減壓結(jié)合1-甲基環(huán)丙烯處理通過調(diào)控中華壽桃能量代謝控制其采后冷害

曹繼璇，張穎，婁湘琴，車炎，劉暢，彭勇，石晶盈*

1(山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東省高校食品加工技術(shù)與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 泰安，271018) 2(山東省淄博市淄川區(qū)檢驗(yàn)檢測中心，山東 淄博，255100)

中華壽桃(PrunuspersicaL. cv. Zhonghuashoutao)是我國培育出的晚熟優(yōu)質(zhì)的桃品種，成熟后的顏色為鮮紅色，著色面積達(dá)到80%以上，口感較脆，糖分較高，深受消費(fèi)者的喜愛。但是在采后冷藏時(shí)，容易產(chǎn)生冷害，一般冷害癥狀在低溫下不顯現(xiàn)，當(dāng)轉(zhuǎn)移到常溫下，會(huì)很快表現(xiàn)出果肉褐變、棉化等現(xiàn)象[1]，使其失去新鮮水果的風(fēng)味，貨架期變短，喪失商品價(jià)值[2]。因此，在低溫貯藏過程中，防止冷害發(fā)生，提高果實(shí)貯藏期和貨架品質(zhì)已經(jīng)成為中華壽桃貯藏保鮮技術(shù)中亟需解決的問題。

減壓是一種物理貯藏技術(shù)，通過降低貯藏環(huán)境中的氣體壓力，給果實(shí)創(chuàng)造一個(gè)低氧環(huán)境，并補(bǔ)充果實(shí)所需要的水分。同時(shí)在減壓過程中能夠抑制微生物的生長，殺滅果實(shí)中的昆蟲和細(xì)菌，還可通過減少不利于果實(shí)貯藏的生理病害發(fā)生率來提高貯藏期及貨架期果實(shí)的品質(zhì)[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，減壓處理可以提高楊梅和水蜜桃等果實(shí)的貯藏品質(zhì)[4-5]，減輕冬棗的冷害[6]。1-甲基環(huán)丙烯(1-methylcyclopropene, 1-MCP)是一種乙烯抑制劑，能夠抑制乙烯的感受和信號(hào)傳導(dǎo)，在許多果實(shí)中，都有很好的保鮮效果[7]。近年來，1-MCP在控制西葫蘆、桃子等果蔬冷害方面的研究被陸續(xù)報(bào)道[8-9]。除此之外，熱處理[10]、采后預(yù)冷處理[11]、氣調(diào)貯藏[12]、一氧化氮[13]等在中華壽桃的貯藏保鮮中也有相關(guān)研究。但是單一的采后處理往往較難達(dá)到理想的效果，嚴(yán)重制約了中華壽桃在市場上的供應(yīng)期，不同技術(shù)的結(jié)合處理或許能有效的解決這一問題。

研究發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定的能荷水平有助于保持果蔬貯藏和貨架期間良好的品質(zhì)[14]。果蔬采后運(yùn)輸和貯藏期間的機(jī)械碰撞、微生物侵染等，均會(huì)導(dǎo)致果蔬的能量消耗增加，對病原菌和一些物理傷害的抵抗力下降，從而加速果實(shí)冷害和病害的發(fā)生，降低貯藏品質(zhì)，縮短了貯藏時(shí)間[15-16]。

本研究從能量代謝角度探討了減壓處理、1-MCP處理以及減壓結(jié)合1-MCP處理對中華壽桃貯藏品質(zhì)的影響，為提高桃果實(shí)貯藏保鮮效果，減少其采后損失提供實(shí)踐基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 中華壽桃

試驗(yàn)所用八成熟中華壽桃采摘于山東省淄博市沂源縣。果實(shí)大小、形狀、成熟度一致，無病蟲害和機(jī)械傷。在20 ℃下預(yù)冷24 h后低溫貯藏，貯藏溫度為0 ℃，相對濕度為90%～95%。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理

樣品隨機(jī)分為4組，進(jìn)行如下處理：1-MCP(1 mg/m3)處理，放入1-MCP緩釋包(山東營養(yǎng)源有限公司提供)密封，放到0 ℃，相對濕度90%～95%的貯藏環(huán)境中貯藏；減壓(0.05～0.06 MPa)處理，溫度0 ℃，相對濕度90%～95%，減壓12 h后，放氣后將桃子放入密封袋中，放在0 ℃，相對濕度90%～95%貯藏；減壓與1-MCP結(jié)合處理，減壓處理12 h后，放入1-MCP緩釋包密封，放在0 ℃，相對濕度90%～95%貯藏；對照組，不做處理，直接放到相同貯藏環(huán)境中貯藏。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50個(gè)桃子。在貯藏期分別為0、30、60和90 d時(shí)，以上4種處理中每個(gè)重復(fù)分別取出10個(gè)桃子放入貨架溫度環(huán)境(20 ℃)，并進(jìn)行取樣，測定能量代謝相關(guān)指標(biāo)；貨架期放置在20 ℃的環(huán)境下，分別放置3 d和6 d。

