小黃姜多糖的分離純化及其結構特征及抗氧化活性研究

宋麗麗，聞格，霍姍浩，胡曉龍,3，彭惠

1(鄭州輕工業大學 食品與生物工程學院，河南 鄭州，450001)2(河南省人民醫院，河南 鄭州，450003) 3(河南仰韶酒業有限公司博士后創新實踐基地，河南 三門峽，472000)

多糖是構成生命活動的基本物質之一，廣泛存在于動物、植物及微生物細胞中，是一類由單糖通過α或β糖苷鍵連接而成的天然高分子多聚物[1]。天然多糖除了有免疫調節、抗腫瘤的生物學效應外，還有抗衰老、抗疲勞、抗氧化、降血糖、抗凝血等作用，且其對機體毒副作用小[2]，在醫藥、發酵工業、食品工業等領域受到廣泛關注。

生姜，是我國傳統的香辛類蔬菜，作為衛生部首批公布的藥食兼用植物資源，含有多種功能活性成分。生姜具有較好殺菌解毒、止吐、降血脂、抗炎、抗氧化、抑制腫瘤、保肝等保健功能，但其作用機理及對更多人類疾病的輔助治療作用都還有待深入研究[3]。目前市場上對生姜的深入開發利用較少，開發具有自主知識產權的高附加值姜類產品將帶來更大的社會效益和經濟效益。生姜藥用以小種姜為好，小種姜又名小黃姜。小黃姜中的化學成分達兩百余種，其中含有多種對人體健康有益的成分，包括姜黃素、姜辣素、微量元素、姜糖蛋白和姜多糖等[4-6]。姜中含有的活性多糖是一種優質的功效成分資源。與普通生姜相比，云南小黃姜個頭小、肉質緊實，姜辣素和姜精油含量更高，因此有“御姜”、“藥姜”和“月子姜”的美譽，具有潛在的藥用價值[7]。目前對小黃姜多糖的研究僅限于提取工藝的優化，而對多糖結構和生理功能的解析較少[8]。

本研究以云南小黃姜作為原料，以復合酶解結合水提醇沉法提取小黃姜多糖，研究其理化性質及結構特征，進一步考察其體外抗氧化活性，為小黃姜多糖活性成分的深入研究及藥用功能的發揮奠定研究基礎，為小黃姜資源的深入開發利用提供方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

(1)實驗材料：新鮮小黃姜購于云南當地菜市場，烘干，粉碎，待用。

(2)實驗試劑：DEAE 纖維素-52，美國Whatman公司；Sephadex G-100，美國Pharmacia公司；KBr(光譜純)、單糖標準品、2,2′-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、纖維素酶、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、剛果紅，美國Sigma-Aldrich公司；木瓜蛋白酶、NaCl、正丁醇、氯仿、苯酚、三氟乙酸、鄰苯三酚、鄰二氮菲、無水乙醇、FeSO4和H2O2等，天津市富宇精細化工有限公司。

1.2 儀器與設備

FW 100高速萬能粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司；RE-52AA旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；電熱恒溫水浴鍋、電熱恒溫鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；ME204/02電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；DHL-B電腦恒流泵、DBS-100電腦全自動部分收集儀，上海青浦滬西儀器廠；LPS-1280B真空冷凍干燥機，無錫萊浦儀器設備有限公司；UV-1800紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；Vertex 70v傅里葉變換紅外光譜儀，德國布魯克儀器公司；高效液相色譜儀1260，美國安捷倫公司；Diamond TG/DTA綜合熱分析儀，美國Perkin Elmer公司；DAWNHELEOS Ⅱ 多角度激光散射凝膠色譜系統，美國懷雅特公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 小黃姜多糖的提取和精制

1.3.1.1 小黃姜粗多糖的提取

稱取50 g小黃姜粉，加入1 L蒸餾水(固液比為1∶20)，浸泡過夜后加入5 g/L纖維素酶，50 ℃水浴攪拌反應3.5 h，再加入0.5 g/L木瓜蛋白酶反應45 min后，轉移到90 ℃的水浴中保溫攪拌4 h。過濾，濾液減壓濃縮至1/5體積，加等體積的Sevage試劑[V(正丁醇)∶V(氯仿)=4∶1]，混合液離心15 min，保留上清液。將四倍量的乙醇緩慢加入并不斷攪拌，離心收集沉淀。少量蒸餾水溶解多糖沉淀物，將多糖溶液轉移至透析袋中流動水透析24 h，真空冷凍干燥得到小黃姜粗多糖樣品。

