不動桿菌來源L-天冬氨酸-β-脫羧酶的表達與酶學性質分析

于佳印，趙庭，劉中美，周麗，周哲敏

(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

L-天冬氨酸-β-脫羧酶(L-aspartate-β-decarboxylase, EC 4.1.1.12 Asd)又稱L-天冬氨酸-4-脫羧酶，以5′-磷酸吡哆醛(pyridoxal5-phosphatemonohydrate,PLP)為輔酶因子[1-2]，是目前為止自然界中發現的唯一的氨基酸-β-脫羧酶，可以催化底物L-天冬氨酸脫去β位羧基生成L-丙氨酸和CO2，α-酮戊二酸對其脫羧反應具有激活作用[3]。同時，L-天冬氨酸-β-脫羧酶是一個多功能酶，具有較低的轉氨活性以及β-消除活性[4]。L-天冬氨酸-β-脫羧酶一般以同型十二聚體形式存在，單亞基分子質量均為60 kDa左右[5]。已有研究報道，L-天冬氨酸-β-脫羧酶存在于哺乳動物細胞[6]以及多種微生物中，如假單胞菌[7]、糞產堿菌[8]、糞腸球菌[9]、放線菌[10]以及真菌[11]，目前已用來生產L-丙氨酸和拆分DL-天冬氨酸生產D-天冬氨酸[12]。關于L-天冬氨酸-β-脫羧酶來源與性質的研究始于20世紀50年代，主要集中在20世紀70年代至21世紀初。

L-丙氨酸具有重要的生理功能，如參與糖代謝、在轉氨反應中提供氨基，并且參與體內氨基酸循環、氨基酸與糖原轉換等過程。同時，L-丙氨酸在日化、醫藥、食品等領域均有廣泛用途[13]。在日化領域，L-丙氨酸是合成氨基酸表面活性劑的原料[14]；在醫藥應用方面，L-丙氨酸是合成VB6和L-氨基丙醇[15](鹽酸左氧氟沙星合成前體)的主要原料；同時，L-丙氨酸是復合氨基酸注射液和輸液的主要成分，也是心肌功能增強劑。它可以用于配制組織培養基和生化試劑，也可用于肝功能檢測。在食品領域，L-丙氨酸具有甜味和鮮味，能與谷氨酸鈉制成混合調味品，可調制并明顯改善食品風味，而不破壞食品原有的風格[16]。

目前，L-丙氨酸的制備方法主要包括化學合成法、蛋白質水解法、發酵生產法與酶轉化法。酶促反應具有催化效率高、反應條件溫和、立體選擇性強、綠色環保節能減排等優點，已經被投入到了大規模的工業生產當中，是如今工業生產上應用最廣泛的合成L-丙氨酸的工藝[17]。2000年，CHEN等[8]首次克隆了AlcaligenesfaecalisCCRC 11585來源的Asd酶，并在大腸桿菌中實現異源表達，在45 ℃、pH 5.0條件下該酶具有最高比酶活力215 U/mg。2006年，WANG等[7]克隆并異源表達了Pseudomonassp.來源的Asd酶，測得其最適反應溫度為45 ℃，40 ℃保溫40 min酶活力剩余為92%，最適反應pH值4.5，在pH 4.0～7.0有較好的穩定性，比酶活為280 U/mg；2015年，吳四平等[18]對Alcaligenesfaecalis來源Asd酶在大腸桿菌中進行重組表達，測得其最適反應溫度為45 ℃，在35、40 ℃穩定性較好，保溫3 h酶活力幾乎沒有損失；最適反應pH值為6.0，同時在pH 6.0條件下穩定性最好。2018年，汪芳[19]將Pseudomonasdacunhae中編碼Asd酶的基因克隆至大腸桿菌中進行異源表達，針對該酶在低pH條件下酶活力降低的情況進行改造，獲得穩定性提高的突變體N34D/L484M，比酶活力為116.27 U/mg，比野生型提高76.3%。本文在大腸桿菌中首次重組表達了不動桿菌來源的Asd酶，對其酶學性質進行了研究，擴充了Asd酶家族，同時也為生物轉化生產L-丙氨酸的工業應用提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質粒

菌株E.coliBL21 (DE3)、E.coliJM109與質粒pMD 19-T、pET-28a(+)，安徽通用生物系統有限公司；菌株Acinetobacterradioresistens，本實驗室保藏。

