富含血小板血漿修復小鼠皮膚組織缺損創面的實驗研究

劉思婧，張瀟，李益，羅茂，吳劍波，李蓉△

皮膚是人體內外環境的屏障，大面積燒傷、創傷、腫瘤切除手術等均會導致皮膚及其軟組織缺損，目前針對皮膚損傷的治療方法主要是皮膚移植，但是對于大面積皮膚缺損的患者，由于其自身皮源不足，使得創面治療非常困難［1］。富含血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）是靜脈血經2 次梯度離心得到的血小板濃縮物［2］，其可在CaCl2、凝血酶等激活劑作用下形成凝膠，釋放多種高濃度促進組織再生修復的生長因子。因PRP 來源于自體，可刺激組織再生和早期愈合，不會致畸和誘發腫瘤［3］。本研究旨在通過建立小鼠皮膚創傷模型，觀察PRP 不同處理方式對皮膚創傷愈合的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 清潔級健康雄性C57BL/6J 小鼠27 只，10周齡，體質量（27.48±1.20）g，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司（第一批購買15 只，第二批購買12 只）。所有小鼠飼養條件為晝夜各12 h 循環照明，溫度（22±3）℃，濕度（34±5）%，自由攝食和飲水。實時熒光定量PCR（quantitative realtime PCR，qRT-PCR）逆轉錄試劑盒購自日本TaKaRa 株式會社，Ⅰ型膠原α1 鏈（collagen type Ⅰ alpha 1 chain，COL1A1）、Ⅲ型膠原α1 鏈（collagen type Ⅲ alpha 1 chain，COL3A1）、轉化生長因子-β1（transforming growth factor-beta 1，TGF-β1）、血小板源性生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、PCR引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司，凝血酶購自Sigma 公司（美國），Ⅰ型膠原免疫熒光抗體（abcam，ab34710），Ⅲ型膠原免疫熒光抗體（abcam，ab7778），羊抗兔IgG二抗購自艾博抗（上海）貿易有限公司，無水CaCl2購自國藥集團化學試劑有限公司。低溫高速離心機（德國Thermo公司），熒光定量PCR 儀（美國BioRad 公司），熒光倒置相差顯微鏡（美國AMG公司），萊卡顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立 取15只小鼠，用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，背部脫毛，脫毛完成后俯臥位固定在手術操作臺上，將剔除毛發的背部皮膚用乙醇消毒后，再用生理鹽水對背部皮膚進行擦拭，提拉皮膚中線，用直徑為5 mm的小圓刀切除全層皮膚至肌層表面，形成皮膚軟組織缺損創面。隨后將15只小鼠根據隨機數字表法分為3組，每組5只，依次為：（1）對照組。在圓形創緣按等距的6點皮下注射生理鹽水，每個注射點中注入0.1 mL，每只共計注射0.6 mL。（2）PRP 注射組。在圓形創緣按等距的6 點進行皮下注射PRP，每個注射點中注入0.1 mL，每只共計注射0.6 mL。（3）PRP 凝膠組。每只準備0.6 mL PRP，激活成凝膠覆蓋于創面。術后使用棉簽止血及油性紗布包扎，將各組小鼠單籠飼養，3 d后去除創面油性紗布，且未再給予藥物。

1.2.2 PRP凝膠的制備 1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉剩余的12只小鼠，用預先裝有0.1 mL ACD-A抗凝劑的1 mL注射器經腹腔靜脈取血后，立即注入1.5 mL EP 管中，暫存于4 ℃的冰箱中。待所有小鼠采血完成后，置于低溫離心機中離心（4 ℃，100×g，10 min），此時血樣分為3層，上層為淡黃色上清液，中間為白細胞層，下層為紅細胞。小心吸取上層清液及中間層白細胞于新的EP 管中，再次置于低溫離心機中離心（4 ℃，1 600×g，10 min），吸走上層清液的3/4，輕輕混懸，即得到PRP。用血球計數板計數獲取的PRP 中的血小板濃度為5 500×109個/L，為全血的5倍，說明PRP制備成功。將得到的PRP 與激活劑（凝血酶與10%CaCl2的混合物）以9∶1 比例混合，常溫振蕩，5 min后即形成PRP凝膠。

