右旋糖酐水解改善右旋糖酐分子量分布的研究

慕 娟，問清江，鄭巧霞，孫曉宇，丁 浩

(陜西省微生物研究所， 陜西 西安 710043)

右旋糖酐(Dextran)具有增加血容量、改善微循環(huán)、防止彌散性血管內(nèi)凝血的作用，主要用于治療失血性休克，是目前公認的優(yōu)良血漿代用品之一，是美國FDA最早批準使用的多糖藥品。臨床上應用的常有3種規(guī)格產(chǎn)品：右旋糖酐70、右旋糖酐40、右旋糖酐20。右旋糖酐的生產(chǎn)原理為：蔗糖經(jīng)腸膜狀明串珠菌(Leuconstocmesenteriodes)產(chǎn)生的右旋糖酐蔗糖酶(Dextransucrase；E.C.2.4.1.5)合成右旋糖酐(粗酐)，粗酐進一步水解、分離純化為藥品右旋糖酐[1～2]。我國現(xiàn)有的右旋糖酐生產(chǎn)工藝中，右旋糖酐的水解采用鹽酸水解，由于鹽酸水解缺乏專一性，出現(xiàn)粗酐中的殘留蔗糖與右旋糖酐競爭水解，隨機性強，反應過程難控制，右旋糖酐分子量分布不集中，水解穩(wěn)定性差，產(chǎn)品分子量分布受到極大的影響。從右旋糖酐40的分子量分布來看，我國的產(chǎn)品標準低于歐美國家(表1)，不僅分子量的分布不集中，而且重均分子量下移；實際產(chǎn)品質(zhì)量往往只能達到重均分子量的下限，否則就難以滿足10%大分子≤120 000，10%小分子≥5 000。在右旋糖酐40制備工藝改進研究中發(fā)現(xiàn)，當發(fā)酵水平低下時，其他工藝條件不變的情況下，粗酐的鹽酸水解結(jié)果異常，還原糖變化增加較大，但水解產(chǎn)物的重均分子量卻沒有相應的降低，反而高于發(fā)酵水平高，酸解還原糖變化小的水解產(chǎn)物的重均分子量。分析原因，粗酐中的殘留蔗糖與右旋糖酐產(chǎn)生競爭水解，因此需要進一步研究。

表1 不同國家右旋糖酐40分子量分布[3～5]

右旋糖酐酶(Dextranase，EC 3.2.1.11)能夠催化水解右旋糖酐(Dextran)分子中的α-1,6葡萄糖苷鍵，降解為小分子的右旋糖酐、異麥芽糖、異麥芽三糖、葡萄糖及少量的多聚糖。右旋糖酐酶水解右旋糖酐，具有專一性和高效性，可以提高水解效率；酶的底物特異性顯示酶的親和力隨底物分子量的增加而增強，尤其是對分子量1000萬以上的右旋糖酐的親和力遠遠大于100萬以下的右旋糖酐，這一特點有益于改善水解物的分子量分布[6]。筆者主要對蔗糖與右旋糖酐鹽酸水解競爭、鹽酸底物特異性等右旋糖酐酸解機理進行研究，同時進行右旋糖酐在酶解時是否有蔗糖競爭存在，右旋糖酐酶解條件等研究，最終實現(xiàn)改善右旋糖酐產(chǎn)品分子量分布的目標。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 葡萄糖(D-(+)-Glucose),Sigma 公司產(chǎn)品；蔗糖(AR)，3,5-二硝基水楊酸(CP)；濃鹽酸(AR)；其他試劑為市售分析純。

1.1.2 右旋糖酐酶 (寧夏夏圣實業(yè)集團有限公司)。

1.1.3 右旋糖酐 (陜西省微生物研究所自制)。

1.1.4 儀器 722分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)；85-2數(shù)顯恒溫磁力攪拌器(杭州儀表電機有限公司)；101型電熱鼓風干燥箱(北京科偉永興儀器有限公司)； 2010A-HT高效液相色譜儀(蘇州貝銳儀器科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 蔗糖與右旋糖酐鹽酸水解競爭性 取0.5 mL的0.3% HCl溶液加入到0.5 mL 1%的右旋糖酐(蔗糖)溶液中，95℃準確反應10 min，加入2 mL DNS終止反應，沸水浴2 min顯色，然后流水冷卻至室溫，定容至10 mL；空白對照，0.5 mL 1%的右旋糖酐(蔗糖)溶液95℃準確保溫10 min，先后加入2 mL DNS和0.5 mL 0.3% HCl溶液，沸水浴2 min顯色，然后流水冷卻至室溫，定容至10 mL。以蒸餾水為對照測定540 nm的吸光值，樣品和空白對照的吸光值之差根據(jù)葡萄糖標準曲線的回歸方程得出反應液中的葡萄糖量，從而確定還原糖的變化。

