蘋果中有機酸-果膠復合體系的理化特性及穩定性

任佳琦，劉昕，雷琳，趙吉春，曾凱芳,2，明建,2*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)2(西南大學 食品貯藏與物流研究中心，重慶，400715)

中國是世界第一大蘋果生產國，種植廣泛，品種豐富。將蘋果進行深加工，既能提高蘋果的附加值，也可以滿足當代快節奏生活的需要。蘋果加工制品包括蘋果汁、干、醋、醬、罐頭等，其中蘋果汁是世界上第二大果汁產品，是蘋果加工的主要方向。蘋果汁可分為清汁與濁汁兩大類，近年來，蘋果濁汁因其新鮮天然、營養價值高、風味良好、方便安全而備受關注，市場占有率不斷上升[1]。濁汁體系穩定性不佳是限制濁汁加工產業發展的關鍵因素，研究表明，果膠多酚、蛋白質是引起濁汁渾濁的主要成分，而引起渾濁的主要影響因素為酸度、離子強度與帶電性質、溫度及酶[2]。目前關于濁汁體系穩定性的研究主要集中在加工方式[3]、添加穩定劑[4]、探究大分子之間相互作用機理[5]等方面，鮮少有蘋果自身內源因素影響穩定性的研究報道。

果膠是一種廣泛存在于植物細胞壁的復雜多糖，由D-吡喃半乳糖通過α-1,4-糖苷鍵連接成長鏈，具有良好的增稠性及穩定性[6]。在濁汁體系中，果膠為相互作用的顆粒提供了保護涂層，從而保證了果汁中顆粒的穩定性[3]。蘋果中富含有機酸，在新鮮果蔬直接榨汁過程中，有機酸作為一種內源因子，不可避免的會影響體系微環境(如pH、離子強度)或與體系內物質反應[7-8]。品種、成熟度、產地不同的蘋果原料之間存在明顯差異，會對蘋果濁汁的酸度有較大影響[1]。而濁汁中有機酸的存在可能會對果膠結構產生影響，結構變化將進而影響黏度的變化[9]，最終對體系的穩定性產生影響。

因此本研究模擬濁汁體系，選擇蘋果中含量較高的3種有機酸(蘋果酸、檸檬酸、酒石酸)并根據在不同品種中的含量確定濃度梯度[10]。旨在探究有機酸作為內源因子對與蘋果果膠組成的復合體系的結構、理化特性及穩定性的影響。研究結果將為改善蘋果混濁果汁產品原料選取，提高產品穩定性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果果膠(APA系列103，酯化度65%，分子質量為160 kDa)，煙臺安得利果膠股份有限公司；蘋果酸、酒石酸，上海源葉生物科技有限公司；檸檬酸，成都市科龍化工試劑廠；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

UV-2450紫外分光光度計,日本島津公司；Spectrun100傅里葉紅外光譜儀,美國PerkinElmer公司；ZEN3690馬爾文激光粒度分析儀,英國馬爾文儀器公司；MCR302流變儀,奧地利安東帕公司；SYNERGYH1MG全波長酶標儀,美國基因公司；Phenom Pro掃描電鏡,荷蘭Phenom Pro公司；TGA550熱重分析儀,美國TA公司；LC-20A高效液相色譜儀,日本島津公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備

將蘋果果膠(pectin，PT)、蘋果酸(malic acid，MA)、檸檬酸(citric acid，CA)、酒石酸(tartaric acid，TA)在環境溫度下分別于超純水中分散2 h后，將PT溶液分別與不同有機酸溶液混合再分散2 h。得到PT質量濃度為5 g/L，有機酸濃度依次為0.31、3.15、6.29、18.88、37.76 mmol/L的混合體系(混合體系按照濃度增加順序以A～E依次編碼)。5 g/L PT溶液作為對照。樣品制備后部分存放于-40 ℃冰箱中，部分使用真空冷凍干燥為粉末保存，待用。

1.3.2 pH的測定

復合膜液pH采用85-2A pH計進行測量，每個樣品平行測量3次，取平均值。

1.3.3 紫外光譜的測定

移取3 mL待測樣品于石英比色皿中，以超純水作為參比，于室溫(25 ℃)檢測樣品在200～660 nm的紫外吸收光譜。

1.3.4 傅里葉變換紅外光譜測定

精確稱取6 mg凍干樣品與300 mg KBr于瑪瑙研缽中混合研磨，取研磨后樣品3份(每份75 mg)置于45 ℃烘箱中烘干2 h后進行壓片測量。以KBr為背景進行掃描，400～4 000 cm-1掃描范圍，掃描分辨率4 cm-1，累計掃描32次。