1.1.2 試劑及培養基

L-天冬氨酸鈉、L-丙氨酸、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)、卡那霉素，上海生工生物工程有限公司；PrimeSTAR?Max DNA 聚合酶、限制性內切酶EcoRⅠ、XhoⅠ和T4 DNA連接酶，TaKaRa寶日醫生物技術有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒和PCR產物純化試劑盒，Axygen產品；其他試劑均為國產分析純。

E.coli的種子培養基為Luria-Bertani(LB)培養基，誘導蛋白表達培養基為Terrific-Broth(TB)培養基。

1.1.3 引物設計及合成

根據GenBank檢索所得的不動桿菌(Acinetobacterradioresistens)的L-天冬氨酸-β-脫羧酶基因序列(GeneBank登錄號為AP019740.1)設計引物，分別在引物5′和3′端加入EcoRⅠ、XhoⅠ酶切位點及保護堿基。引物序列如表1所示。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Primers used in this study

注：下劃線部分為限制性內切酶酶切位點

1.2 實驗方法

1.2.1 不動桿菌Acinetobacterradioresistens基因組提取

Acinetobacterradioresistens基因組提取方法參考細菌基因組DNA提取試劑盒的使用說明。

1.2.2 基因工程菌E.coliBL21/pET28a(+)-ArAsd構建

以Acinetobacterradioresistens基因組為模板，以上述引物進行PCR擴增。將獲得帶有限制性酶切位點的目的基因ArAsd連接載體pMD19T，獲得pMD19T-ArAsd。提取pMD19T-ArAsd用EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切，經瓊脂糖凝膠電泳鑒定、回收、純化后，用T4 DNA連接酶連接到同樣經過EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切的pET-28a(+)載體上，獲得重組質粒pET28a-ArAsd。將重組質粒轉化到E.coliBL21 (DE3)感受態細胞中，選取含有卡那抗性平板上陽性轉化子提取質粒酶切驗證，得到重組菌E.coliBL21/pET28a(+)-ArAsd，并保存于甘油管中。

1.2.3 重組ArAsd蛋白誘導表達

將保存于甘油管中的重組菌劃線于帶有卡那抗性的LB平板上，于37 ℃培養12 h；在平板上挑取單菌落接種于5 mL含100 μg/L卡那霉素的LB培養基中，37 ℃、200 r/min培養8 h，以1%接種量轉接至含有50 mL TB培養基的250 mL三角瓶中，培養基中加入終質量濃度為100 μg/L的卡那霉素，37 ℃、200 r/min搖床培養至菌體OD600為0.6～0.8，添加終質量濃度為0.2 mmol/L的IPTG，30 ℃誘導培養12 h。誘導結束后，6 000 r/min離心10 min收集菌體，超聲破碎，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分析鑒定重組蛋白表達情況。

1.2.4 重組ArAsd蛋白純化

用結合緩沖液A(20 mmol/L Na2HPO4、20 mmol/L NaH2PO4、500 mmol/L NaCl、10 mmol/L 咪唑、pH 7.4)懸浮誘導表達后的菌體，冰浴超聲破碎(功率300 W，破碎3 s，間歇7 s，破碎30 min)，12 000 r/min離心20 min，取上清，用0.22 μm濾膜過濾，即粗酶液。Sepharose His Trap HP用5倍柱體積結合緩沖液A平衡后，取10 mL上樣，繼續平衡洗去雜蛋白。使用洗脫緩沖液B(20 mmol/L Na2HPO4、20 mmol/L NaH2PO4、500 mmol/L NaCl、500 mmol/L 咪唑、pH 7.4)梯度洗脫，收集的洗脫液即為純化得到的純酶液，用SDS-PAGE方法分析純化情況，采用Bradford法測定純化所得蛋白濃度。

1.2.5 Asd酶活力的測定方法

酶活力定義為在37 ℃，pH 4.5條件下，1 min轉化底物生成1 μmolL-丙氨酸所需的酶量為一個酶活力單位U。

酶活力檢測反應體系：1 mL反應體系中，將適量Asd酶液與磷酸緩沖液(50 mmol/L，pH 4.5)混合，并加入終濃度為0.5 mmol/L的PLP、終濃度為1 mmol/L的α-酮戊二酸，混勻后于37 ℃預熱10 min，后加入終濃度為40 mmol/L的底物L-天冬氨酸鈉激活反應，于37 ℃水浴反應20 min后，煮沸10 min滅活反應。