1.3.1.2 小黃姜多糖的純化

稱取100 mg小黃姜粗多糖樣品溶于20 mL去離子水中，用0.22 μm孔徑的濾膜過濾后，加入已平衡好的DEAE纖維素-52色譜柱中。用0、0.01、0.02、0.03、0.04 mol/L的NaCl溶液依次進行梯度洗脫，每梯度收集20管，每管5 mL，苯酚-硫酸法檢測波長490 nm的吸光度，繪制洗脫曲線，收集同一組分多糖，旋轉蒸發濃縮后用透析袋透析并冷凍干燥。

將DEAE纖維素-52柱層析收集的凍干組分配置成5 mg/mL的多糖溶液，通過Sephadex G-100柱層析。調整恒流泵使洗脫液流速為0.5 mL/min，每管5 mL收集。用苯酚硫酸法于490 nm處檢測多糖含量，以管數為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制多糖純化曲線。收集主峰洗脫液，旋轉蒸發濃縮后用透析袋透析并冷凍干燥，得到精制小黃姜多糖。

1.3.1.3 小黃姜多糖含量和提取率的測定

多糖含量及提取率測定：多糖含量即多糖的質量分數(%)采用苯酚‐硫酸法測定[9]。多糖提取率(得率)的計算如公式(1)：

(1)

1.3.2 單糖的組分成分分析[10]

樣品前處理：稱取20 mg小黃姜多糖，加入15 mL 2 mol/L的三氟乙酸置于耐高溫的試管中，121 ℃油浴4 h，反應結束后用旋轉蒸發儀蒸干，加入4 mL甲醇復溶再蒸干，重復2次。樣品用2 mL去離子水充分溶解，0.22 μm濾膜過濾，HPLC檢測。

制作標樣：分別配制1 mg/mL的木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖溶液，0.22 μm濾膜過濾，HPLC檢測。

HPLC條件：Aminex HPX-87H色譜柱(Biorad)，流動相為50 mmol/L H2SO4溶液，流速0.6 mL/min，采用示差折光檢測器，柱溫80 ℃，檢測器35 ℃，進樣量10 μL。

1.3.3 紅外光譜分析

稱取1～2 mg多糖樣品和200 mg KBr充分研磨，壓制成均勻透明的圓形薄片。采用VERTEX 70v 紅外光譜儀進行測定，設置分辨率4 cm-1，掃描范圍為400～4 000 cm-1。

1.3.4 剛果紅實驗[11]

配制不同濃度(0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8 mol/L)的NaOH溶液。取2 mg/mL多糖溶液1.0 mL，加入3.0 mL上述各濃度的NaOH溶液，并加入0.5 mL蒸餾水和1.5 mL 0.2 mmol/L剛果紅溶液，充分混勻，靜置1 h后對反應液進行200～800 nm全波長掃描，記錄各NaOH濃度時反應體系的最大吸收波長，空白對照組以蒸餾水替代多糖溶液。

1.3.5 小黃姜多糖分子質量的測定

利用尺寸排阻色譜、多角度激光光散射檢測器及示差折光檢測器聯用技術測定小黃姜多糖的絕對分子質量及分子構象。將小黃姜多糖配制成質量濃度為1 mg/mL多糖樣品溶液，0.22 μm濾膜過濾。分析條件：流動相為50 mmol/L NaNO3和3 mmol/L NaN3溶液，流速0.5 mL/min，進樣量100 μL，樣品的比折光指數增量值設置為0.14[12]。數據的采集和計算使用ASTRA軟件。

1.3.6 多糖的熱穩定分析

用熱重分析法(thermogravimetric，TG)對小黃姜多糖進行熱穩定性分析。用N2作載氣，從室溫升至500 ℃，升溫速率為10 ℃/min。

1.3.7 多糖的抗氧化活性分析

1.3.7.1 羥自由基清除率的測定

參考李順峰等[13]的方法并進行了調整。取不同濃度的多糖溶液、8.9 mmol/L FeSO4和8.9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液各1 mL，混合均勻，再加入1 mL 8.7 mmol/L的H2O2溶液啟動反應，35 ℃水浴保溫35 min，在波長510 nm測吸光度。樣品對照管為蒸餾水替代樣品，樣品本底管以蒸餾水代替H2O2，按公式(2)計算多糖溶液對羥自由基清除率：

