高產胞外多糖乳酸菌的誘變育種及其益生特性

盧承蓉，葉美芝，上官文丹，陳松，鐘青萍

(廣東省食品質量與安全重點實驗室，華南農業大學 食品學院，廣東 廣州，510642)

胞外多糖(exopolysaccharide，EPS)是乳酸菌的主要代謝產物之一，其以黏液多糖的形式分泌到環境中，或黏附在細胞表面形成莢膜多糖[1]。EPS有助于細菌形成生物被膜，是細菌生物被膜的重要組成部分，可以幫助細菌抵御不良環境，如干燥、滲透脅迫或噬菌體侵襲等[2-3]。EPS因為具有安全性高、副作用小、獨特的物理和流變性能，在石油、化工、食品、醫藥等行業中被廣泛用作乳化劑、膠凝劑、增稠劑、成膜劑和潤滑劑等[4-5]；此外，乳酸菌EPS具有良好的生物活性，國內外多項研究表明，乳酸菌EPS具有抗氧化[6-7]、免疫調節[8]、抗菌[9]、降血糖[2]等功能。氧化應激是導致衰老和疾病的一個重要因素，現有合成抗氧化劑有較高的抗氧化活性，但同時也具有細胞毒性和致癌風險[10-11]，而天然抗氧化劑分布廣泛且具有安全、高效等特點，不失為替代合成抗氧化劑的一種可行選擇，乳酸菌EPS具有較強的抗氧化能力，在作為天然抗氧化劑方面具有巨大潛力。

乳酸菌EPS因其卓越的生理功能引起研究人員的廣泛關注，但由于其產量較低，提取成本較高，生產應用受到限制，因此提升EPS產量勢在必行。誘變育種可以改良微生物的遺傳性狀，是現代食品工業及發酵工業中的重要育種途徑，也是近年來研究的熱點[12]。紫外誘變具有方法簡單，效果好，可在短時間內獲得大量突變體等優勢，在誘變育種中得到廣泛運用[13]。

乳酸菌及其EPS的應用一直受到國內外研究者的廣泛關注，目前雖已有較多關于此方面的研究，但不同的乳酸菌及其EPS的功能、結構均有所不同，因此對不同乳酸菌的益生功能還有待研究。我國各類自然發酵產品(如開菲爾粒[14]、果蔬自然發酵產品[15]等)不僅具有食用價值，同時蘊含著豐富的乳酸菌資源，對其利用還有待進一步開發。本研究從實驗室保藏乳酸菌(各類發酵產品中分離獲得)中篩選高產EPS菌株，并對其進行誘變，篩選正向突變菌株，比較原始菌株及誘變菌株對酸、膽鹽及人工模擬胃、腸液的耐受性，并對其EPS的抗氧化活性進行了測定，以期為擴大乳酸菌的綜合利用，以及乳酸菌EPS作為天然抗氧化劑提供理論基礎依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L1～L22均為實驗室保存乳酸菌菌株，其中L1～L12從市售益生菌粉、酸奶中分離獲得，L13～L18來源于甜橙、柚子自然發酵液，L18～L22從開菲爾粒中分離獲得。

透析袋，北京索萊寶科技有限公司；95%乙醇，廣州市泉碩貿易有限公司；三氯乙酸，天津市福晨化學試劑廠；牛膽鹽、胰蛋白酶，上海源葉生物科技有限公司；水楊酸、濃硫酸、苯酚，廣州市化學試劑廠；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼[1,1-Diphenyl- -1-(2,4,6-trinitrophenyl) hydrazyl，DPPH]、2, 2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽[2,2′-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS]，美國Sigma公司。

1.2 培養基及試劑配制

MRS培養基(g/L)：胰蛋白胨10.0，牛肉膏5.0，酵母粉4.0，葡萄糖20.0，吐溫-80 1.0，K2HPO4·7H2O 2.0，CH3COONa·3H2O 5.0，檸檬酸三胺 2.0，MgSO4·7H2O 0.2，MnSO4·4H2O 0.05，pH 6.0，121℃滅菌20 min。