1.3.5 單糖組成測定

最高濃度有機酸與PT復合體系在水中透析(8 kDa～14 kDa)8 h后凍干得到樣品，參考王文俊[11]的方法并略有修改。

樣品的酸水解：精確稱取2 mg樣品于安瓿瓶中，加入2 mL 4 mol/L三氟乙酸，酒精噴燈封管，110 ℃烘箱酸解3 h后冷卻至室溫，使用氮吹儀吹干。加少量水溶解，用0.1 mol/L NaOH調節pH至中性后定容至1 mL。

衍生物的制備：分別精確稱取甘露糖(Man)、鼠李糖(Rha)、半乳糖醛酸(GalA)、半乳糖(Gal)、木糖(Xyl)、阿拉伯糖(Ara)、巖藻糖(Fuc)，等摩爾混合得到濃度為2 mmol/L的7種標準單糖混合溶液。分別精確吸取1 mL上述水解待用樣品及400 μL混標，加入50 μL 0.02 mol/L乳糖溶液作為內標，接著加入450 μL 0.3 mol/L NaOH及450 μL 0.5 mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮溶液，漩渦振蕩，充分混勻。70 ℃水浴反應30 min，冰水浴冷卻10 min。再加入450 μL 0.3 mol/L HCL，1 mL氯仿進行萃取，渦旋5 min，離心(10 000 r/min，5 min)。反復萃取3次，最后一次水層過0.45 μm水系濾膜。

高效液相色譜分析條件：Thermo BDS-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫40 ℃；二極管陣列檢測器，檢測波長250 nm。進樣體積：20 μL。流動相：A相為15%(體積分數)乙腈+0.05 mol/L KH2PO4-NaOH緩沖溶液；B相為40%(體積分數)乙腈+0.05 mol/L KH2PO4-NaOH緩沖溶液；進行階段連續梯度洗脫。洗脫時間階段為0 min～10 min～40 min～50 min～57 min；洗脫液中B相對應時間梯度的濃度變化為0%～10%～30%～0%～0%；洗脫流速為0.7 mL/min。

1.3.6 掃描電子顯微鏡測定

冷凍干燥后的樣品放置于粘臺后進行噴金處理，在加速電壓10 kV下觀察樣品的微觀結構。

1.3.7 流變特性測定

采用藥匙舀取樣品，樣品周圍涂抹硅油以防止水分蒸發。選定錐板，型號為cp60-1(60 mm，1°)；掃描溫度25 ℃；流動曲線測量模式；剪切速率變化，0.1～100 s-1。測試完畢后對數據進行數學公式擬合，成功應用于Power Law方程：

σ=KPLγn

(1)

式中：σ為剪切應力，Pa；KPL為稠度系數，Pa·s；γ為剪切速率，s-1；n為非牛頓指數。

1.3.8 熱穩定性測定

取3 mg凍干樣品平鋪于石英坩堝中，在氮氣環境中進行熱重分析，升溫速率為10 ℃/min，溫度范圍為30～800 ℃。系統自動采集數據。

1.3.9 粒徑測定

蒸餾水作為測量背景，取1 mL待測樣品放入激光粒度儀的樣品池中進行粒徑及分布的檢測。25 ℃，633 nm下進行測量。

1.3.10 濁度測定

將所有樣品置于漩渦振蕩器中混合振蕩均勻，取200 μL于96孔板中，在650 nm處測量吸光值，吸光值即樣品的濁度。

1.3.11 濁度保留率測定

將各樣品分為離心、不離心2部分，離心部分經離心機以3 500 r/min 離心15 min。取離心前后樣品上清液各200 μL加入96孔板中，記錄650 nm處吸光值。離心前后樣品吸光度值分別為A1、A2。按照公式(2)計算濁度保留率：

(2)