(2)

式中：Ax為樣品吸光度;A0為空白管吸光度;Ax0為樣品本底吸光度。

1.3.7.2 超氧陰離子基清除率的測定

采用鄰苯三酚自氧化法測定[14]。取50 mmol/L Tris-Hcl緩沖溶液(pH=8.2)4.5 mL，分別加1 mL不同濃度的多糖樣品溶液，加入0.2 mL 5 mmol/L 鄰苯三酚溶液于試管中混合，于325 nm處每隔30 s測量吸光度，共記錄300 s，空白對照以同體積蒸餾水代替多糖樣品。多糖對超氧陰離子自由基清除率計算如公式(3)：

(3)

式中：ΔA0為鄰苯三酚自氧化速率，ΔAx為加入多糖溶液后的鄰苯三酚氧化速率。

1.3.7.3 ABTS自由基清除率的測定[15]

ABTS+工作液：于200 mL蒸餾水中加0.385 g ABTS和0.135 g K2S2O4并混勻，于避光處靜置15 h后，用95%的乙醇將ABTS溶液稀釋至734 nm下吸光度為0.70±0.01。

取4 mL ABTS+工作液和1 mL多糖樣品溶液混合均勻，避光反應16 min，在734 nm下測吸光度；樣品本底對照為95%的乙醇替換ABTS+工作液；空白對照用95%乙醇替換樣品溶液。多糖對ABTS自由基清除率計算如公式(4)：

(4)

式中：A為多糖反應管吸光度；A0為本底對照吸光度；Ax為空白對照吸光度。

1.3.7.4 DPPH自由基清除率的測定[16]

DPPH工作液的配制：準確稱取9.86 mg DPPH固體粉末，溶于100 mL無水乙醇中，4 ℃避光保存。

取不同濃度的多糖溶液1 mL于試管中，加入1 mL DPPH工作液，混合均勻后，避光反應30 min，在517 nm波長下分別測其吸光度；空白對照為用無水乙醇代替樣品代替樣品溶液，樣品對照用無水乙醇代替DPPH溶液，小黃姜多糖對DPPH自由基清除率計算如公式(5)：

(5)

式中：A為多糖反應管吸光度；A0為本底對照吸光度；Ax為空白對照吸光度。

1.4 實驗數據處理

實驗數據重復3次取平均值，采用Excel 2010軟件進行數據處理、Origin Pro 2017軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 小黃姜粗多糖柱純化結果

小黃姜粗多糖經DEAE纖維素-52柱層析洗脫純化時有3個峰，即3個組分，如圖1-a所示。組分1和2含量較低，鑒于其含量的多少，以組分3作為主要研究對象。將得率較高的0.2 mol/L NaCl洗脫組分進一步經Sephadex G-100柱層析純化，得到均一組分(圖1-b)，經透析、冷凍干燥得到精制小黃姜多糖。

a-DEAE-52纖維素柱層析；b-Sephadex G-100柱層析
圖1 小黃姜多糖柱洗脫曲線
Fig.1 Elution profile ofZingiberofficinalepolysaccharide

2.2 小黃姜多糖的基本性質

經純化后得到的小黃姜多糖，易溶于熱水，不溶于高濃度乙醇、丙酮等有機試劑。苯酚-硫酸法測定總糖含量為(90.0±6.2)%，提取效率為(2.83±0.19)，ZHANG等[17]研究姜多糖的提取率為(2.50±4.32)%，與本研究中小黃姜多糖的提取率較為接近。如圖2所示，經Sevage法除蛋白后，紫外掃峰在260 nm和280 nm處均無吸收峰，說明多糖中基本不含有核酸和蛋白質。經酸水解、高效液相色譜分析其單糖成分，小黃姜多糖由葡萄糖、甘露糖和阿拉伯糖組成，其含量百分比分別為(81.7±2.1)%、(12.3±1.3)%和(6.0±0.2)%。

