基因組DNA羥甲基電致化學發光生物傳感研究進展

張銀冰

摘 ?要：電致化學發光分析法兼有電化學和化學發光分析法的雙重優勢，具有靈敏度高、線性范圍寬、反應可控性強、背景干擾小、選擇性好和儀器簡單等優點，己經被廣泛應用于生物分子的檢測以及疾病的診斷等方面。生物傳感器是由生物識別元件和物理化學信號傳感系統組成的分析設備，可方便地進行生物分析檢測。本論文對基因組DNA羥甲基電致化學發光生物傳感研究進展現狀，進行了綜述。

關鍵詞：基因組;DNA羥甲基化;電化學發光;生物傳感器

電化學發光（Electrochemiluminescence），它不但有著英文縮寫名稱，還有另外一個名為電致化學發光（Electrogeneratedchemiluminescence）名稱。ECL是將電壓以及電流經過電極施加到化學發光物質上促進某種新物質的衍生，該物質和發光物質會產生反應，供應充足的能量來改變發光物質的狀態，讓其從原本的基態變成了后來的激發態，在重新回到基態，經過這樣的改變，給發光供應足夠的能量;亦或是將電壓以及電流經過電極的方式供應能量，讓發光物質可以產生氧化還原反應，讓中間態物質在不穩定的狀態下出現分解，供應能量促使發光。[1]所以，利用酶切來刪掉甲基基團，這是不可缺少的。這一點也是生物學家最關注的問題。人體內的細胞有時為了再次分化，或許會對已經分化后的細胞再一次進行分化，一直分化到最低的狀態為止，這個過程就是刪除甲基化的環節，分析這個過程，對于醫療運用來說有著難以言喻的價值。

1DNA羥甲基化

1948年人們第一次從人類DNA中識別出了被稱為DNA“第五個堿基”的5-甲基胞嘧啶（5-mC）。在真核生物中，DNA甲基化是在C-5位的胞嘧啶環上添加一個甲基后形成的。這個過程是在被稱為“CpG島”的y-CG-3^？列中經DNA甲基轉移酶催化后發生的。5-mC是最常見的真核生物DNA修飾，也是許多表觀遺傳（只改變基因表達，而不改變核苷酸序列）現象的一種。[2]雖然甲基化DNA在植物和哺乳動物中分布廣泛，但在一些真核生物，比如果蠅和釀酒酵母中并未檢測到甲基化DNA^-84〗。于是，人們開始懷疑其在正常發育和特異性基因表達中的重要性。然而，最近的研宂表明，在敲除轉基因小鼠中對DNA甲基化起重要作用的DNA甲基轉移酶基因后，小鼠發育異常和胚胎致死的表達水平仍然下降，這就消除了人們之前的懷疑。[3]

DNA甲基化整體調控中的一個關鍵步驟是DNA去甲基化。用甲基敏感性內切酶監測DNA甲基化水平后發現，在胚胎發育過程中，移植前的胚胎甲基化水平很低之后許多CPG島殘基發生再甲基化，但在移植時，剩余的CpG島并未發生甲基化。胚胎植入后，許多DNA被甲基化，而組織特異性（Tissue-specific）基因在其相應的表達組織中卻發生去甲基化。因此，對于生物的整個基因組DNA來甲基化模式是表觀遺傳信息的重要組成部分，是區分細胞的重要標記物。5-甲基胞嘧啶（5-mC）通常被認為是DNA的“第五個堿基”。在受精和胚胎發育后，大量輸甲基化標記物被刪除這使得胚胎干細胞能分化成任何可能的專職細胞。在某些情況下，DNA的去甲基化發生時沒有細胞分裂，也就沒有合成新的DNA。因此，甲基基團必須通過酶切主動地去除。主動去甲基化機制是人們最感興趣的，因為一些細胞為了重新分化，有可能主動進行DNA去甲基化換句話說，將己經分化的細胞進行再分化，轉變為更低分化狀態的過程，就是主動去甲基化，這在醫療應用方面由很大的研究價值。說，肯定存在一種去除DNA中甲基胞嘧啶的方式。

2電致化學發光

最近幾年，由于電化學發光檢測技術的優勢不斷的顯露，人們開始重視電化學發光檢測方式的運用，比如，其有著較高的靈敏性，操作流程簡單、反應迅速、節省試劑等。這些都是電化學發光檢測技術最顯著的優點，它的出現促進了生物分析的發展，大大的提升了檢測生物分子的效率和質量，并且日漸普遍。一直以來，生物學家都在尋找研究DNA去甲基轉移酶活性的問題，也有不少的生物學家來不斷的檢測羥甲基化DNA，自從電化學發光檢測技術衍生后，生物學家找到來一個合適的分析和檢測平臺。