液相檢測方法[20]：反應液于12 000 r/min離心10 min后，取上清通過0.22 μm濾膜過濾，隨后采用異硫腈酸苯酯(phenyl isothiocyanate，PITC)衍生，具體步驟為：取500 μL反應液于2 mL離心管中，加入250 μL 1mol/L三乙胺乙腈溶液與250 μL 0.1 mol/L PITC乙腈溶液，充分均勻混合，于室溫避光反應衍生45～60 min，加入750 mL正己烷溶液終止反應，渦旋振蕩1 min后靜置10 min待溶液分層，吸取下層溶液，經0.22 μm有機濾膜過濾。使用高效液相色譜法檢測衍生后L-丙氨酸含量。

1.2.6 Asd酶學性質研究

最適反應溫度測定：分別在35、40、45、50、55、60、65、70 ℃條件下測定Asd的酶活力，將最高酶活力定義為100%，檢測結果以Asd相對酶活力對溫度作圖呈現。

最適反應pH測定：保持其他反應條件不變，反應體系中加入相同體積的pH值為3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、9.0的緩沖液，于37 ℃條件下反應10 min后滅活，檢測結果以Asd相對酶活力對pH作圖呈現。pH值3.0～8.0采用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液，pH值7.0～9.0采用Tris緩沖溶液。

熱穩定性測定：取等量純酶液置于0、40、45、50 ℃水浴鍋中溫育，每隔30 min取樣，于冰上冷卻5 min，保持其他反應條件不變，按照1.2.4所述方法檢測酶活力，檢測結果以不同溫度下相對酶活力對處理時間作圖呈現。

pH穩定性檢測：取等量純酶液用相同體積的pH值為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、的緩沖溶液懸浮，于冰上放置12 h，保持其他反應條件不變，隨后按照1.2.4所述方法檢測酶活力，檢測結果以不同pH下相對酶活力對處理時間作圖呈現。

動力學常數測定：1 mL反應體系中，將適量Asd酶液與磷酸緩沖液(50 mmol/L，pH 4.5)混合，并加入終濃度為0.5 mmol/L的PLP、終濃度為1 mmol/L的α-酮戊二酸，混勻后于37 ℃預熱10 min，后加入終濃度為5、10、15、20、30、40 mmol/L的底物L-天冬氨酸鈉，于37 ℃水浴反應2 min后，煮沸10 min滅活反應。檢測L-丙氨酸產量，測定初始反應速率。采用GraphPad Prism擬合曲線，測定酶的Km，kcat，Vmax，kcat/Km。

1.2.7 底物與產物對重組菌的影響

將重組菌懸浮于50 mmol/L的；磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH 4.5)中，菌體OD600調至10，加入終濃度為0.3、0.5、1 mol/L的底物或產物，于37 ℃處理1 h后，離心收集菌體并使用去離子水洗滌2遍，然后測定菌體的剩余酶活力。對照組底物、產物的濃度為0 mol/L。

2 結果與分析

2.1 基因工程菌BL21/pET28a-ArAsd的構建

以不動桿菌(Acinetobacterradioresistens)的基因組為模版，通過PCR擴增，獲得大小約為1 602 bp的核酸條帶，與Asd基因理論大小相符，如圖1所示。重組質粒pET28a-ArAsd使用EcoRⅠ和XhoⅠ限制性內切酶對重組質粒進行雙酶切，經瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖1泳道3所示，獲得大小約為5 500 bp和1 602 bp的條帶，長度分別與pET-28a載體和ArAsd基因大小相符，重組質粒中的Asd基因以pET28a載體通用引物進行測序，結果與Acinetobacterradioresistens的Asd基因大小一致。上述結果表明ArAsd基因已成功連接到pET28a載體質粒上。

M-marker；1-目的基因；2-EcoRⅠ酶切載體pET-28a；EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切重組質粒
圖1 重組載體pET28a-ArAsd酶切驗證
Fig.1 The enzymic digestion of pET28a-ArAsd

2.2 重組Asd酶的誘導表達與純化

將重組大腸桿菌BL21/pET28a-ArAsd于LB培養基中活化后，以1%的接種量接種于TB液體培養基培養至OD600約為0.8，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG誘導表達12 h，收集細胞進行超聲破碎，破碎上清液經SDS-PAGE電泳驗證(圖2)。電泳圖譜顯示在44.3 kDa與66.4 kDa之間有特異性表達條帶，與理論相對分子質量60 kDa相符。破碎上清液經His Trap HP鎳柱純化，獲得電泳純的目的蛋白(圖2)，可用于進一步蛋白性質研究。