人工模擬胃液：125 mmol/L NaCl、7 mmol/L KCl、45 mmol/L NaHCO3、3 g/L胃蛋白酶，pH調至3.0，0.22 μm濾頭過濾除菌。

人工模擬腸液：1 g/L胰蛋白酶、3 g/L牛膽鹽，pH調至7.5，0.22 μm濾頭過濾除菌。

ABTS+工作液：7.4 mmol/L ABTS與等體積2.6 mmol/L K2S2O8混合后于黑暗條件下靜置12 h，使用前用pH 7.4的PBS稀釋，使其在734 nm的吸光值為0.7±0.2。

1.3 儀器與設備

1285生物安全柜，美國Thermo Electron公司；Avanti J-E落地式高速大容量離心機，美國貝克曼庫爾特有有限公司；SpectraMax i3x連續波長多功能微孔板檢測平臺，美國Molecular Devices公司；Scientz-12N冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 菌株的活化

乳酸菌按2%接種量接種于MRS液體培養基中，于37 ℃條件下靜置培養12 h，活化2代備用。

1.4.2 EPS的提取及測定

參照WANG等的方法[16]并略作修改。活化后的乳酸菌按2%接種量接種于MRS液體培養基中，37 ℃培養24 h后于4 ℃，10 000 r/min條件下離心10 min，去沉淀，上清液中加入質量濃度為800 g/L的三氯乙酸，使其終質量濃度為4 g/L，于4 ℃下靜置6～8 h。4 ℃，10 000 r/min離心15 min，取上清液，加入3倍體積體積分數為95%的乙醇，在4 ℃冰箱中放置12～15 h后4 ℃，10 000 r/min條件下離心15 min，取沉淀，加入一級水溶解后，4 ℃離心10 min去除灰色不溶物。上清液移至透析袋中，蒸餾水透析，3 h后第1次換水，后每隔8 h換1次水，透析2 d，收集透析液進行真空冷凍干燥，即得粗多糖。以葡萄糖作為標準曲線，苯酚-硫酸法[12]測定EPS含量。

1.4.3 紫外誘變時間的選擇

乳酸菌活化后離心收集菌體，用9 g/L的生理鹽水清洗后稀釋至107CFU/mL，取2 mL于滅菌平皿中，在紫外燈(30 W，距離30 cm)下分別照射0、20、40、60、80、100、120、150、200、250 s。適當稀釋菌液后各取100 μL涂布于MRS平板中，在黑暗條件下37 ℃培養48 h，計數，計算致死率,如公式(1)所示:

(1)

1.4.4 紫外誘變及突變株穩定性測定

乳酸菌經紫外誘變后適當稀釋，涂布于MRS培養基中，37 ℃避光培養48 h，觀察菌落生長情況。挑取直徑較大，菌質稠厚的菌落進行培養，測定其EPS含量。對EPS產量顯著提高的乳酸菌進行二次紫外誘變并篩選出高產EPS突變菌株，將EPS產量提高的菌株連續培養10代，每隔2代進行發酵檢測其EPS含量，觀察其產EPS的穩定性。

1.4.5 菌株對酸、膽鹽及人工模擬胃、腸液的耐受性

1.4.5.1 對酸的耐受性

采用黃燕燕等的方法[17]并略作修改。活化菌株取500 μL接種到pH值為2.0、3.0、4.0的9.5 mL MRS培養基中，37 ℃培養3 h后適當濃度稀釋，微量點樣法點樣，于37 ℃培養48 h計數，按照公式(2)計算菌株對酸的耐受性：

(2)

式中：A1為接種到MRS培養基中培養3 h后的活菌數；A0為接種到MRS培養基中培養0 h后的活菌數。

1.4.5.2 對膽鹽的耐受性

參照文獻方法[17]并稍作修改。活化菌株取250 μL接種到含2.0、3.0、4.0 g/L牛膽鹽的5 mL MRS液體培養基中，37 ℃培養24 h，適當濃度稀釋后點樣，于37 ℃條件下培養48 h后計數，計算活菌數。