1.2.2 右旋糖酐酶的專一性 將右旋糖酐酶用一定pH值的緩沖液適當稀釋后，取0.5 mL的酶液加入到0.5 mL 1%的右旋糖酐(蔗糖)溶液中，50℃準確反應10 min，加入2 mL DNS終止反應，沸水浴2 min顯色，然后流水冷卻至室溫，定容至10 mL；空白對照，0.5 mL 1%的右旋糖酐(蔗糖)溶液50℃準確保溫10 min，先后加入2 mL DNS和0.5 mL的酶液，沸水浴2 min顯色，然后流水冷卻至室溫，定容至10 mL。以蒸餾水為對照測定540 nm的吸光值，樣品和空白對照的吸光值之差進行比較，以確定右旋糖酐酶的專一性。

1.2.3 不同分子量右旋糖酐鹽酸水解特異性 分別以重均分子量T-10、T-40、T-70、T-500、T-1000、T-10000的右旋糖酐作為水解底物，按照1.2.1進行鹽酸水解，測定還原糖的量確定還原糖的變化。

1.2.4 不同水解方法制備右旋糖酐40 主要有:

1.2.4.1 鹽酸水解右旋糖酐制備右旋糖酐40。在鹽酸濃度0.8%，粗酐6.0%，溫度95℃，水解時間3.0 h條件下酸解右旋糖酐，水解結(jié)束加入1.0%的活性炭脫色40 min，抽濾收集濾液，乙醇分離純化，沉淀75%乙醇洗滌，干燥粉碎為右旋糖酐40。

1.2.4.2 右旋糖酐酶酶解右旋糖酐制備右旋糖酐40。右旋糖酐酶在粗酐6.0%，酶濃度0.1 IU·mL-1，時間3.5 h，溫度50℃條件下酶解右旋糖酐，酶解結(jié)束立即升溫至95℃滅活，同時加入活性炭脫色(95℃保溫30 min)，其余同1.2.4.1。

1.2.5 還原糖測定(以葡萄糖糖計)[6～7]采用DNS法測定葡萄糖糖。葡萄糖糖標準曲線繪制：配制1 mg·mL-1葡萄糖標準溶液，分別量取0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 mL葡萄糖標準溶液，用蒸餾水補齊1.0 mL，再加入2.0 mL DNS，沸水浴2 min，冷水浴水冷卻后加蒸餾水至10 mL，在540 nm進行光吸收測定，繪制葡萄糖糖標準曲線，得出回歸方程用于葡萄糖的測定。

酶解液等樣品稀釋一定倍數(shù)，取樣品1.0 mL加入2.0 mL DNS煮沸2 min顯色，然后冷水浴冷卻至室溫，定容至10.0 mL，以蒸餾水為對照，540 nm測定吸光值，根據(jù)回歸方程得出樣品中的葡萄糖糖含量。

1.2.6 分子量與分子量分布[3]取樣品適量，加流動相溶解并稀釋制成每1 mL約含10 mg的溶液，振搖，室溫放置過夜作為供試品溶液。另取4～5個已知分子量的右旋糖酐對照品，依法檢查(2015版《藥典》二部附錄VH)，樣品10%大分子部分重均分子量不得大于120 000，10%小分子部分重均分子量不得小于5 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 蔗糖與右旋糖酐鹽酸水解競爭性

