線粒體丙酮酸載體在肝細胞癌中的表達及臨床意義

馬向明 侯婧悅 付慶江 曹立瀛

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是致死率最高的惡性腫瘤之一[1,2]。HCC同時存在糖酵解代謝的增強和糖異生功能的減弱，促進糖異生可以拮抗糖酵解并有效的抑制HCC的生長[3]。線粒體丙酮酸載體(mitochondrial pyruvate carriers, MPC)在細胞代謝過程中負責丙酮酸自細胞質向線粒體基質內轉運的作用，因此，在HCC的發生和發展過程中可能起到關鍵的作用[4]。本研究分析了MPC在HCC及癌旁組織中的表達及其對預后影響。為MPC功能障礙或缺失分子機制的研究提供理論依據。

資料與方法

一、病例選擇

收集天津醫科大學腫瘤醫院2011年1月至2012年12月經手術切除同時病理學證實為HCC的85例患者的臨床及病理學資料。選擇標準：①HCC手術根治性切除；②無肝外或遠處轉移；③術前未行介入、放療、無水酒精注射等治療。一般資料包括：性別、年齡；臨床數據包括： ALT、AST、AFP、TBil、Alb、凝血酶原時間(PT)、PLT、巴塞羅那分期(BCLC)；病理學資料包括：腫瘤大小、腫瘤數量、腫瘤分化程度、微血管侵潤情況、微小轉移情況。所有患者標本的獲取都經天津醫科大學腫瘤醫院倫理委員會同意，手術前取得患者的同意并簽署知情同意書。

二、隨訪

隨訪截止日期為2015年11月。從手術當天開始計算生存時間和至復發時間。通過門診、電話、查閱病歷資料等方式進行隨訪。術后隨訪復發時間和死亡時間。

三、免疫組化分析

將85例患者的肝癌和癌旁組織分別進行MPC1和MPC2的免疫組化分析后，在正置顯微鏡下觀察并拍照。每張免疫組化的顯微照片均通過Image-Pro Plus軟件進行掃描，獲得累積吸光度(A)和面積(area)。通過計算得出平均吸光度(density mean)，平均吸光度為累積吸光度和累積面積比值(density mean = IA sum/areasum)。得出的平均吸光度與目標蛋白量成正比，因此可反映出目標蛋白的表達量[5]。

四、統計學分析

結 果

一、肝癌組織中MPC1和MPC2的表達

免疫組織化學法分析85例患者術后的癌組織和癌旁組織病理學切片，結果顯示：癌組織中的MPC1和MPC2表達水平均顯著低于癌旁組織。見圖1。

二、肝癌組織中MPC1及MPC2的表達水平與病理學指標的相關性

將MPC1和MPC2高低表達組的臨床病理學指標進行了統計學分析。結果顯示：肝癌組織中MPC1及MPC2的蛋白表達水平與患者性別、年齡、ALT、AST、AFP、TBil、Alb、PT、PLT、巴塞羅那(BCLC)分期、腫瘤大小、腫瘤數量、腫瘤分化程度、微血管侵潤、微小轉移等因素均無相關性(均P>0.05)。見表1。

三、肝癌組織中MPC1表達降低是肝癌患者術后復發的獨立危險因素

在單因素分析中，巴塞羅那分期、腫瘤最大直徑>5 cm、微血管侵潤和MPC1低表達為肝細胞肝癌術后復發的危險因素。多因素分析結果顯示，微血管侵潤和MPC1為肝細胞肝癌術后復發的獨立危險因素；而MPC2表達水平與患者術后復發無相關性。見表2。