1.2.3 創面形態觀察與測量 在術后當天及術后第3、7、11、14 天進行拍照，觀察傷口周圍的炎癥反應、液體滲出以及傷口愈合情況；使用Image J 軟件，設定好標尺，在需要測量的創面上進行傷口邊緣勾畫，每只小鼠測量5次，求平均值計算傷口面積。

1.2.4 免疫熒光染色 小鼠術后第14天處死，取傷口處皮膚制成病理切片，經過脫蠟、梯度乙醇水化、抗原修復、內源性過氧化氫酶消除、血清封閉后，切片用Ⅰ型膠原蛋白（1∶50）、Ⅲ型膠原蛋白（1∶50）抗體4 ℃過夜孵育，然后滴加羊抗兔IgG二抗，根據DAPI染色程度判定膠原蛋白的表達情況。

1.2.5 傷口處皮膚組織COL1A1、COL3A1、TGF-β1、PDGF、VEGF mRNA水平測定 取傷口處皮膚組織，采用Trizol法提取傷口處皮膚組織總RNA，反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA。反轉錄條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。按照 qRTPCR 反應體系配置好后進行擴增，擴增條件：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性5 s，50～60 ℃退火10 s，共39 個循環。引物序列見表1。根據得出的熒光曲線的Ct 值，以β-actin 為內參，2-ΔΔCt法計算結果。

Tab.1 Primer sequence for qRT-PCR表1 qRT-PCR所用引物序列

1.3 統計學方法 應用Graphpad prism 7.0統計軟件分析處理，結果以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較用Tukey法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PRP 凝膠對小鼠皮膚傷口閉合的影響 術后第3 天，PRP 凝膠組較另外2 組皮膚創面滲出液減少，傷口周圍干燥，且紅色肉芽組織開始生長，傷口周圍上皮開始收縮。術后第11、14 天，PRP 凝膠組的皮膚傷口明顯愈合，見圖1。在術后各時間點，與對照組和PRP 注射組相比，PRP 凝膠組傷口面積減小（P＜0.05），術后第11、14 天，與對照組相比，PRP注射組傷口面積減小（P＜0.05），見表2。

2.2 PRP 凝膠對膠原蛋白表達的影響 各組小鼠皮膚組織中Ⅰ型膠原蛋白與Ⅲ型膠原蛋白均陽性表達。與對照組和PRP 注射組相比，PRP 凝膠組2 種膠原蛋白表達明顯增加，見圖2、3。

Tab.2 Comparison of wound areas at different time points between three groups of mice表2 3組小鼠皮膚損傷后不同時間點傷口面積比較（n=5，cm2，）

Tab.2 Comparison of wound areas at different time points between three groups of mice表2 3組小鼠皮膚損傷后不同時間點傷口面積比較（n=5，cm2，）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與PRP注射組比較，P＜0.05

組別對照組PRP注射組PRP凝膠組F第3天0.22±0.01 0.21±0.01 0.14±0.01ab 267.200＊＊第7天0.20±0.01 0.19±0.01 0.10±0.01ab 432.900＊＊第11天0.18±0.01 0.15±0.01a 0.03±0.01ab 958.100＊＊第14天0.08±0.01 0.05±0.01a 0.02±0.01ab 119.900＊＊

2.3 小鼠皮膚傷口組織相關基因mRNA 表達水平比較 與對照組和PRP 注射組相比，PRP 凝膠組VEGF、COL1A1、COL3A1、TGF- β1 和 PDGF 的mRNA 表達水平均升高（P＜0.05）；與對照組相比，PRP 注射組 COL1A1、COL3A1、TGF-β1、PDGF 的mRNA 表達水平均升高（P＜0.05），VEGF mRNA 表達比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。

3 討論

皮膚缺損的修復過程是一個復雜、動態且有序的生物學過程，它包括起始的炎癥階段、肉芽組織增生、組織的重塑改建，這幾個階段相互關聯和相互影響［4］。在許多疾病中，一種或幾種機制受損可以導致愈合過程失敗，從而造成傷口難以愈合［5］，而傷口愈合延遲通常會導致局部感染加重［6］。

