16S與gyrB基因聯合建樹快速鑒定一株解淀粉芽胞桿菌

傅奇，林俊杰，馮亞棟，肖玉娟

(廈門華廈學院，福建 廈門，361024)

解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)是芽孢桿菌屬的一種具有重要研究價值的菌種，在發酵工業中可用于生產淀粉酶[1]、蛋白酶[2-3]、纖維素酶[4]等多種工業用酶，此外還可以表達幾丁質酶[5]、伊枯草菌素[6-7]等具有重要研究價值的生物活性物質。但由于芽胞桿菌屬中各菌種間保守序列高度相似，無法單獨依靠常用的16S rDNA/RNA測序來準確定位到種, 通常需要結合生理生化鑒定[8-9]，或者其他序列，如5′端16S-23S ITS核苷酸序列[10]、gyrB基因[11]、gyrA[12]甚至全基因序列[13-14]進行分析。CHEN等[15]、XU等[16]在篩選解淀粉芽胞桿菌時，使用16S與gyrA基因分別建樹的方法進行鑒定；LIM等[17]采用16S序列比對結合API系統鑒定1株產廣譜細菌素的解淀粉芽胞桿菌；NEL等[18]采用16S rDNA擴增片段限制性內切酶分析與rpoB基因建樹結合的方法，區分并鑒定南非制糖廠中篩選得到的解淀粉芽胞桿菌與枯草芽胞桿菌。鑒定方法較為繁瑣，目前還沒有通用、簡便、快速的鑒定方法。

gyrB基因編碼DNA促旋酶的B亞單位，在細菌中廣泛存在，序列相對保守，但進化速度快于16S，目前在細菌鑒定中的使用逐漸增加[19]，積累了較為豐富的比對信息，但單獨使用時部分芽胞桿菌也難以準確定位，而16S與gyrB序列分別比對建樹的方法容易出現進化樹結構沖突，干擾定位的情況。利用16S與gyrB基因聯合建樹，以較少的序列數和進化樹數實現對篩選菌株快速鑒定的方法，可提高數據的利用率，減少數據沖突，為芽胞桿菌種群的分子生物學鑒定方法開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 土壤樣本

土壤樣本，采集自廈門同安國家農業科技園區竹壩農場。

1.1.2 培養基與試劑

營養瓊脂培養基，廣東環凱生物科技有限公司；苯丙氨酸脫氨酶鑒定管、MR-VP鑒定管、SIM培養基(用于硫化氫和吲哚試驗)等，青島海博生物科技有限公司。

細菌基因組DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、聚合鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)試劑，生工生物工程(上海)股份有限公司生產；16S通用引物27F/1492R、gyrB擴增引物UP-1/UP-2r、gyrB測序引物UP-1S/UP-2Sr[20],生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.1.3 儀器與設備

Aeris-bg096PCR儀，新加坡ESCO公司；HE99核酸電泳儀，美國GE公司；211B搖床，上海蘇坤公司；LRH-250生化培養箱，上海一恒公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣本采集

于農場蔬菜種植區取土壤25 g加入225 mL蛋白胨生理鹽水稀釋均質后稀釋涂布營養瓊脂平板，30 ℃培養24 h，取單菌落進行純化。

1.2.2 16S與gyrB序列提取

用細菌基因組DNA抽提試劑盒，提取菌株的總DNA；分別用16S與gyrB引物擴增，所得PCR產物電泳純化后，送由生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

16S擴增條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，65 ℃退火40 s，72 ℃延伸90 s，共35個循環；72 ℃延伸10 min。

gyrB擴增條件[20]：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共35個循環；72 ℃延伸10 min。

1.2.3 16S與gyrB序列比對與進化分析

將測序結果在Genbank進行比對。為保障數據的準確性，取與受試菌gyrB序列相似度較高的前1 000個序列中，來源于各菌種保藏中心菌株的序列進行比對，包括ATCC、BCRC、CGMCC、CIP、CECT等。下載相似菌株的16S與gyrB序列、分別用BioEdit[21]和Clustal X[22]進行比對和編輯，取有效區間，分別試驗單獨使用16S序列、單獨使用gyrB序列和使用16S與gyrB線形拼接序列建樹[23]，采用最大簡約算法，用Paup*4.0構建進化樹[24-25]，選擇大腸桿菌ATCC 25922[26]作為外群。

1.2.4 生理生化驗證

參考《伯杰細菌鑒定手冊》[27]進行驗證。

1.2.5 聯合建樹方法適用性分析

為分析16S與gyrB基因聯合建樹的方法是否適用于其他解淀粉芽胞桿菌的鑒定，于Genbank下載16S與gyrB基因均可得的解淀粉芽胞桿菌序列，按照上述方法進行序列拼接。選擇《伯杰細菌鑒定手冊》[27]中芽胞桿菌屬模式菌株，于Genbak和EZBiocloud下載16S和gyrB序列，選擇大腸桿菌ATCC 25922作為外群，構建進化樹。