右旋糖酐和蔗糖在鹽酸濃度0.15%，溫度95℃等相同條件下水解，測定水解液中的還原糖，結(jié)果見圖1。蔗糖水解為果糖和葡萄糖，右旋糖酐斷開一個糖苷鍵可以產(chǎn)生一個還原端，因此在水解一個糖苷鍵時，前者的還原糖是后者的兩倍。從圖1可以看出，蔗糖的水解結(jié)果遠遠高于右旋糖酐，前者是后者的17倍，考慮蔗糖水解雙還原糖產(chǎn)生，蔗糖水解是右旋糖酐的8倍，說明同一鹽酸水解條件下，蔗糖水解具有極強的競爭性，蔗糖殘存較多的粗酐鹽酸水解時會受到一定的影響。表2是在右旋糖酐40制備工藝改進研究中的現(xiàn)象，右旋糖酐發(fā)酵維持在一定水平時，發(fā)酵液經(jīng)過板框過濾、陶瓷膜微濾及超濾等發(fā)酵液后處理為粗酐液，粗酐液鹽酸水解后，水解液的還原糖含量與右旋糖酐的重均分子量呈現(xiàn)反向關(guān)系，還原糖越高，重均分子量越底。當發(fā)酵異常，發(fā)酵水平過低時，發(fā)酵液的后處理工藝條件不變的前提下，水解液還原糖含量出現(xiàn)較大的增加，但右旋糖酐的重均分子量沒有下降而是升高。原因在于，發(fā)酵水平下降，發(fā)酵液蔗糖殘存增大，后處理后的粗酐溶液中蔗糖殘存同樣增大，粗酐鹽酸水解時就會發(fā)生蔗糖的競爭水解，還原糖增加較多，但右旋糖酐的水解大大折扣，重均分子增高。這就是長期以來困擾右旋糖酐原料藥生產(chǎn)中分子量分布難以控制的原因，要想改變這一狀況，需要在水解工藝上尋找新的出路。

圖1 蔗糖與右旋糖酐鹽酸水解競爭性

表2 右旋糖酐的鹽酸水解

2.2 右旋糖酐酶的專一性

右旋糖酐和蔗糖在0.5%的底物濃度，pH5.0，0.16 IU·mL-1酶濃度，時間10 min，溫度50℃的條件下酶解反應，進行還原糖測定(見圖2)。結(jié)果表明右旋糖酐被右旋糖酐酶酶解，而蔗糖沒有發(fā)生反應，與2.1中的鹽酸水解完全不同，說明右旋糖酐酶具有高度的專一性，其可以選擇性地降解右旋糖酐中的α-1,6葡萄糖苷鍵，對蔗糖中的糖苷鍵沒有作用。右旋糖酐酶用于右旋糖酐的降解可以克服鹽酸水解出現(xiàn)的非專一性降解，避免了粗酐中的蔗糖殘留競爭水解，有利于右旋糖酐的水解條件的控制，保證了水解液分子量分布的穩(wěn)定性，有利于后處理及不同分子量右旋糖酐的分離純化。右旋糖酐的酶解結(jié)果也進一步予以說明(見表2)。雖然右旋糖酐發(fā)酵水平有所不同，但發(fā)酵液經(jīng)過相同后處理用于右旋糖酐酶解，酶解液中還原糖的變化和重均分子量的大小的關(guān)系沒有因發(fā)酵水平不同而異常，基本呈現(xiàn)相同的變化趨勢：還原糖變化大，重均分子量則低。

2.3 不同分子量右旋糖酐鹽酸水解特異性

在相同條件下對重均分子量不同的T-5，T-10，T-40，T-500，T-1000，T-2000和T-10000以上的右旋糖酐進行鹽酸水解，測定其還原糖的變化(圖3)。從T-5到T-2000還原糖無明顯變化，基本保持在同一水平，T-10000遠遠高于其他。在同一鹽酸水解環(huán)境中，T-10000的水解性強于其他，易于被水解；而T-5到T-2000水解性相當，被同步水解，大分子降解為小分子，小分子降解成更小分子，使得右旋糖酐水解液中的分子量分布過于分散而不均，不利于目標分子量右旋糖酐的分離純化。而右旋糖酐酶的底物特異性表明，隨著右旋糖酐分子量的增大，酶的親和力增強，高分子量的易于降解，可以改善右旋糖酐酶解液分子量分布，易于低分子量右旋糖酐的制備[6]。

