襲實驗，計數透過人工基底膜的細胞數。

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行分析，計量資料數據以±s表示，計數資料以百分數表示。兩組間比較采用t檢驗和χ2檢驗，兩組以上比較采用F檢驗。以P<0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 癌組織和癌細胞UCA1表達

食管鱗癌組織和癌旁組織的HE染色見圖1。qPCR結果表明，原發灶癌組織中UCA1的Ct值為（1.52±0.56） HU，癌旁組織為（0.95±0.36） HU，兩者比較差異有顯著意義（t=6.174，P<0.01）。UCA1在人食管癌細胞系中的相對表達量分別為：Eca109（0.61±0.08）、KYSE170（0.52±0.11）、KYSE150（0.31±0.05）、KYSE9706（0.29±0.19）、KYSE30（0.28±0.18）、TE1（0.21±0.11）和TE13（0.22±0.12），均明顯高于正常食管上皮細胞NE1（0.07±0.03），差異具有統計學意義（F=107.26，P<0.01）。并且Eca109、KYSE170細胞中UCA1表達相對較高，而在TE1和TE13細胞中UCA1的表達較其他細胞系低。因此，選擇代表性的食管癌細胞系Eca109、KYSE170、TE1和TE13進行后續相關的研究。

2.2 UCA1表達對食管癌細胞遷移影響

在12和24 h細胞的劃痕間距百分比結果表明，與Eca109及KYSE170細胞比較，過表達UCA1基因明顯抑制食管癌細胞系TE1和TE13遷移能力，差異有統計學意義（F=187.38～243.88，P<0.01）;與TE1和TE13細胞比較，低表達UCA1基因能夠明顯促進食管癌細胞系Eca109和KYSE170的遷移能力，差異也有統計學意義（F=133.00～1 252.32，P<0.01）。見表1。

2.3 UCA1表達對食管癌細胞侵襲影響

UCA1過表達的TE1和TE13細胞能夠透過人工基底膜的數量明顯高于Eca109和KYSE170，差異有統計學意義（F=1 388.68，P<0.01）。提示UCA1基因的過度表達顯著促進了TE1和TE13食管癌細胞系的侵襲性。UCA1低表達的Eca109和KYSE170細胞透過人工基底膜的數量明顯低于TE1和TE13，差異有統計學意義（F=426.20，P<0.01）。提示UCA1基因的低表達顯著抑制了食管癌細胞系Eca109和KYSE170的侵襲性。見表2。

3 討論

lncRNAs能夠在表觀遺傳學、轉錄調控和轉錄后調控等不同水平上調控基因表達。國外的研究結果顯示，lncRNAs的異常表達在各種惡性腫瘤的發生過程中起著重要作用[14-17]。腫瘤的發生是原癌基因激活、抑癌基因失活和細胞的永生化等過程所致，正常細胞有完善調控系統使有抑癌作用和致癌作用lncRNAs處于動態平衡，而在腫瘤細胞中這種平衡被打破。研究顯示，UCA1在多種腫瘤的發生中發揮作用，如胃癌、胰腺癌和宮頸癌等[18-21]。

本文對UCA1在食管鱗癌中的表達水平及其對腫瘤細胞的遷移、黏附調控作用進行探討。qPCR結果表明，原發灶癌組織中UCA1的Ct值明顯高于癌旁非腫瘤組織，說明腫瘤組織中的UCA1表達水平明顯升高，這與已有報道結果相符[22-24]。說明UCA1與食管癌的發生有一定關系，提示UCA1有可能作為食管癌的腫瘤標志物。

腫瘤細胞發生侵襲和轉移涉及細胞外基質的降解和上皮細胞-間充質轉化（EMT），細胞間黏附破壞對上皮可塑性的維持非常重要，該過程由鈣黏蛋白介導，這已被證實是癌癥的最初事件[25]。在腫瘤的發展過程中，細胞黏附破壞是一個重要的侵襲和轉移事件。本文對UCA1表達在食管鱗癌細胞侵襲和遷移中的影響進行觀察，研究結果顯示，低表達UCA1可抑制Eca109和KYSE170細胞遷移能力，過表達UCA1促進了TE1和TE13細胞遷移能力;低表達UCA1抑制了Eca109和KYSE170細胞的侵襲能力，過表達UCA1促進了TE1和TE13細胞侵襲能力。這表明過表達的UCA1可以促進食管鱗癌細胞的遷移、侵襲能力，反之，干擾UCA1則起到相反的作用。國外通過流式細胞術分析顯示，低表達UCA1基因可以上調EMT相關轉錄因子E-cadherin的表達，下調N-cadherin、Snail和Vimentin的表達，抑制食管癌細胞的遷移和侵襲能力;過表達UCA1基因可以下調EMT相關轉錄因子E-cadherin的表達，上調N-cadherin、Snail和Vimentin的表達，促進食管癌細胞的遷移和侵襲能力[26]。

綜上所述，lncRNA UCA1在食管鱗癌呈高表達水平，促進食管癌細胞侵襲和遷移能力，抑制了食管癌細胞凋亡。本研究同時也證實，血清lncRNA UCA1可作為食管鱗癌病人診斷的新型潛在的循環腫瘤標志物，值得臨床推廣應用。

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（本文編輯 于國藝）

[收稿日期]2019-08-27; [修訂日期]2020-04-17

[基金項目]河南省醫學科技攻關計劃項目（201603169）

[第一作者]王獻（1982-），男，碩士，主治醫師。

[通信作者]王海兵（1965-），男，碩士，主任醫師，E-mail：wangsihanvv@163.com。