M-標準蛋白Marker；1-未誘導全細胞；2-誘導后破碎上清； 3-誘導后破碎沉淀；4-純化后ArAsd
圖2 重組菌BL21/pET28a-ArAsd表達產物的 SDS-PAGE電泳分析
Fig.2 The SDS-PAGE analysis of expression products in recombinant strain(BL21/PET28a-ArAsd)

2.3 重組Asd酶最適溫度及溫度穩定性

酶促反應過程中存在酶蛋白熱變性累積效應，表現為前期溫度較高時酶催化效率較高，后期由于蛋白質發生變性，有效酶分子數量減少，酶促反應效率降低。溫度對ArAsd的酶活力影響如圖3-a所示，其在50 ℃時達到最高酶活力。隨著溫度的升高，ArAsd酶活力呈現先升高后降低的趨勢。從重組Asd酶的熱穩定性實驗結果(圖3-b)可以看出，酶在設定的溫度下放置3 h，酶活力均有一定程度損失，溫度越高酶活力損失越快。40～45 ℃放置3 h，ArAsd較穩定，酶活力剩余70%以上， 50 ℃處理3 h酶活力剩余約為20%。

a-酶活；b-熱穩定性
圖3 溫度對ArAsd酶活力的影響及酶的熱穩定性
Fig.3 Effect of reaction temperature on ArAsd activity and thermal stability of the enzyme

2.4 重組Asd酶最適pH及pH穩定性

ArAsd的最適pH和pH穩定性實驗結果如圖4所示，隨著pH的增加，其酶活力呈現先增高后降低的趨勢，且在pH 4.5條件下具有最高酶活力；ArAsd在pH 6.0～7.0有較好的穩定性。

a-酶活；b-穩定性
圖4 pH對ArAsd酶活力的影響及酶的pH穩定性
Fig.4 Effect of reaction pH on ArAsd activity and pH stability of the enzyme

2.5 動力學常數

重組純酶ArAsd在常規測定條件下(37 ℃，pH 4.5)比酶活力為753 U/mg，較已有報道Pseudomonassp.[7]來源的Asd比酶活力高1.7倍，較Alcaligenesfaecalis[8]來源的Asd酶高2.5倍。ArAsd酶動力學常數如表2所示，其Km值較Pseudomonassp.[7]來源Asd酶低8.57 mmol/L，較Alcaligenesfaecalis[8]來源的Asd酶低5.95 mol/L，更易于與底物結合；同時，kcat值為Alcaligenesfaecalis[8]來源的Asd酶的2倍，表明其分子活力更高。較高的kcat/Km說明ArAsd具有更高的催化效率。

表2 重組酶ArAsd的動力學參數Table 2 the kinetic parameters of ArAsd

2.6 底物與產物對重組菌活性的影響

工業生產常利用全細胞作為催化劑進行生產，因此，測定重組菌對底物與產物濃度的耐受性對其應用的方法選擇有重要影響。其結果如圖5所示，高濃度底物L-天冬氨酸鈉對全細胞的酶活力有促進作用，產物L-丙氨酸濃度高于0.5 mol/L時會對全細胞催化活性產生抑制作用。

圖5 重組菌對底物與產物的耐受性
Fig.5 Tolerance of recombinant cell to substrate and product concentrations

3 結論

Asd酶是工業上催化L-天冬氨酸生產L-丙氨酸的關鍵性酶，篩選具有高酶活力、高穩定性的Asd酶對工業生產L-丙氨酸具有重要意義。本文以pET28a為載體，在大腸桿菌細胞中重組表達了不動桿菌(Acinetobacterradioresistens)來源的Asd酶，SDS-PAGE電泳圖顯示Asd蛋白成功表達。對其進行酶學性質測定，結果顯示其在50 ℃、pH 4.5時具有最高比酶活力753 U/mg，50 ℃處理2 h酶活力剩余70%左右，在pH 4.5條件下穩定性較差，處理12 h酶活力剩余20%左右。測定重組全細胞對底物與產物濃度的耐受性，結果顯示高濃度底物L-天冬氨酸鈉對全細胞催化活性有促進作用，產物L-丙氨酸濃度高于0.5 mol/L時會對全細胞催化活性產生抑制作用。