西式熏煮火腿加工過程中肌漿蛋白的構象變化

胡可，常瑞，朱秋勁，湯鵬宇，劉春麗，宋麗，鄧力， 胡萍，何臘平，曾雪峰，葉春

1(貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽，550025)2(貴州大學貴州省農畜產品貯藏與加工重點實驗室，貴州 貴陽，550025)

西式熏煮火腿是西式低溫肉制品的一種，其營養價值高，風味卓越，肉質鮮口感好，深受大眾喜愛[1]。目前，國內外學者對西式熏煮火腿的研究主要集中在原輔料品質特性、加工工藝改善及品質提升研究、西式熏煮火腿加熱和煙熏等過程的質量安全控制三個方面[2-4]。西式熏煮火腿區別于其他西式火腿在于其獨特的煙熏風味，目前常使用傳統發煙方式煙熏火腿，但煙熏過程中常產生苯并芘和多環芳烴等有害物質[5]。為避免有害物質的產生，綠色煙熏液研制并上市，液熏法賦予西式火腿煙熏風味應運而生，然而其煙熏風味卻不如傳統煙熏方式煙熏風味好[6]。研究表明，風味成分與食品基質中的蛋白質、碳水化合物和脂質相互作用，從而影響對某些風味的感知[7]。其中，蛋白質由于氨基酸側鏈結構的顯著變化，具有以多種方式與風味化合物相互作用的潛力[8]，這些相互作用包括離子鍵，氫鍵和疏水鍵等。上述類型的相互作用本質上屬于都是非共價相互作用，故具有可逆性[9]。肌漿蛋白占豬肉蛋白的30%～35%[10]，屬于水溶性蛋白，在維持肉質方面起著重要作用。因此，為了優化西式熏煮火腿的煙熏風味，有必要探究西式熏煮火腿不同加工環節對火腿肌漿蛋白結構的影響，以及西式熏煮火腿中肌漿蛋白結構變化與風味之間的關系。

本研究以西式熏煮火腿不同加工階段的肌漿蛋白為對象，運用傅里葉變換紅外、紫外、內源熒光等光譜技術手段，測定不同加工環節肌漿蛋白巰基總量、表面疏水性及蛋白質結構變化，旨在解釋西式熏煮火腿不同加工環節中肌漿蛋白結構變化，對提升西式熏煮火腿產品品質、優化西式火腿加工工藝具有指導意義為煙熏液在西式火腿加工中的使用及風味的提升提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

西式火腿制作材料：新鮮豬后腿精瘦肉；食鹽、白砂糖、味精、黑胡椒粉、淀粉等調味料，購于合力超市；乳酸鉀，北京清源食品添加劑有限公司；亞硝酸鹽，杭州龍山化工有限公司；三聚磷酸鈉、焦磷酸鈉、D-異抗壞血酸鈉，河南萬邦實業有限公司；黃原膠、卡拉膠，內蒙古阜豐生物科技有限公司；大豆分離蛋白，萬利達生物科技有限公司；硬木煙熏香味料SmokeZ C-10-12、C-10-06，美國紅箭公司。以上材料均為食品級。

試劑：尿素，天津市福晨化學試劑廠；Tris，美國Genview公司；K2HPO4、NaH2PO4、KCl，成成金山化學試劑有限公司；2-硝基苯甲酸(DTNB)，上海麥克林生物化學公司；8-苯胺基-1-萘磺酸(ANS)，梯希愛(上海)化成工業發展有限公司；β-巰基乙醇，廣東翁江化學試劑有限公司；KBr，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

電子分析天平(CP214)，奧豪斯儀器有限公司；梅特勒-托利多的便攜式pH計(Seven2GoTM)，瑞士；高速分散均質機(XHF-DY)，寧波新芝生物科技股份有限公司；全波長酶標儀(SpectraMAX190)，美國Molecular Devices公司；超聲清洗器(SB25-12DT)，上海冠特超聲儀器有限公司；斬拌機(ZBJ-40)、 灌腸機(GCJ-50)，諸城市華剛機械有限公司；真空滾揉機(GR-60)，諸城市新得利食品機械有限公司；傅里葉變換紅外光譜儀VERTEX70，日本島津公司；紫外-可見分光光度計(UV2600)日本，Shimadzu公司；熒光分光光度計(Cary eclipse)，美國Aglient公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品的制備