圖1 肝細胞肝癌患者肝組織中的線粒體丙酮酸載體(MPC1)和(MPC2)的表達顯著降低免疫組織化學

表1 肝癌組織中MPC1及MPC2的表達水平與臨床病理學指標的相關性

指標MPC1高表達(n=43)低表達(n=42)P值MPC2高表達(n=43)低表達(n=42)P值年齡(歲,x±s) 54.8±9.554.7±11.20.42655.7±10.953.9±9.80.386性別(男/女,例)33/1037/50.25533/937/60.407ALT(U/L, x±s)37.4±25.537.0±19.00.13134.1±21.737.2±23.10.626AST(U/L, x±s)40.6±27.137.6±27.00.86439.5±32.137.8±21.40.507TBil(μmol/L, x±s)17.0±10.019.6±12.90.99919.6±14.217.2±8.20.120Alb(g/L, x±s)46.3±4.143.5±6.60.18744.0±6.645.8±4.40.431PT (s, x±s)11.2±1.111.8±3.10.29611.7±3.211.4±1.20.441PLT(×109/L, x±s)158.0±69.8167.9±48.90.473162.6±80.4163.6±69.10.411AFP(ng/mL) >200 16151714 ≤200 27271.00025290.504BCLC 分期 0～A23151820 B～C20270.12824230.828腫瘤數量 135393638 >1 830.195650.757最大直徑(cm) >516212017 ≤5 27210.27822260.515最小直徑(cm) >319242221 ≤3 24180.28120220.829分化程度 低16131415 中、高 27290.64928281.000微血管侵潤 有23252325 無20170.66319180.828微小轉移 有14181716 無29240.37526270.824

表2 單因素及多因素分析肝癌術后復發的危險因素

四、肝癌組織中MPC1表達水平與患者預后的相關性

將高表達MPC1組和低表達MPC1組患者的隨訪結果進行Kaplan-Meier生存分析，結果顯示：MPC1表達水平降低明顯增加了HCC患者術后復發的可能性，在MPC1的高表達組與低表達組中，3年無瘤生存率分別為55.8%和21.4%；在MPC1的高表達組與低表達組中，3年總體生存率分別為78.6%和41.9%。見圖2。

五、肝癌組織中MPC2蛋白表達水平與肝癌患者預后的相關性

Kaplan-Meier生存分析結果顯示：在MPC2的高表達組與低表達組中，MPC2的蛋白表達水平與肝細胞肝癌患者術后3年無瘤生存率及術后3年總體生存率均差異無統計學意義，P值分別為0.254和0.452。見圖3。

圖2 MPC1表達水平與肝細胞肝癌患者術后無瘤生存率及總體生存率的關系

圖3 MPC2表達水平與肝細胞肝癌患者術后無瘤生存率及總體生存率的關系

討 論

癌細胞代謝的改變對腫瘤的生長至關重要，而其他的腫瘤生物學特征都與線粒體的代謝作用存在聯系[6]。丙酮酸代謝異常是腫瘤細胞能量代謝的關鍵，MPC位于糖酵解和線粒體丙酮酸代謝的交叉點，因此，MPC在腫瘤細胞的代謝改變方面發揮著重要作用[7-11]。

在MPC的蛋白組成和身份被鑒定出來后，發現MPC1、MPC2在多數腫瘤中的表達不一致[12-14]。最近的研究結果顯示，MPC1和MPC2在前列腺癌中均表現為低表達，且都與預后呈正相關，其表達的缺失會導致腫瘤細胞更具有侵略性[15]。本研究結果顯示，在肝癌組織中MPC1及MPC2的表達水平均顯著低于癌旁組織，揭示了癌組織內MPC功能障礙可能與HCC糖異生功能下降及糖酵解代謝增強有關。通過進一步的分析發現，MPC1的蛋白表達水平對HCC患者的預后有重要影響，即MPC1表達水平低的HCC患者術后復發率升高且總體生存時間縮短。單因素及多因素分析也顯示MPC1表達水平下降是HCC患者術后復發的獨立危險因素。而MPC2的蛋白表達水平雖然和MPC1同比例下降，但并不能判斷患者的預后。因此，MPC1蛋白的表達水平可作為評價HCC患者預后的指標。分析MPC1和MPC2的表達水平與臨床病理學指標的相關性發現，MPC1和MPC2的蛋白表達水平與這些指標均無明顯相關性，可能與以下因素有關：①納入的病例數少(僅85例)；②選擇的臨床病理學指標和腫瘤細胞的能量代謝無關；③一些可能有關的臨床病理學指標本并未納入。由于對MPC的分子身份認識較晚，目前對于MPC在惡性腫瘤發生發展中的重要性及其調控機制方面的研究較少，仍需要進一步深入研究[7]。

綜上所述，肝細胞線粒體含量最豐富的細胞之一，同時負責肝臟糖異生功能。基于MPC功能障礙或缺失在惡性腫瘤中的普遍性及其在調節細胞內丙酮酸代謝過程和調控能量代謝的關鍵作用，進一步的積極探索和研究腫瘤細胞能量代謝異常中調控MPC活性的相關分子機制，并尋找有效的解決方案，將為抑制惡性腫瘤的轉移和復發的抗癌藥物研發提供新的思路。