1.4.5.3 對人工模擬胃、腸液的耐受性

根據李巖巖的方法[18]并略作修改。菌株活化后，取1 mL菌液于4 ℃條件下10 000 r/min離心5 min，收集菌體，無菌生理鹽水洗滌2次，接種于9 mL人工模擬胃液中，以無菌生理鹽水作為對照，37 ℃培養2 h后點樣，于37 ℃培養48 h后計數。另取1 mL經人工模擬胃液處理的菌液于9 mL人工模擬腸液中處理8 h，每2 h取樣測定其活菌數。

1.4.6 乳酸菌EPS的抗氧化活性的測定

將粗提EPS溶于蒸餾水中配置成不同濃度的溶液，參照文獻的方法[1,19-20]并稍作修改進行抗氧化活性的測定，以相同濃度的抗壞血酸(ascorbic acid，VC)作為陽性對照。

1.4.6.1 清除DPPH自由基的能力

A1,150 μL EPS溶液加入150 μL 0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液；A2,150 μL EPS溶液加入150 μL無水乙醇；A0,150 μL無水乙醇加入150 μL 0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液。配制A0、A1、A2 3種溶液，混勻后于黑暗下靜置30 min，測其OD517nm，以VC為陽性對照，按公式(3)計算DPPH清除率：

(3)

式中：A0、A1、A2分別為A0、A1、A2 3種溶液的OD517nm。

1.4.6.2 清除ABTS自由基的能力

A1,30 μL EPS溶液加入1.5 mL ABTS+工作液中；A2,30 μL EPS溶液加入1.5 mL K2S2O8中；A0,30 μL蒸餾水加入1.5 mL ABTS+工作液中。配制A0、A1、A2 3種溶液，混勻后于37 ℃條件下反應5 min，測其OD734nm，以VC為陽性對照，按照公式(4)計算ABTS清除率：

(4)

式中:A0、A1、A2分別為A0、A1、A2 3種溶液的OD734nm。

1.4.6.3 清除羥自由基(·OH)的能力

配制A0、A1、A2 3種溶液：A1，各取50 μL硫酸亞鐵溶液(9 mmol/L)、水楊酸-乙醇(9 mmol/L)、H2O2(8.8 mmol/L)加入50 μL EPS溶液中；A2,以蒸餾水替代過氧化氫；A0,以蒸餾水替代EPS溶液。混勻后于37 ℃黑暗條件下反應30 min，測其OD510nm，以VC為陽性對照，按公式(5)計算·OH清除率:

(5)

式中：A0、A1、A2分別為A0、A1、A2 3種溶液的OD510nm。

(6)

式中：A0、A1、A2分別為A0、A1、A2 3種溶液的OD320nm。

1.5 統計分析

試驗涉及的數據均重復3次或3次以上，采用SPSS 16.0對數據進行統計分析，以P<0.05表示數據具有統計學差異。

2 結果與分析

2.1 高產EPS菌株的篩選

采用苯酚-硫酸法檢測乳酸菌的EPS產量，以葡萄糖制作標準曲線得到方程為y=0.006 8x+0.101 2，R2=0.998 2。由圖1可知22株乳酸菌的EPS產量在79.70～171.95 mg/L，L3、L15、L16的EPS產量明顯高于其他乳酸菌，其中L15最高，產量達到175.88 mg/L，因此后續實驗選取L15為試驗菌株進行研究。

圖1 不同乳酸菌的EPS產量
Fig.1 The EPS production of the different strains ofLactobacillus
注：圖中不同字母表示差異顯著性(P<0.05)(下同)

2.2 誘變時間的確定

對L15菌懸液進行紫外照射處理后，計算不同照射時間對菌株的致死情況。由圖2可知，隨著紫外處理時間的增加，菌株的致死率也隨之提升，L15對紫外較為敏感，當誘變時間為20 s時，菌株致死率為78.49%，40～150 s時，致死率均已達90%以上。采用致死率70%～80%的誘變劑量有利于提高菌株正突變率[21]，因此選擇20 s為最佳誘變時間。