圖2 小黃姜多糖紫外掃描圖譜
Fig.2 UV spectrum ofZingiberofficinalepolysaccharide

2.3 小黃姜多糖紅外光譜分析

圖3 小黃姜多糖紅外光譜圖
Fig.3 FT-IR spectrum ofZingiberofficinalepolysaccharide

2.4 小黃姜多糖空間構象分析

剛果紅能和具有三股螺旋結構的多糖發生絡合反應，形成的絡合物的最大吸收波長會與剛果紅相比發生紅移[24]。由圖4可知，水對照組的最大吸收波長，隨NaOH濃度增大而降低。而含有多糖溶液實驗組的最大吸收波長，在稀堿濃度范圍內產生的明顯的紅移現象。說明小黃姜多糖與剛果紅形成了絡合物，具有3股螺旋結構。在堿的作用下，小黃姜多糖的3股螺旋結構開始發生構象轉變，形成單股螺旋，因此與剛果紅復合物的λmax發生了紅移[25]，并隨NaOH濃度的提高而紅移增加，在NaOH濃度為0.4 mL時趨于穩定，增加NaOH濃度，最大吸收波下降，說明隨著NaOH濃度的增加，多糖的3股螺旋結構被破壞，形成自由彎曲結構。

圖4 小黃姜多糖與剛果紅復合物在不同濃度NaOH 溶液中的λmax變化
Fig.4 Changes in the absorption maximum(λmax) ofZingiberofficinalepolysaccharide vatious concentrations of sodilum hydrolysis complexed with Congo red

2.5 小黃姜多糖分子質量測定

采用1.3.5方法，測量小黃姜多糖的重均分子質量(Mw)、均方根旋轉半徑(Rn)和多分散系數(Mw/Mn)。結果如表1所示，小黃姜多糖的重均分子質量為(3.72±0.23)×105Da，均方根旋轉半徑為(40.0±1.4) nm。多分散系數為1.50，表明多糖的分子質量分布較窄，分子結構較為均一。通過軟件ASTRA 6.1模擬均方根半徑與分子量的雙對數曲線的斜率，可以判斷水溶液中多糖分子的構象，一般v值為0.33、0.50～0.60或1.0時分別代表聚合物分子構象為球形、柔順線團狀或剛性桿狀[26-27]。計算可得，小黃姜多糖的雙對數曲線斜率為0.31，約為1/3，可知其在水溶液中均以球形構象存在，是一種高度緊密且具有分支結構的多糖聚合體。

2.6 小黃姜多糖熱穩定性分析

多糖的熱反應性質與其組成、含水量以及聚集態結構有關[28]。由TG-DTG曲線求TG-DTG可得DTG(derivative thermogtavimetric)曲線，根據導反應曲線及表2可知，小黃姜多糖熱解反應在50～140 ℃為第一階段，這一階段的質量損失主要是多糖失去了物理吸附的水分。140～220 ℃為第二反應階段，這一階段主要是發生的是多糖中的小分子揮發性熱解反應，在220～500 ℃為第三階段，這一階段的質量損失主要是多糖分子發生劇烈的熱分解，多糖降解成單糖并伴隨著C—O鍵和C—C鍵的斷裂，隨后單糖進一步分解成水蒸氣和CO2。這個過程最大熱分解溫度為307.5 ℃，最大熱解速率為0.53%/℃，最后多糖的殘留質量為33.89%。分析可知，多糖樣品雖然經過冷凍干燥，但仍有一定的水分，這表明多糖會吸附部分水分，這與雞骨草多糖的TG曲線相似[29]。相較于大粒車前子多糖和苦丁茶冬青葉多糖的最大熱分解溫度分別為281.7 ℃和290 ℃[30-31]，小黃姜多糖最大熱分解溫度為307.5 ℃，具有較好的熱穩定性。

表1 小黃姜多糖分子質量參數Table 1 The molecular weight parameters of Zingiber officinale polysaccharide

注：Mn、Mw和Mz分別指數均分子質量、重均分子質量和平均分子質量；Mw/Mn指多分散系數；Rn、Rw和Rz分別指數學均方旋轉半徑、重量均方旋轉半徑和均方旋轉半徑的均值；v為均方根半徑對分子質量的雙對數曲線的斜率