1.4 數據處理

所有實驗均重復3次，每次測試均需更換樣品。利用Origin 8.1軟件作圖。使用SPSS 19.0軟件對數據進行ANOVA差異顯著性分析與t檢驗。

2 結果與分析

2.1 復合體系pH值

果膠是一種酸性雜多糖，分子中含有65%以上的GalA，pH值一般在3～4(1%濃度條件下)[12]。本實驗所用5 g/L PT水溶液的pH為3.39。隨著體系內有機酸濃度的增大，有機酸-果膠復合體系pH值顯著降低，其中TA-PT E體系下降最多，pH值由3.39下降至2.12。其次是PT-CA E體系下降至2.27，PT-MA E體系pH值為2.33。不同復合體系之間pH值的差異是由不同有機酸之間的酸性強弱所致。

圖1 不同濃度MA、CA、TA與PT復合體系pH值
Fig.1 The pH value of different concentrations of MA, CA, TA with PT composite systems
注：圖中A～E表示有機酸濃度依次增加；不相同小寫字母 表示差異顯著(P<0.05)

2.2 紫外光譜分析

β-消除反應和酸水解是PT的2種非酶降解機理，其中β-消除反應會生成碳碳不飽和雙鍵，在235 nm處出現吸收峰[13]。由圖2可知，PT于203 nm處出現最大吸收峰，符合果膠多糖的特征吸收峰[14]。在270 nm處存在1個微小肩峰，可能是由于選取的商業PT純度不高，存在微量雜質所致。PT特征峰吸收強度隨著有機酸濃度的增加有規律地增強，對應波長處存在著不同程度的紅移現象。隨著MA濃度的增加，對應吸收峰從205 nm紅移至215 nm；PT-CA復合體系由204 nm紅移至213 nm；PT-TA復合體系則由204 nm遷移至215 nm處。這可能與體系內有機酸的引入有關。有機酸在210 nm附近處有較強吸收，且有機酸的引入會改變體系的極性，造成吸收峰的偏移[15]。圖譜中并未出現新的吸收峰，表明有機酸與果膠復合過程中無不飽和鍵生成，果膠未發生β-消除反應。

a-PT-MA復合體系；b-PT-CA復合體系；c-PT-TA復合體系
圖2 不同濃度MA、CA、TA與PT復合體系紫外光譜圖
Fig.2 UV-vis spectrum of different concentrations of MA, CA, TA with PT composite systems
注：圖中A～E表示有機酸濃度依次增加

2.3 紅外光譜分析

a-PT-MA復合體系；b-PT-CA復合體系；c-PT-TA復合體系
圖3 不同濃度MA、CA、TA與PT復合體系紅外光譜圖
Fig.3 The Fourier transform infrared spectrum of different concentrations of MA, CA, TA with PT composite systems
注：圖中A～E分別表示有機酸濃度依次增加

2.4 單糖組成分析

果膠主要由GalA的線性鏈組成，偶爾會被L-Rha打斷，同時還含有其他中性糖側鏈。果膠分子主要由半乳糖醛酸聚糖(HG)，鼠李半乳糖醛酸聚糖I型(RG-I)，鼠李半乳糖醛酸聚糖II型(RG-II)型，木糖半乳糖醛酸聚糖(XGA)4種結構域單元組成[20]。由紅外光譜可知，有機酸對PT的單糖含量產生一定影響。選取本實驗中各有機酸最高濃度復合體系進行單糖組成分析，結果如表1所示。

表1 MA、CA、TA對PT單糖組成的影響Table 1 Effects of MA, CA, TA on the monosaccharide composition of PT

注：K=GalA/(Fuc+Rha+Ara+Gal+Xyl)；表中E代表有機酸最高濃度；*代表與PT相比有顯著性差異(P<0.05)；**代表極顯著差異(P<0.01)

由表1可知，PT中GalA的含量最高，主要含有Rha、Gal和Xyl。MA作用后，PT中Man含量顯著增加，而Gal含量顯著下降，表明Gal相應的支鏈減少。同等濃度CA作用后， PT中Man、GalA含量顯著增加。TA作用后，GalA含量上升，Rha、Gal、Ara含量下降，TA可能破壞了對應單糖之間的糖苷鍵。綜合3種有機酸處理得出，有機酸會使PT發生水解，其中Ara、Gal、Rha較易脫去。推測在酸性條件下，Ara、Gal、Rha較不穩定，而GalA及Man的比例有所上升，推測二者在酸性條件下穩定性較高。此推測與ROUND等[21]的研究結果相似。