圖2 紫外誘變時間對L15致死率的影響
Fig.2 Effect of UV mutation time on the mortality of L15

2.3 高產EPS突變菌株的篩選

L15菌懸液經紫外照射20 s后，涂布于MRS平板37 ℃培養48 h。直徑較大，菌質稠厚的菌落可能為產EPS能力較強的菌株，因此挑選此類菌株進行發酵，測定其EPS含量，各突變株EPS產量如表1所示。挑取的25株突變菌株與原始菌株相比，EPS產量都有了不同幅度的提升，其中L15U1-3產量最高，達到224.52 mg/L，與原始菌株的EPS產量(175.88 mg/L)相比提高了27.66%。

表1 一輪紫外誘變突變菌株EPS產量(x±SD，n=4)Table 1 Yield of EPS of the strains mutated by first round of UV-mutation

對L15U1-3進行二輪紫外誘變，測定36株菌落直徑較大，菌質稠厚的菌株的EPS產量。36株突變菌株中共有32株菌呈現正向突變，EPS產量有所提高，其中L15U2-26產量與原始菌株相比提高了32.10%，達到232.34 mg/L，但與L15U1-3相比，其EPS產量并無太大提升。

表2 二輪紫外誘變突變菌株EPS產量(x±SD，n=4)Table 2 Yield of EPS of the strains mutated by second round of UV-mutation

2.4 突變菌株遺傳穩定性的檢驗

對EPS產量提高較大的突變菌株連續傳代10次，每2代測定1次EPS產量，觀察其產EPS穩定性，結果如圖3所示。7株EPS產量較高的菌株中，L15U2-26穩定性最好，在傳代10次中，其EPS產量均無明顯差異。而其他菌株的EPS產量在傳代過程中，均呈現出顯著性差異，遺傳性狀不夠穩定。

圖3 突變菌株產EPS的穩定性
Fig.3 The genetic stability of the mutant strains for producing EPS

2.5 誘變菌株對酸、膽鹽及人工模擬胃腸液耐受性的測定

乳酸菌必須以活菌形態到達消化道，才能發揮其體內益生性能。而影響乳酸菌在胃腸道中定植的因素主要包括胃液的低pH、高濃度的膽鹽脅迫以及胃腸道中的消化酶。

乳酸菌的耐酸性是確保其通過胃液進入腸道的必要條件之一，L15、L15U2-26在pH值為2.0的MRS培養基中培養3 h后，存活率均為0%；而在pH值為3.0、4.0時，其存活率不降反增，分別為123.49%、155.31%，L15U2-26的存活率則分別為132.40%、158.45%(圖4-a)。人在進食后胃液的pH值在3.0～3.5[22]，2株菌在胃液的低pH值環境下能夠良好存活甚至緩慢生長，均具有很好的耐酸性能。

乳酸菌經過胃液后，還需能夠耐受十二指腸中高濃度的膽鹽，正常人體小腸的膽鹽波動在0.03%～0.3%即0.3～3.0 g/L[17]。由圖4-b可知，在膽鹽處理0 h時，2株乳酸菌的活菌數均在107CFU/mL以上，在含膽鹽的MRS培養基中培養24 h后，隨著膽鹽質量濃度的增加，其活菌數也隨之減少，在膽鹽質量濃度為2.0、3.0 g/L時，其活菌數均在105CFU/mL以上，在膽鹽質量濃度為4.0 g/L時，其活菌數降到了104CFU/mL。

a-耐酸性;b-膽鹽耐受性
圖4 乳酸菌對酸、膽鹽的耐受性測定
Fig.4 Determination of the tolerance ofLactobacillusto acids and bile salts

乳酸菌在消化道中定植，除了要耐受胃腸液中的低pH環境和高濃度膽鹽外，還需經受胃腸道中消化酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶等)的考驗。如圖5所示，人工胃液消化2 h后，2株菌的活菌數沒有顯著變化，均保持在108CFU/mL以上，取經胃液消化的菌液進行腸液處理，2 h后，活菌數顯著下降，從107CFU/mL下降至105CFU/mL，隨著時間延長，其活菌數緩慢下降，但仍維持在105CFU/mL以上。在8 h后，L15的活菌數下降至104CFU/mL，但L15U2-26仍維持在105CFU/mL。

a-胃液;b-腸液
圖5 乳酸菌對人工模擬胃、腸液的耐受性測定
Fig.5 Tolerance ofLactobacillusto artificial simulated gastric and intestinal fluid