2.7 小黃姜多糖抗氧化活性分析

2.7.1 羥自由基清除率

羥自由基普遍存在在生物體內，是由機體新陳代謝產生的一類活性氧自由基，導致機體衰老與氧化損傷[32]。小黃姜多糖對羥自由基的清除率存在明顯濃度依賴性，由圖6-a可知，在0.1～5 mg/mL時小黃姜多糖對羥自由基有一定的清除作用，且清除效率隨濃度的增大而提高。當多糖質量濃度為5 mg/mL時，羥自由基清除率為(65±2)%，但低于VC的羥自由基清除率效果。李順峰等[13]對真姬菇多糖研究表明，在質量濃度為10 mg/mL時對羥自由基的清除率為62%，說明小黃姜多糖在較低濃度下即可達到與食用菌多糖同等的羥自由基清除效果。

圖5 小黃姜多糖的TG-DTG圖
Fig.5 TG/DTG curve ofZingiberofficinalepolysaccharide

表2 小黃姜多糖不同階段熱反應參數
Table 2 The thermogravimetric parameters ofZingiberofficinalepolysaccharide during different reaction stages

階段最大反應溫度/℃TG/%DTG/(%·℃-1)質量損失/%第一階段77.594.160.147.88第二階段182.561.160.136.73第三階段307.533.890.5348.68

2.7.2 超氧陰離子自由基清除率

由圖6-b可以看出小黃姜多糖對超氧陰離子自由基清除率較低，在多糖質量濃度為5 mg/mL時，自由基清除率僅為(37±3)%，而許女等研究雞腿菇多糖在質量濃度為8 mg/mL時對超氧陰離子自由基的清除率只有21%[33]。研究表明超氧陰離子自由基清除能力與其羥基數量有關，由于多糖的立體空間構型，使羥基被束縛在內部，不能與外周的超氧陰離子自由基反應，導致自由基清除率較低[34]。

2.7.3 ABTS自由基清除率

如圖6-c所示，小黃姜多糖對ABTS自由基的清除率較強，當多糖質量濃度為1 mg/mL時，ABTS自由基清除率達到(96±4)%，與VC的效果相當。經線性擬合計算多糖半抑制濃度IC50為0.30 mg/mL，優于牛肝菌多糖的抗氧化效果[35]。

2.7.4 DPPH自由基清除率

小黃姜對DPPH自由基清除能力如圖6-d所示，可以看出小黃姜多糖對 DPPH自由基的清除能力隨樣品濃度的提高而明顯提高，當多糖質量濃度為2 mg/mL時，自由基清除率達(83±3)%，繼續增加多糖濃度，則自由基清除能力趨于平緩，經計算其IC50為0.57 mg/mL，ZHANG等[17]的研究表明生姜多糖對DPPH自由基的IC50為0.34～0.87 mg/mL，與本研究結果一致。

a-羥自由基清除率;b-超氧陰離子自由基清除率;c-ABTS自由基清除率;d-DPPH自由基清除率
圖6 小黃姜多糖抗氧化活性
Fig.6 Antioxidation activity ofZingiberofficinalepolysaccharide

通過對比小黃姜多糖對4種自由基清除能力可知，小黃姜多糖具有一定的體外抗氧化活性，其中對ABTS自由基和DPPH自由基的清除能力較強。可能受其空間構型的影響，超氧陰離子自由基清除能力較弱，研究發現含有β-構型比α-構型的多糖抗氧化能力更強，具有抗氧化活性的多糖大多數都具有β-(1→3)-D-葡聚糖的主鏈結構[24,27]，本研究中小黃姜多糖為β-吡喃糖構型，且具有3股螺旋結構，具有較高的體外抗氧化活性。

3 結論

本研究以小黃姜為原料，采用復合酶解結合水提醇沉法提取多糖組分，小黃姜多糖中總糖含量為(90.0±6.2)%，主要由葡萄糖、甘露糖和阿拉伯糖組成，含量百分比分別為(81.7±2.1)%、(12.3±1.3)%和(6.0±0.2)%。結構分析表明小黃姜多糖為β-吡喃型多糖，具有三股螺旋結構；多糖的重均分子質量為(3.72±0.23)×105Da，水溶液中多糖分子的構象為高度緊密的球形聚合體；小黃姜多糖具有較高的熱穩定性，最大熱分解溫度為307.5 ℃，最大熱解速率為0.53%/℃；體外抗氧化活性表明小黃姜多糖對ABTS和DPPH自由基具有較強的清除能力，最大清除率分別為(96±4)%和(83±3)%，IC50分別為0.30 mg/mL和 0.57 mg/mL，具有較高的體外抗氧化活力。本研究為小黃姜多糖資源的深度開發利用提供了理論基礎。