Rha/GalA反映了果膠RG構型對整體果膠構型的貢獻程度。當果膠的比值介于0.05～1時，其分子結構主要為RG-I型。而當比值低于0.05時，則主要為HG型和RG-Ⅱ型。樣品檢測均位于0.05～1，為RG-I型果膠。(Ara+Gal)/Rha值可粗略估計RG-I型果膠結構的分支程度，數值越大，表明中性糖連接到RG-I型主鏈上的側鏈越長。GalA/(Fuc+Rha+Ara+Gal+Xyl)代表了果膠鏈的線性度，其值越大，果膠鏈的線性度越高。由上表可知，37.76 mmol/L TA處理后的PT線性度增加，支鏈長度降低，同濃度MA及CA處理后也呈現相同趨勢。

2.5 掃描電鏡分析

圖4為不同濃度不同有機酸與PT復合體系的掃描電鏡圖，從左至右有機酸濃度依次增加。由圖4可以看出，凍干PT整體呈現板狀結構，表面粗糙多孔，且有似蜂窩狀的結構穿插其中。3種有機酸的引入對PT網絡結構的影響相似。隨著有機酸的加入，復合體系均難以保持PT原有的板狀結構，表面由粗糙變為光滑，孔狀結構消失。不同的微觀結構意味著有機酸的加入打亂了原有體系內PT分子之間形成的網絡結構。在PT-MA體系中，低濃度時，PT呈現細絲狀，排列松散無序。隨著濃度的增加，體系逐漸由絲狀變為小層片狀，排列逐漸緊湊致密。這些貌特征與YANG等[22]的研究相似，這可能是由于果膠發生了降解或是解團聚引起的[23]。CA、TA與PT的復合體系具有相似影響。

圖4 不同濃度MA、CA、TA與PT復合體系的掃描電子 顯微鏡圖
Fig.4 Scanning electron micrographs of different concentrations of MA, CA, TA with PT composite systems
注：圖中A～E分別表示有機酸濃度依次增加，放大倍數250X

2.6 靜態剪切分析

由圖5可知，不同濃度有機酸與果膠的復合體系均表現出明顯的剪切稀化現象，即隨著剪切速率的增大，復合體系黏度下降。果膠是由鏈狀分子構成的大分子聚合物，低剪切速率時，分子間互相纏結，黏度較大；當速率變大時，鏈狀分子受到流層間剪切應力作用，分子構象破壞，發生滾動旋轉收縮成團，黏度降低。在有機酸的存在下，復合體系整體黏度值均低于PT溶液，這一結果與吳劍夫[24]的研究結果相似。這可能是由于果膠水溶液自身為弱酸性，分子之間通過斥力等作用分散在水中，有機酸的加入引入H+，抑制果膠中半乳糖醛酸羧基的電離，減弱靜電作用，果膠分子卷曲，黏度降低[25]。

a-PT-MA復合體系；b-PT-CA復合體系；c-PT-TA復合體系
圖5 不同濃度MA、CA、TA與PT復合體系表觀黏度曲圖
Fig.5 Apparent viscosity curve of different concentrations of MA, CA, TA with PT composite systems
注：圖中A～E分別表示有機酸濃度依次增加

對各復合體系數據進行模型擬合，結果如表2所示。擬合數據的R2值均大于0.999，該模型數據擬合情況良好。其中n<1，表明所有復合體系均為假塑性流體；n值越接近1，體系越接近于牛頓流體。KPL為稠度系數，數值越高，表明體系黏度越高[26]。根據表2，隨著體系內MA濃度的增大，PT-MA復合體系KPL持續下降，于18.88 mmol/L(PT-MA D)處時到達最低，n值呈現相反趨勢，表明復合體系在此條件下黏度值最低，最接近于牛頓流體。隨著MA濃度繼續增加，其黏度有所回升但仍舊低于PT溶液，假塑性增強。PT-CA復合體系中，隨著CA濃度的增大，KPL值逐漸降低，n值逐漸增大，當達到37.75 mmol/L(PT-CA E)時，體系黏度顯著降低，更接近于牛頓流體。對于TA-PT復合體系，TA使得體系黏度顯著降低，n值顯著升高；但體系n值、KPL值與TA濃度不呈現明顯的規律性。總體來說，有機酸的存在，會使得復合體系黏度降低，假塑性減弱。果膠中單糖組成的變化可能導致了黏度的下降[27]，復合體系粒徑下降，果膠卷曲，也會導致體系黏度降低。