西式熏煮火腿加工方法：

(1)修整切塊：將后腿精瘦肉切成小肉塊，肉塊規格為1 cm×2 cm×3 cm。

(2)腌制：按照腌制配方制作好腌液，倒入切好的肉中，充分混合均勻，放在0～4 ℃環境腌制24～48 h。腌制配方(以實際腌制肉質量計)：食鹽 2.5%，亞硝酸鈉0.015%，異抗壞血酸鈉0.06%，多聚磷酸鈉0.1%，焦磷酸鈉0.2%，白砂糖0.8%，蒸餾水5%左右。

(3)真空滾揉：在0～8 ℃下滾揉4 h，每滾揉20 min間歇10 min，在滾揉快結束時按加工配方加入配料，再繼續滾揉10 min，以保證其分布均勻。加工配方(以實際加工肉質量計)：胡椒粉0.5%、味精0.5%、大豆蛋白2.2%、淀粉6.5%、卡拉膠0.3%、黃原膠0.3%、紅曲紅0.01%、硬木煙熏香味料Smoke ZC-10-12型0.2%、Smoke ZC-10-06型 0.5%、乳酸鏈球菌素0.1%。

(4)斬拌：取滾揉后的20%的肉料，經斬拌機斬至肉糜后與肉塊混勻。

(5)灌腸：將塑料腸衣剪開，一端打卡后排氣，操作灌腸機灌餡，每間隔約20 cm打1次卡。

(6)蒸煮：預先在蒸煮鍋內加入清潔水，預熱到85 ℃放入火腿，將水溫恒定在80 ℃蒸煮2 h。

(7)冷卻：采用流水冷卻，冷卻后于0～5 ℃冷庫保藏。

依據上述實驗室探索的西式熏煮火腿加工過程生產西式熏煮火腿，分別在原料肉、腌制、真空滾揉、斬拌和蒸煮環節進行取樣。

1.3.2 肌漿蛋白的提取

參照XIA等[11]的方法。準確稱量10 g肉樣于100 mL燒杯中，加入40 mL 0.03 mol/L緩沖液(含0.04 mol/L NaCl，pH=6.5)。在冰浴條件下以8 000 r/min勻漿3 min后12 000 r/min，4 ℃冷凍離心20 min取上清液，保存于4 ℃下并盡快使用。

以牛血清白蛋白作為標準，采用二辛可寧酸法測定蛋白質濃度。

1.3.3 肌漿蛋白巰基含量的測定

巰基總量的測定方法參考XU等[12]的方法。使用20 mmol/L K2HPO4/KH2PO4磷酸鹽緩沖液(含 0.6 mol/L KCl，pH=7.0)將肌漿蛋白稀釋到濃度為4 mg/mL。以未加入肌漿蛋白的緩沖液混合體系為空白。巰基總量的計算如公式(1)所示：

(1)

式中：A為減去試劑空白后412 nm處肌漿蛋白吸光值；D為肌漿蛋白稀釋倍數；C為肌漿蛋白質量濃度，mg/mL。

1.3.4 肌漿蛋白質表面疏水性的測定

參考BOYER等的方法[13]。以原料肉中肌漿蛋白為對照，疏水強度以不同加工環節肌漿蛋白與原料肉組肌漿蛋白熒光強度的比例(相對熒光強度)計，計算公式如公式(2)所示：

(2)

1.3.5 肌漿蛋白化學作用力的測定

離子鍵含量=CSB-CSA

(3)

氫鍵含量=CSC-CSB

(4)

疏水相互作用=CSD-CSC

(5)

二硫鍵含量=CSE-CSD

(6)

式中：CSA、CSB、CSC、CSD、CSE、分別為溶解于SA、SB、SC、SD、SE的蛋白質含量，各化學作用力相對含量以該化學作用力含量與所有化學作用力含量之和的比計算。

1.3.6 肌漿蛋白傅里葉變換紅外光譜分析

參考藍蔚青等[15]的方法。

1.3.7 肌漿蛋白內源熒光光譜分析

參考李慶舒等[16]的方法。

1.3.8 肌漿蛋白紫外吸收光譜分析

參考康懷彬等[17]的方法。

1.4 數據處理

實驗設置3次平行，結果用X±SD表示，數據采用IBM SPSS Statistics 23軟件進行分析，采用ANOVA進行LSD差異分析，P<0.05表示差異顯著。Origin 2016軟件用于制圖。

2 結果與分析

2.1 西式熏煮火腿不同加工環節蛋白質巰基總量變化

已有研究表明，蛋白展開的過程中原來掩埋于蛋白內部的作用位點、疏水基團和巰基基團就會暴露于蛋白表面與風味化合物發生共價結合[18]，將蛋白溶液由水溶性環境轉換成疏水性環境并形成二硫鍵，且蛋白分子的疏水區域和巰基基團具有吸附性，從而增強蛋白的風味吸附能力[19]。蛋白質巰基分為表面活性巰基和包埋于蛋白質分子內部的巰基，巰基總量即蛋白質分子的所有巰基。實驗西式熏煮火腿不同加工環節肌漿蛋白巰基總量的變化結果如圖1所示。

