線粒體丙酮酸載體在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義

馬向明 侯婧悅 付慶江 曹立瀛

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是致死率最高的惡性腫瘤之一[1,2]。HCC同時(shí)存在糖酵解代謝的增強(qiáng)和糖異生功能的減弱，促進(jìn)糖異生可以拮抗糖酵解并有效的抑制HCC的生長(zhǎng)[3]。線粒體丙酮酸載體(mitochondrial pyruvate carriers, MPC)在細(xì)胞代謝過程中負(fù)責(zé)丙酮酸自細(xì)胞質(zhì)向線粒體基質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的作用，因此，在HCC的發(fā)生和發(fā)展過程中可能起到關(guān)鍵的作用[4]。本研究分析了MPC在HCC及癌旁組織中的表達(dá)及其對(duì)預(yù)后影響。為MPC功能障礙或缺失分子機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。

資料與方法

一、病例選擇

收集天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院2011年1月至2012年12月經(jīng)手術(shù)切除同時(shí)病理學(xué)證實(shí)為HCC的85例患者的臨床及病理學(xué)資料。選擇標(biāo)準(zhǔn)：①HCC手術(shù)根治性切除；②無肝外或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；③術(shù)前未行介入、放療、無水酒精注射等治療。一般資料包括：性別、年齡；臨床數(shù)據(jù)包括： ALT、AST、AFP、TBil、Alb、凝血酶原時(shí)間(PT)、PLT、巴塞羅那分期(BCLC)；病理學(xué)資料包括：腫瘤大小、腫瘤數(shù)量、腫瘤分化程度、微血管侵潤(rùn)情況、微小轉(zhuǎn)移情況。所有患者標(biāo)本的獲取都經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)同意，手術(shù)前取得患者的同意并簽署知情同意書。

二、隨訪

隨訪截止日期為2015年11月。從手術(shù)當(dāng)天開始計(jì)算生存時(shí)間和至復(fù)發(fā)時(shí)間。通過門診、電話、查閱病歷資料等方式進(jìn)行隨訪。術(shù)后隨訪復(fù)發(fā)時(shí)間和死亡時(shí)間。

三、免疫組化分析

將85例患者的肝癌和癌旁組織分別進(jìn)行MPC1和MPC2的免疫組化分析后，在正置顯微鏡下觀察并拍照。每張免疫組化的顯微照片均通過Image-Pro Plus軟件進(jìn)行掃描，獲得累積吸光度(A)和面積(area)。通過計(jì)算得出平均吸光度(density mean)，平均吸光度為累積吸光度和累積面積比值(density mean = IA sum/areasum)。得出的平均吸光度與目標(biāo)蛋白量成正比，因此可反映出目標(biāo)蛋白的表達(dá)量[5]。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、肝癌組織中MPC1和MPC2的表達(dá)

免疫組織化學(xué)法分析85例患者術(shù)后的癌組織和癌旁組織病理學(xué)切片，結(jié)果顯示：癌組織中的MPC1和MPC2表達(dá)水平均顯著低于癌旁組織。見圖1。

二、肝癌組織中MPC1及MPC2的表達(dá)水平與病理學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性

將MPC1和MPC2高低表達(dá)組的臨床病理學(xué)指標(biāo)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果顯示：肝癌組織中MPC1及MPC2的蛋白表達(dá)水平與患者性別、年齡、ALT、AST、AFP、TBil、Alb、PT、PLT、巴塞羅那(BCLC)分期、腫瘤大小、腫瘤數(shù)量、腫瘤分化程度、微血管侵潤(rùn)、微小轉(zhuǎn)移等因素均無相關(guān)性(均P>0.05)。見表1。

三、肝癌組織中MPC1表達(dá)降低是肝癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素

在單因素分析中，巴塞羅那分期、腫瘤最大直徑>5 cm、微血管侵潤(rùn)和MPC1低表達(dá)為肝細(xì)胞肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素。多因素分析結(jié)果顯示，微血管侵潤(rùn)和MPC1為肝細(xì)胞肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；而MPC2表達(dá)水平與患者術(shù)后復(fù)發(fā)無相關(guān)性。見表2。

圖1 肝細(xì)胞肝癌患者肝組織中的線粒體丙酮酸載體(MPC1)和(MPC2)的表達(dá)顯著降低免疫組織化學(xué)

表1 肝癌組織中MPC1及MPC2的表達(dá)水平與臨床病理學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性