2.7 熱重分析

果膠的熱穩定性影響著其應用范圍，熱重分析可反應樣品的熱力學特性。選取各有機酸最高濃度進行測試，結果如圖6所示，其中圖6-c～圖6-f實線為樣品的熱重圖像，反應物質質量隨溫度的變化，虛線為微分熱重曲線，表明樣品質量損失所經過的階段。由圖6可知，PT的質量損失可分為3個階段。30～100 ℃為第一階段，主要為自由水的散失，失重率為8.916%。100～200 ℃為第二階段，主要為結合水、氫鍵、其他揮發性物質的損失，失重率為10.629%；主要質量損失為第三階段，失重率為41.583%，主要是PT受熱分解導致的質量快速損失，糖苷鍵被打斷，GalA鏈大量熱降解，然后發生二次降解，羧酸基團在糖環上發生脫羧反應，產生各種氣體成分，形成固態焦物[28]。PT-MA E復合體系主要質量損失階段失重率為49.888%。失重率較PT增加，最大失重溫度下降。PT-CA E微分熱重曲線表明該復合體系主要質量損失有2個階段，第一階段最大失重溫度為184.91 ℃，失重率為39.158%，主要為CA及結合水引起[29]，第二階段，主要為PT糖苷鍵斷裂，失重率為22.886%。PT-TA E體系主要質量損失階段失重率為59.277%，最大失重溫度為213.508 ℃。添加有機酸后，復合體系的失重率增大，熱穩定性下降，可能是因有機酸加入后破壞PT網絡結構，使得分子間相互作用力降低，體系網絡結構疏松引起。

表2 不同濃度MA、CA、TA與PT混合體系Power Law 模型擬合參數表Table 2 Power Law model parameters of different concentrations of MA，CA，TA with PT composite systems

注：表中A～E分別表示有機酸濃度依次增加；不相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

a-熱重分析圖；b-微分熱重曲線；c～f-不同樣品的熱重(實線)及微分熱重曲線(虛線)圖
圖6 MA、CA、TA與PT復合體系熱重分析圖
Fig.6 Thermogravimetric analysis of MA, CA, TA with PT composite systems
注：圖中E代表有機酸最高濃度

2.8 粒徑分析

平均粒徑可以用于表示溶液中溶質顆粒的粒徑大小情況，一定程度上反映聚合物在溶液中的聚集狀態。蘋果汁的云狀顆粒穩定性通常遵循斯托克斯沉速公式，其中顆粒粒徑與沉降速度成正比[30]。有機酸的加入能夠明顯降低體系內的粒徑，且粒徑隨著有機酸濃度的增大而降低。可能是因為有機酸的加入引起了果膠的水解，果膠發生解團聚，或是靜電作用減弱，果膠分子卷曲所致[25]。這一結果也可以解釋表觀黏度的降低及單糖組成的改變。

圖7 不同濃度MA、CA、TA與PT復合體系粒徑圖
Fig.7 Particle size of different concentrations of MA， CA，TA with PT composite systems

2.9 濁度及濁度保留率分析

由2.2可知650 nm處果膠與有機酸均無吸收峰存在，因此選取650 nm為濁度測量波長。不同濃度MA、CA、TA與PT復合體系濁度及濁度保留率如表3所示。溶液的濁度可以在一定程度上反映溶液中溶質的聚集或分散情況。加入有機酸后，濁度的變化與有機酸濃度之間并不呈現規律變化。CA的加入對于體系濁度無顯著影響。6.29 mmol/L MA及3.15 mmol/L TA會使得體系渾濁度增加，此時二者復合體系pH為2.84、2.86、6.29 mmol/L CA時體系pH為2.81，濁度為PT-CA體系最大值。因此推測體系濁度可能與體系pH有關，魏立威[3]的研究也得到相似結論。在pH為2.8左右時，復合體系濁度達到最大值。溶液的渾濁穩定性可簡單的用溶液經離心力作用后其濁度保留率來衡量。保留率越大，表明溶液的渾濁穩定性越好。3種有機酸的加入均使得復合體系濁度保留率下降，有機酸的存在會降低PT溶液的濁度保留率，可能與體系黏度的下降有關。

表3 不同濃度MA、CA、TA與PT混合體系濁度及濁度保留率Table 3 Turbidity and turbidity retention of different concentrations MA、CA、TA with PT composite systems

注：表中A～E分別表示有機酸濃度依次增加；不相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

3 結論