EPS可以增強細菌的抗逆性，同時也為其在各種生物或者非生物表面定植及生物被膜的附著提供條件[23]。乳酸菌EPS有利于其在消化道定植，發揮其益生功能。FEDORV等發現高產EPS(121～650 mg/L)的羅伊氏乳桿菌對膽鹽、胃液、腸液的耐受性顯著高于不產EPS(<20 mg/L)的羅伊氏乳桿菌，且對胃腸液的耐受性與EPS的產量呈現正相關[24]。本研究中L15U2-26對低pH、胃腸液的耐受性稍高于L15，但并未達到顯著性差異，猜測可能是兩者的EPS產量相差不大，不足以使L15U2-26更好地適應環境。

2.6 誘變菌株及原始菌株的抗氧化活性

本文檢測不同濃度多糖對DPPH自由基、ABTS自由基、羥自由基、超氧陰離子的抗氧化活性，并對誘變前后菌株所產多糖的抗氧化活性進行比較。DPPH自由基是相對穩定的自由基，清除DPPH自由基是評估抗氧化能力最廣泛使用的指標。圖6-a中L15、L15U2-26 EPS質量濃度為0.50～8.00 mg/mL時，對DPPH清除率分別為18.38%～76.88%、17.35%～72.41%，隨著EPS濃度的上升，清除率也呈上升趨勢，具有明顯的劑量依賴性。MIN等[6]發現植物乳桿菌EPS(10 mg/mL)對DPPH自由基的清除率為60.5%，LIU等[29]研究中，副干酪乳桿菌和植物乳桿菌在EPS質量濃度為10 mg/mL對DPPH的清除率分別為91.82%、81.15%，本研究結果優于MIN等[6]，與LIU等[29]的相似。ABTS自由基清除率也是評價抗氧化能力常用的指標之一，L15、L15U2-26對ABTS的清除率分別為12.87%～71.79%、10.73%～76.25%(圖6-b)，呈現一定的濃度依賴性。羥自由基被認為是最具反應活性的自由基，易與周圍細胞生物分子發生反應，對細胞或生物分子造成嚴重的氧化損傷，導致衰老、癌癥等疾病[16]。L15、L15U2-26 EPS對羥自由基的清除率弱于DPPH及ABTS(圖6-c)，分別為29.70%～44.16%、30.94%～49.51%，與劉煜君等的結果相似[30]。超氧陰離子2株菌的EPS對超氧陰離子的清除能力較低，分別為8.11%～15.38%、13.64%～23.94%(圖6-d)，研究發現3株副干酪乳桿菌EPS在質量濃度為400 mg/L時，對超氧陰離子的清除率分別為24.86%、34.55%、19.44%[31]，與本研究結果相近。

a-DPPH自由基;b-ABTS自由基;c-羥自由基;d-超氧陰離子
圖6 EPS的抗氧化活性測定
Fig.6 Determination of the antioxidant activity of EPS

總的來說，突變菌株及原始菌株所產EPS均具有良好的抗氧化活性，但兩者的抗氧化效果并未出現明顯差異，可能紫外誘變只提升了菌株產EPS的能力，并未改變其結構。

3 結論

對高產EPS菌株進行兩輪紫外誘變并對突變菌株進行遺傳穩定性實驗，最終得到1株高產EPS且穩定性良好的菌株L15U2-26，對原始菌株及突變菌株的益生特性進行了測定比較。發現原始菌株及突變菌株對酸、膽鹽、人工模擬胃腸液都有較好的耐受性，其中突變菌株的耐受性略高于原始菌株，但并未呈現顯著性差異，原始菌株及突變菌株的EPS同時也具備良好體外抗氧化活性，這為乳酸菌益生功能的進一步開發利用提供了理論依據，但是其體內益生活性及其抗氧化機理還有待進一步研究。