圖1 西式熏煮火腿不同加工環節肌漿蛋白巰基總量的變化
Fig.1 Changes of different processing operations of western-style smoked ham on total sulfhydryl content of sarcoplasmic protein

由圖1可知，肌漿蛋白巰基總量在西式熏煮火腿加工過程中呈先逐漸降低再急速上升的趨勢，斬拌環節肌漿蛋白巰基總量最低，這可能是因為快速斬拌的剪切力導致蛋白內部或蛋白質間有外在因素和環境變化。蒸煮環節肌漿蛋白巰基總量最高(P<0.01)(圖1)，在蒸煮過程中，溫度升高使掩埋在蛋白質內部的巰基基團逐漸暴露，巰基總量升高。KO等[20]等指出熱環境導致蛋白結構改變，蛋白質分子鏈展開，暴露更多的疏水性風味結合位點，這一點與實驗結果一致。

2.2 不同加工環節肌漿蛋白表面疏水性變化

表面疏水性的變化已成功用于反映經加壓和超聲修飾等處理后蛋白質三級和四級結構變化[18,21]。以ANS作為熒光探針，測定西式熏煮火腿不同加工環節肌漿蛋白表面疏水性，結果如圖2所示。

圖2 西式熏煮火腿不同加工環節肌漿蛋白表面疏水強度 的變化
Fig.2 Changes of different processing operations of western-style smoked ham on surface hydrophobicity of sarcoplasmic protein

由圖2可知，在西式熏煮火腿加工過程中，肌漿蛋白相對熒光強度先輕微降低再升高(P<0.05)，真空滾揉環節達到最大值后逐漸降低(P<0.01)，這可能與真空環境下，受到物理作用力后蛋白質暴露更多疏水基有關。熒光強度所表征的表面疏水性殘基含量在加工過程中先輕微下降后增加，后逐漸降低。CHELH[22]的研究表明隨著加熱溫度的上升和加熱時間的延長(最高溫度70 ℃，加熱時間30 min)，肌原纖維蛋白的表面疏水性不斷升高。雖然蒸煮后肌肉肌漿蛋白巰基總量最高，但在西式火腿的蒸煮環節，蒸煮溫度為80 ℃時間2 h，蛋白質在長時間蒸煮過程中發生變性且結構趨于穩定，故蛋白質表面疏水性反而降低。

2.3 不同加工環節蛋白質化學作用力變化

肌漿蛋白化學作用力變化及顯著性差異分析如表1所示。與原料肉相比，腌制、真空滾揉、斬拌和蒸煮過程中離子鍵相對含量顯著下降(P<0.05)。氫鍵相對含量除在蒸煮環節劇烈減少(P<0.05)外，在不同加工環節差異不明顯，蒸煮過程是一個加熱過程，加熱導致了氫鍵大量斷裂[22]。疏水相互作用相對含量在西式熏煮火腿加工過程中呈現上升的趨勢(P<0.05)，并在蒸煮環節達到最大值。與原料肉相比，二硫鍵相對含量在蒸煮環節最高(P<0.05)，蛋白質之間產生了交聯作用并促進了二硫鍵的形成[23]，表明蒸煮后火腿蛋白質網絡結構致密，凝膠強度增強。

表1 西式熏煮火腿不同加工環節化學作用力的變化Table 1 Changes of different processing operations of western-style smoked ham on chemical force of sarcoplasmic protein

注：同一列中不同小寫字母表示不同加工環節化學作用力具有顯著性差異(P<0.05)

2.4 西式熏煮火腿不同加工環節蛋白質傅里葉變換紅外光譜分析

蛋白質的結構從平面到空間有一級結構的氨基酸按序排列、二級結構的α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規則卷曲、三級結構在二級結構上的折疊，和四級結構的蛋白質分子空間排列[24]。蛋白質結構的相關研究主要分有兩類：一類是蛋白質晶體結構的解析，主要技術有X射線晶體衍射，核磁共振技術和電鏡技術[15]；一類是溶液中蛋白質分子構象的研究，主要方法有熒光光譜法、傅里葉變換紅外光譜法、圓二色譜法和拉曼光譜法等[25]。通過傅里葉變換紅外光譜對西式熏煮火腿不同加工環節肌漿蛋白分子構象進行分析，結果如圖3所示。