2 結果與分析

2.1 菌株分離純化

從土壤中篩選得到1株革蘭氏陽性桿菌，產芽胞，菌落白色、干燥、表面粗糙，編號為HX2016004。

2.2 16S與gyrB基因測序

PCR擴增所得16S序列有效區共1 436 bp，gyrB序列有效區共1 207 bp。

2.3 序列比對與進化樹構建

16S序列比對結果中，高相似度菌株過多，且多數菌株無法獲得更多的遺傳標記序列；而gyrB序列比對結果中，多數菌株同時可獲取16S序列，因此，以gyrB相似菌株作為建樹群，下載16S與gyrB基因序列，如表1所示，比較分別使用16S、gyrB和16S與gyrB線形拼接序列建樹結果。

16S比對后去除頭尾不整齊片段，保留中心區域1 467 bp(含gap)；gyrB比對后去除頭尾不整齊片段，保留中心區域1 175 bp(含gap)。構建進化樹如圖1所示，A樹基于16S序列構建(圖1-a)，b樹基于gyrB序列構建(圖1-b)，c樹基于16S與gyrB拼接序列構建(圖1-c)，計算次數為1 000，參數如表2所示。

注：*表示Bacillus_velezensis為Bacillusamyloliquefaciens的異名[28-29]

表2 基于16S與gyrB序列的進化樹參數表Table 2 Parameters of phylogenetic trees based on the combined sequences of 16S and gyrB

由圖1可知，僅使用16S序列構建的進化樹a分枝自展值低，無法準確定位HX2016004菌株的族群；僅使用gyrB序列構建的進化樹b較a整體分枝自展值高，但一致性指數(consistency index，CI)相對較低，且與a樹存在較大的結構沖突；使用16S與gyrB拼接序列構建的進化樹c結構與b一致，表明建樹群中16S的差異較小，不足以影響分類結構，HX2016004菌株與解淀粉桿菌聚合在一枝，自展值為94，表明該菌株為解淀粉芽胞桿菌可能性高。c樹中BacillussubtilisATCC 13952的進化關系存在疑問，有待進一步分析，但不影響HX2016004菌株的鑒定。

a-基于16S的進化樹；b-gyrB基因的進化樹； c-基于16S與gyrB基因的進化樹
圖1 HX2016004菌株基于16S與gyrB序列的進化樹
Fig.1 Phylogenetic trees about HX2016004 based on sequences of 16S andgyrB

2.4 生理生化驗證

菌株HX2016004生理生化特征如表3所示，與《伯杰細菌鑒定手冊》中的解淀粉芽胞桿菌特征吻合，與進化分析結果一致，命名為BacillusamyloliquefaciensHX2016004。

表3 菌株HX2016004生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of HX2016004

注：+代表革蘭氏染色呈陽性；-代表革蘭氏染色呈陰性

2.5 聯合建樹方法適用性

Genbank中16S與gyrB序列同時可得，且鑒定結果較為可靠的解淀粉芽胞桿菌菌株共有37株，另選擇親緣關系較近的芽胞桿菌屬其他菌種模式菌株16株，拼接16S與gyrB基因序列后構建進化樹如圖2所示。其中所有的解淀粉芽胞桿菌很好的聚合在一簇，與親緣關系相近菌種Bacillussubtilis、Bacilluslicheniformis、Bacilluspumilus具有較高的種間自展值，分類結構可靠。也就是說，如這37株菌中的任意1株菌種還未鑒定的情況下，利用該方法建樹時均與其他36株解淀粉芽胞桿菌聚合在1枝，可準確鑒定為解淀粉芽胞桿菌。表明16S與gyrB基因聯合建樹的方法適用于已知的37株解淀粉芽胞桿菌鑒定，可以預測該方法在解淀粉芽胞桿菌鑒定中具有普適性。

圖2 Genbank已知菌株基于16S與gyrB序列的進化樹
Fig.2 Phylogenetic tree based on sequences of 16S andgyrBin Genbank

3 結論

利用16S與gyrB基因聯合建樹的方法，課題組快速將1株從土壤中篩選得到的芽胞桿菌HX2016004準確鑒定為解淀粉芽胞桿菌。該方法中使用的引物均為通用引物，只需要1次擴增即可得到16S與gyrB基因序列，測序量小，時間短，數據利用率高；與多基因分別建樹的方法相比，可避免進化樹結構之間的沖突和數據紊亂，提高了進化樹準確性，適用于16S序列高度相似的菌群鑒定。經驗證，該方法在解淀粉芽胞桿菌的鑒定中具有較普遍的適用性，課題組下一步將繼續研究該方法在其他菌群鑒別中的有效性。