指標(biāo)MPC1高表達(dá)(n=43)低表達(dá)(n=42)P值MPC2高表達(dá)(n=43)低表達(dá)(n=42)P值年齡(歲,x±s) 54.8±9.554.7±11.20.42655.7±10.953.9±9.80.386性別(男/女,例)33/1037/50.25533/937/60.407ALT(U/L, x±s)37.4±25.537.0±19.00.13134.1±21.737.2±23.10.626AST(U/L, x±s)40.6±27.137.6±27.00.86439.5±32.137.8±21.40.507TBil(μmol/L, x±s)17.0±10.019.6±12.90.99919.6±14.217.2±8.20.120Alb(g/L, x±s)46.3±4.143.5±6.60.18744.0±6.645.8±4.40.431PT (s, x±s)11.2±1.111.8±3.10.29611.7±3.211.4±1.20.441PLT(×109/L, x±s)158.0±69.8167.9±48.90.473162.6±80.4163.6±69.10.411AFP(ng/mL) >200 16151714 ≤200 27271.00025290.504BCLC 分期 0～A23151820 B～C20270.12824230.828腫瘤數(shù)量 135393638 >1 830.195650.757最大直徑(cm) >516212017 ≤5 27210.27822260.515最小直徑(cm) >319242221 ≤3 24180.28120220.829分化程度 低16131415 中、高 27290.64928281.000微血管侵潤(rùn) 有23252325 無20170.66319180.828微小轉(zhuǎn)移 有14181716 無29240.37526270.824

表2 單因素及多因素分析肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素

四、肝癌組織中MPC1表達(dá)水平與患者預(yù)后的相關(guān)性

將高表達(dá)MPC1組和低表達(dá)MPC1組患者的隨訪結(jié)果進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析，結(jié)果顯示：MPC1表達(dá)水平降低明顯增加了HCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)的可能性，在MPC1的高表達(dá)組與低表達(dá)組中，3年無瘤生存率分別為55.8%和21.4%；在MPC1的高表達(dá)組與低表達(dá)組中，3年總體生存率分別為78.6%和41.9%。見圖2。

五、肝癌組織中MPC2蛋白表達(dá)水平與肝癌患者預(yù)后的相關(guān)性

Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示：在MPC2的高表達(dá)組與低表達(dá)組中，MPC2的蛋白表達(dá)水平與肝細(xì)胞肝癌患者術(shù)后3年無瘤生存率及術(shù)后3年總體生存率均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值分別為0.254和0.452。見圖3。

圖2 MPC1表達(dá)水平與肝細(xì)胞肝癌患者術(shù)后無瘤生存率及總體生存率的關(guān)系

圖3 MPC2表達(dá)水平與肝細(xì)胞肝癌患者術(shù)后無瘤生存率及總體生存率的關(guān)系

討 論

癌細(xì)胞代謝的改變對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)至關(guān)重要，而其他的腫瘤生物學(xué)特征都與線粒體的代謝作用存在聯(lián)系[6]。丙酮酸代謝異常是腫瘤細(xì)胞能量代謝的關(guān)鍵，MPC位于糖酵解和線粒體丙酮酸代謝的交叉點(diǎn)，因此，MPC在腫瘤細(xì)胞的代謝改變方面發(fā)揮著重要作用[7-11]。

在MPC的蛋白組成和身份被鑒定出來后，發(fā)現(xiàn)MPC1、MPC2在多數(shù)腫瘤中的表達(dá)不一致[12-14]。最近的研究結(jié)果顯示，MPC1和MPC2在前列腺癌中均表現(xiàn)為低表達(dá)，且都與預(yù)后呈正相關(guān)，其表達(dá)的缺失會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞更具有侵略性[15]。本研究結(jié)果顯示，在肝癌組織中MPC1及MPC2的表達(dá)水平均顯著低于癌旁組織，揭示了癌組織內(nèi)MPC功能障礙可能與HCC糖異生功能下降及糖酵解代謝增強(qiáng)有關(guān)。通過進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)，MPC1的蛋白表達(dá)水平對(duì)HCC患者的預(yù)后有重要影響，即MPC1表達(dá)水平低的HCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)率升高且總體生存時(shí)間縮短。單因素及多因素分析也顯示MPC1表達(dá)水平下降是HCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。而MPC2的蛋白表達(dá)水平雖然和MPC1同比例下降，但并不能判斷患者的預(yù)后。因此，MPC1蛋白的表達(dá)水平可作為評(píng)價(jià)HCC患者預(yù)后的指標(biāo)。分析MPC1和MPC2的表達(dá)水平與臨床病理學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，MPC1和MPC2的蛋白表達(dá)水平與這些指標(biāo)均無明顯相關(guān)性，可能與以下因素有關(guān)：①納入的病例數(shù)少(僅85例)；②選擇的臨床病理學(xué)指標(biāo)和腫瘤細(xì)胞的能量代謝無關(guān)；③一些可能有關(guān)的臨床病理學(xué)指標(biāo)本并未納入。由于對(duì)MPC的分子身份認(rèn)識(shí)較晚，目前對(duì)于MPC在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要性及其調(diào)控機(jī)制方面的研究較少，仍需要進(jìn)一步深入研究[7]。

綜上所述，肝細(xì)胞線粒體含量最豐富的細(xì)胞之一，同時(shí)負(fù)責(zé)肝臟糖異生功能。基于MPC功能障礙或缺失在惡性腫瘤中的普遍性及其在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)丙酮酸代謝過程和調(diào)控能量代謝的關(guān)鍵作用，進(jìn)一步的積極探索和研究腫瘤細(xì)胞能量代謝異常中調(diào)控MPC活性的相關(guān)分子機(jī)制，并尋找有效的解決方案，將為抑制惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的抗癌藥物研發(fā)提供新的思路。