電致化學發光（ECL）分析法無論是從電化學的角度來說亦或是從化學發光分析法的角度來說，都是有著顯著的優勢的，它有著較高的靈敏性，反應快，范圍廣，干擾性低，好選擇以及操作便利等等，這些都對研究有著很大的幫助。如今，電致化學發光（ECL）分析法在醫療領域開始普遍使用，其中運用最多的就是檢測生物分子，診斷患者的病情等等，可是學者對ECL分析法分析的成果不多，特別是檢測5-hmC更是少之又少。

3電化學發光DNA生物傳感器

生物傳感中的傳感系統涉及各種檢測器，如壓電，光學，電化學，電化學發光等。生物傳感方法近幾十年來蓬勃發展，為臨床早期診斷帶來了重大突破。商業化和臨床應用的生物傳感器應該具有穩定、快速、高靈敏和廉價的特點。在對生物傳感有貢獻的技術中，電化學發光由于具有電勢可控和靈敏度高的雙重優勢，引起了人們的廣泛關注。電化學發光生物傳感是將特異性識別物質如抗體、酶、DNA等固定在電極上而組成的分析元件，通過目標分析物結合前后電化學發光強度的變化來進行定量檢測，廣泛應用于生物分析，免疫分析，食品安全和環境監測等。其中，DNA是生物體遺傳信息的主要載體，引導生物發育與生命機能運作，電化學發光DNA生物傳感器結合了生物識別的特異性及ECL的高靈敏性，為DNA分析提供了一種很有前景的方法，越來越多的研究者致力于電化學發光DNA生物傳感的研究。

許多DNA檢測體系基于目標DNA與其互補探針的雜交，Li等報道了一種電化學發光生物傳感方法檢測DNA甲基化，該方法結合酶聯反應實現了對DNA甲基化水平的高靈敏檢測。[5]然而，該方法需要對目標分析物進行標記，使得分析過程比較復雜。Zhang等使用發夾DNA作為識別元件，以釕復合物作為信號物質，構建了一種用于檢測靶單鏈DNA（ss-DNA）的高選擇性ECL生物傳感器。該ECL方法具有較高的靈敏度和很好的選擇性，并且不需要對目標分析物進行記。[6]

結束語

電化學發光分析法結合了發光分析高靈敏度和電化學電位可控等優點，引起了諸多分析化學工作者的關注。電化學發光生物傳感器是將特異性分子識別物質如酶、抗體或DNA等生物分子作為分子識別物質固定在換能器上，以電化學發光信號為檢測信號的分析器件，其具有靈敏度髙、線性范圍寬、反應可控性強、成本低廉、分析速度快、操作簡單和易于微型化與集成化等優點，己經被用于一些疾病相關的生物標志物檢測。但是目前一些低水平的生物標志物檢測仍然是電化學發光生物傳感器面臨的一大挑戰。近年來，具有優異性質的不同結構、組成和形貌的納米材料的引入促進了電化學發光生物傳感器的發展，大大提髙了其檢測的靈敏度和選擇性。

參考文獻

[1] ?馬鼻肺炎病毒進化分析及DNA條形碼的確定[J].鄭小龍，王群，孫明君，孫濤，朱來華，梁成珠，岳志芹.中國獸醫學報.2017（02）

[2] ?DNA步行者分子機器研究新進展[J].汪晶，王東霞，馬嘉懿，孔德明.中國科學：化學.2019（05）

[3] ?1種簡單有效的根際土壤微生物DNA提取方法[J].鄭道君，張冬明，吉清妹，史珍萍，符傳良.江蘇農業科學.2017（04）

[4] ?DNA：FromCarrierofGeneticInformationtoPolymericMaterials[J].JiaojiaoZhang，FengLi，DayongYang.TransactionsofTianjinUniversity.2019（04）

[5] ?超聲波細胞粉碎機在高通量測序片段化DNA中的應用[J].李根亮，盧舒雨，許苡僥，黃捷，黃曉敏，肖娟，農嵩.右江民族醫學院學報.2016（05）

[6] ?DNA雙螺旋結構探尋路上競爭中的合作[J].張翮.自然辯證法通訊.2017（03）

基金項目：國家自然科學基金項目（No.21575109）