圖2 右旋糖酐酶的專一性

表3 右旋糖酐的酶解

圖3 不同分子量右旋糖酐鹽酸水解特異性

表4 右旋糖酐鹽酸水解與右旋糖酐酶酶解比較

從右旋糖酐鹽酸水解液和右旋糖酐酶解液分子量分布(表4)可以看出，在重均分子量40 000～70 000之間，重均分子量相當時，酸解10%大分子的分子量比酶解10%大分子的分子量高出100 000，10%小分子前者低于后者1 000，酶解分子量分布比酸解分子量分布相對集中，酶解可以改善分子量的分布；在在重均分子量20 000～40 000之間，重均分子量相當時，酸解和酶解10%大分子的分子量基本無差別，但酸解10%小分子的分子量比酶解10%小分子的分子量低2 000多，酶解分子量分布優(yōu)于酸解分子量分布，酶解也改善了分子量的分布。總之，右旋糖酐酶酶解右旋糖酐可以改善分子量的分布，從而有益于通過降解高分子右旋糖酐制備低分子量右旋糖酐。

2.4 不同水解方法制右旋糖酐40

右旋糖酐分別用鹽酸和右旋糖酐酶降解制備右旋糖酐40，結(jié)果見表5、表6。鹽酸水解制備的右40分子量分布為，重均分子量33 000～36 000，10%大分子<120 000，10%小分子>5 000；右旋糖酐酶酶解制備的右旋糖酐分子量分布為，重均分子量38 000～42 000，10%大分子<110 000，10%小分子>7 000。前者達中國標準，后者改善了分子量分布，達到歐洲標準。但是鹽酸水解右旋糖酐40的產(chǎn)率高于右旋糖酐酶解右旋糖酐40產(chǎn)率，最高差達7%，這就需要進一步優(yōu)化右旋糖酐酶解制備右旋糖酐40等低分子右旋糖酐產(chǎn)品工藝條件，在提高產(chǎn)品質(zhì)量的同時提高產(chǎn)率，使得酶解工藝能夠替代酸解工藝用于右旋糖酐40等低分子右旋糖酐產(chǎn)品的生產(chǎn)。

表6 右旋糖酐酶解制備右旋糖酐40

3 結(jié)論

在右旋糖酐40等原料藥工藝改進研究中遇到右旋糖酐發(fā)酵水平有明顯降低時，粗酐鹽酸水解時的還原糖變化和右旋糖酐分子量分布關(guān)系異常，即還原糖變化超出正常數(shù)倍，而分子量沒有降低，反而高于正常。分析原因可能是粗酐中的殘留蔗糖也發(fā)生酸解，且蔗糖酸解競爭性強于右旋糖酐。蔗糖與右旋糖酐鹽酸水解競爭性試驗表明，同一鹽酸水解條件下，蔗糖水解具有極強的競爭性，發(fā)酵水平下降，發(fā)酵液蔗糖殘存增大，后處理后的粗酐溶液中蔗糖殘存同樣增大，粗酐鹽酸水解時就會發(fā)生蔗糖的競爭水解，還原糖增加較多，但右旋糖酐的水解大大折扣，重均分子增高。這就是長期以來困擾右旋糖酐原料藥生產(chǎn)中分子量分布難以控制的原因。用蔗糖和右旋糖酐進行了右旋糖酐酶專一性研究，結(jié)果表明右旋糖酐酶不降解蔗糖，可以專一性的降解右旋糖酐，右旋糖酐酶解結(jié)果表明，右旋糖酐發(fā)酵水平的變化對右旋糖酐酶酶解沒有影響。不同分子量右旋糖酐鹽酸水解特異性試驗表明，在同一鹽酸水解環(huán)境中，T-10000的水解性強于其他，易于被水解；而T-5到T-2000水解性相當，被同步水解，大分子降解為小分子，小分子降解成更小分子，使得右旋糖酐水解液中的分子量分布過于分散而不均，不利于目標分子量右旋糖酐的分離純化。而右旋糖酐酶的底物特異性表明，隨著右旋糖酐分子量的增大，酶的親和力增強，高分子量的易于降解，可以改善右旋糖酐酶解液分子量分布，易于低分子量右旋糖酐的制備。分別采用鹽酸水解和右旋糖酐酶酶解兩種水解方法制備右旋糖酐40，結(jié)果表明，前者重均分子量低于后者，10%大分子大于后者，10%小分子小于后者，前者達到中國標準，后者達到歐洲標準。右旋糖酐酶解制備右旋糖酐40等原料藥可以改善分子量分布。但是酶解制備右旋糖酐40的收率低于酸解，這就需要進一步研究酶解工藝條件，在提高產(chǎn)品質(zhì)量的同時提高產(chǎn)率。再就是酶解引入酶蛋白，對于水解液后處理及產(chǎn)品的分離純化提出新的要求，需要對工藝條件進一步研究。