PRP 中血小板 α 顆粒含 PDGF、VEGF 等大量生長因子，它們在血管新生以及促進細胞增殖等創傷組織進行修復的環節發揮重要作用［7］。只有當PRP被外源物激活以后，血小板α 顆粒中的各種生長因子才會大量釋放，最終為細胞的黏附提供有利條件，從而上調Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達量［8］。PRP 凝膠相當于給血小板穿上了保護衣，可保護血小板在體外不受損害，防止血小板的流失，使血小板在局部可以長時間停留，分泌高濃度生長因子，并且PRP凝膠還有一定的可塑性［9］。本研究結果表明，在小鼠的背部皮膚傷口給予PRP 凝膠可以明顯上調COL1A1、COL3A1 的 mRNA 表達，通過后續的免疫熒光結果也驗證了激活PRP可以有效促進膠原蛋白在傷口部位的合成。而未激活的PRP混懸液經皮下注射后，對傷口愈合有一定促進作用，但與激活PRP的作用比較，對傷口愈合作用的能力較弱。這也與PRP 激活后釋放大量活性因子的結果相一致。因此，筆者推測PRP 凝膠可能通過促進膠原蛋白大量合成來加速傷口愈合。

Tab.3 Comparison of skin wound related genes between three groups of mice表3 3組小鼠皮膚傷口相關基因水平的比較（n=5，）

Tab.3 Comparison of skin wound related genes between three groups of mice表3 3組小鼠皮膚傷口相關基因水平的比較（n=5，）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與PRP注射組比較，P＜0.05

組別對照組PRP注射組PRP凝膠組F VEGF 1.00±0.32 1.30±0.38 6.47±0.61ab 229.200＊＊COL1A1 1.00±0.20 3.62±0.65a 6.28±0.97ab 74.490＊＊組別對照組PRP注射組PRP凝膠組F COL3A1 1.00±0.02 1.98±0.25a 7.30±0.51ab 537.700＊＊TGF-β1 1.00±0.19 3.54±0.33a 9.83±0.88ab 337.100＊＊PDGF 1.00±0.60 3.74±0.63a 7.97±0.95ab 111.500＊＊

在皮膚傷口愈合過程中，血管化發揮著重要作用［10］，血管生成對于滋養新形成的肉芽組織和角質細胞至關重要［11］。本研究發現，給予小鼠皮膚傷口PRP凝膠可以誘導創傷組織中多種血管生成因子如TGF-β1、VEGF、PDGF mRNA 水平明顯升高。而PRP 注射組VEGF mRNA 表達水平與對照組比較差異無統計學意義，且PRP注射組傷口面積在第11天才有明顯的減小。因此，筆者推測PRP 凝膠可能通過促進血管生成來加速傷口愈合。

目前，臨床多使用單一生長因子，僅能促進某一階段的創面愈合過程。已有研究證實，將多種生長因子組合使用，更符合創傷愈合的生物學過程，達到最佳的促進創面愈合效果［12］。血小板激活后，可持續釋放多種與機體內配比、種類類似的生長因子［13］。本研究通過離心法成功制備PRP后混合加入適量的凝血酶和鈣離子，促使PRP 形成凝膠狀，即PRP 凝膠。與臨床上應用的單一生長因子相比，PRP 凝膠有其獨特的優勢，其可為創面提供一個適合愈合的濕潤環境，還能在創面愈合階段持續分泌高濃度生長因子，發揮最大的促愈作用［14］。此外，PRP凝膠是由大量的纖維蛋白組成的立體網狀結構，可為細胞生長提供良好支架，同時纖維蛋白的回縮作用還可以促進創面收縮和凝血［15］。PRP凝膠可以是自源性的，避免了異種生長因子可能引起的免疫排斥。近年來國外已有相關報道將其成功應用于牙周病、口腔種植、顱面、骨關節軟骨等修復［16-17］，但應用到皮膚創傷修復還并不成熟。本研究顯示，對照組傷口愈合速度最慢，愈合時間也最長；PRP注射組愈合程度較對照組好；PRP凝膠組愈合程度最好，這證明了PRP制備為凝膠后可以促進創面的修復。經過PRP凝膠處理創面后，膠原蛋白大量生成，新生血管較多，瘢痕組織生成少，這些與PRP凝膠促愈作用以及能夠持續提供高濃度、與體內配比相似的生長因子均有關。但本研究沒有涉及不同濃度的PRP被激活以及PRP激活后釋放的生長因子不同濃度配比對于皮膚傷口愈合的影響，有待更深入的研究。

綜上所述，使用PRP 凝膠可以顯著促進傷口處膠原合成及新血管生成。同時，它可以為局部組織持續提供大量生長因子，縮短創面愈合的時間。因此，PRP 凝膠有可能作為臨床治療皮膚創傷的一種有效手段。