圖3 西式熏煮火腿不同加工環節蛋白質傅里葉變換 紅外光譜圖
Fig.3 Fourier transform infrared spectra of sarcoplasmic protein at different processing operations of western-style smoked ham

2.5 西式熏煮火腿不同加工環節蛋白質內源熒光光譜分析

蛋白質變性會導致其構象發生變化，從而改變芳香族氨基酸殘基的位置和微環境，芳香族氨基酸殘基可吸收紫外線入射光以發出熒光，因此內源性熒光光譜可用于研究蛋白質構象[31]。

西式熏煮火腿不同加工環節肌漿蛋白熒光發射光譜如圖4所示。由圖4可知原料肉肌漿蛋白的熒光峰位置在338 nm，腌制和蒸煮后肌漿蛋白的熒光峰位置相對于原料肉發生紅移，熒光峰位置分別為349 nm和352.96 nm，且蒸煮后熒光強度降低(P<0.05)，這與LEFEVRE等的研究結果大西洋鮭肌原纖維蛋白分子隨著加熱溫度的升高，內源熒光強度逐漸降低的結果一致[32]。真空滾揉和斬拌后肌漿蛋白的熒光峰位置相對于原料肉發生藍移，熒光峰位置分別為327.96 nm和329.06 nm。熒光峰位置藍移表明熒光發射基團處于更加疏水的環境中，蛋白分子的微環境發生了變化，也能反映出肌漿蛋白表面疏水性的增大[21]。這與肌漿蛋白表面疏水性結果一致。

圖4 西式熏煮火腿不同加工環節蛋白質內源熒光光譜
Fig.4 Intrinsic fluorescence spectra of sarcoplasmic protein at different processing operations of western-style smoked ham

2.6 西式熏煮火腿不同加工環節蛋白質紫外吸收光譜分析

蛋白中的色氨酸 (Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)殘基的芳香結構對紫外光有吸收作用使得蛋白能夠吸收紫外光[33]。280 nm左右處的峰為蛋白中Trp、Tyr以及Phe殘基中共軛雙鍵的吸收峰，代表的是蛋白中氨基酸殘基微環境的變化，因此紫外線吸收光譜法可用于研究蛋白質三級結構的變化[34]。西式熏煮火腿不同加工環節蛋白質紫外吸收光譜如圖5所示。

圖5 西式熏煮火腿不同加工環節蛋白質紫外吸收光譜
Fig.5 Ultraviolet-visible spectra of sarcoplasmic protein at different processing of western-style smoked ham

由圖5可知，原料肉中肌漿蛋白紫外最大吸收峰波長(λmax)在284 nm處產生了特征吸收峰，與原料肉相比不同加工環節均發生了不同程度的紅移，腌制、真空滾揉、斬拌和蒸煮環節肌漿蛋白λmax分別紅移至293、299、294和297 nm，說明在西式熏煮火腿加工過程中，蛋白質結構發生了變化或者受到溶劑效應的影響，從而使λmax向長波方向移動。與真空滾揉環節相比，斬拌環節λmax發生輕微藍移，說明斬拌后使得色氨酸和酪氨酸殘基暴露于蛋白質表面，其所處微環境由非極性偏向極性[35]，這一結果與巰基總量、表面疏水性的結果相符合。

3 結論

在西式熏煮火腿加工過程中，肌漿蛋白巰基總量呈先逐漸降低再急速上升的趨勢，分別在斬拌環節最低、蒸煮環節最高，肌漿蛋白表面疏水強度則呈先輕微降低后升高再逐漸降低，分別在真空滾揉環節最高、蒸煮環節最低，表明真空環境下，受到物理作用力后蛋白質暴露更多疏水基。離子鍵與氫鍵在西式熏煮火腿不同加工環節發生不同程度的斷裂，疏水相互作用則表現出上升趨勢，二硫鍵的形成與巰基含量相關，在蒸煮環節二硫鍵相對含量最高。肌漿蛋白酰胺A帶、酰胺Ⅱ帶和酰胺Ⅲ帶均發生了移動，且不同加工環節肌漿蛋白氨基酸殘基吸光度不同，說明蛋白質的二級結構也發生改變。紫外吸收光譜和內源熒光光譜結果表明，不同加工環節對肌漿蛋白的三級結構產生了影響，在蒸煮環節尤為明顯，更多蛋白質殘基暴露于蛋白質表面。

肌漿蛋白在西式熏煮火腿加工中扮演了重要的角色，蛋白質化學作用力與結構變化表明肌漿蛋白有更多與風味物質結合的可能，在西式熏煮火腿實際加工過程中，可以將煙熏液的使用與產品感官品質結合，本研究條件下在真空滾揉環節加入煙熏液為宜。