1.2.2 感官質(zhì)量評價(jià)及褐變程度的測定

參照陸振中等[17]感官評定方法，參照表1所示的評定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評定，每個(gè)重復(fù)取6個(gè)果實(shí)，褐變程度觀察整個(gè)果實(shí)以及切開果實(shí)進(jìn)行評定，由10名經(jīng)過訓(xùn)練的專業(yè)人員打分(每次指定的人員統(tǒng)一)，取平均值。分值低于2，則認(rèn)為失去商品價(jià)值。

表1 感官評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Standard of subjective evaluations

1.2.3 能量水平的測定

稱取5 g桃果肉，研磨后加入6 mL 0.6 mol/L高氯酸溶液冰浴提取。4 ℃ 13 000 r/min 離心20 min，取3 mL上清液，用1 mol/L的KOH將pH調(diào)節(jié)至6.5～6.8。冰浴30 min后過濾，濾液用超純水定容到4 mL，用高效液相色譜儀進(jìn)行測定分析。

腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP)、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate, ADP)、一磷酸腺苷(adenosine monophosphate, AMP)含量及能荷水平的測定參照LIU等[18]方法并略有修改。色譜條件為反向C18柱(250 mm× 4.6 mm)，檢測波長為245 nm，流速0.6 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。流動(dòng)相A為0.05 mol/L，pH 7.0的磷酸鉀緩沖液，流動(dòng)相B為純甲醇。都用0.22 μm的纖維濾膜過濾，并用超聲波除氣泡備用。采用線性梯度洗脫，時(shí)間為8 min，延遲2 min，流動(dòng)相B在第 0、7、10 min時(shí)所占比例為0%、20%和0%。根據(jù)ATP、ADP、AMP標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間對樣品峰定性分析。根據(jù)制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣品峰進(jìn)行定量分析，結(jié)果以nmol/gFW表示。根據(jù)ATP、ADP和AMP的含量，按照公式(1)計(jì)算能荷(enery charge，EC):

(1)

1.2.4 琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase, SDH)活性的測定

參照LIANG等[19]方法進(jìn)行，稱取5 g桃果肉，加入20 mL 50 mmol/L預(yù)冷的Tris-HCl(pH 7.5)提取緩沖液(含0.25 mol/L蔗糖、1 mmol/L乙二胺四乙酸、0.3 mol/L甘露醇、0.5%聚乙烯吡咯烷酮)研磨至勻漿，過濾后在4 ℃下4 000 r/min離心10 min，取出得到的上清液，4 ℃下13 000 r/min繼續(xù)離心20 min。向得到的沉淀中加入10 mL 10 mmol/L的Tris-HCl (pH 7.2)洗滌液，重復(fù)上面的離心操作，向最終的沉淀加入1.5 mL的懸浮液，得到線粒體粗酶液。(洗滌緩沖液和懸浮液中含0.25 mol/L蔗糖、1 mmol/L乙二胺四乙酸、0.3 mol/L甘露醇)。

參照ACKRELL[20]等的方法略有改動(dòng)，取5.4 mL的磷酸鉀緩沖液(0.2 mol/L，pH 7.4，內(nèi)含0.2 mol/L的琥珀酸鈉)和0.1 mL 0.9 mol/L的2,6-二氯酚靛酚(DCPIP)混合，在30 ℃下保溫5 min，待液體冷卻后加入0.1 mL線粒體粗酶液，混勻后加入0.1 mL 硫酸甲酯吩嗪(PMS)啟動(dòng)反應(yīng)，30 ℃下保溫10 min，空白對照為未加酶液的反應(yīng)體系，測定在600 nm處反應(yīng)前后的吸光值。以每克鮮重每分鐘吸光值變化0.01為一個(gè)酶活力單位 U，最終結(jié)果以U/g FW 表示。

1.2.5 細(xì)胞色素C氧化酶(cytochrome C oxidase,CCO)活性的測定

利用1.2.4中的方法提取線粒體粗酶液，參照ERREDE等[21]等的方法略有改動(dòng)。取0.4 mL的線粒體粗酶液，加入1 mL 0.04%的細(xì)胞色素C和4 mL的蒸餾水混勻，37 ℃下保溫2 min。冷卻后加入1 mL 0.4%的對苯二胺，在37 ℃水浴下保溫10 min，空白對照為未加酶液的反應(yīng)體系，測定在510 nm處反應(yīng)前后的吸光值。以每克鮮重每分鐘吸光值變化0.01為一個(gè)酶活力單位U，最終結(jié)果以U/g FW表示。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

使用Microsoft Excel 2007整理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，用SigmaPlot 10.0軟件作圖、計(jì)算均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差。采用IBM SPSS Statistics 20軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性(P<0.05)水平檢驗(yàn)。所有試驗(yàn)均包含3次生物重復(fù)，每個(gè)生物重復(fù)進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對中華壽桃貯藏期及貨架期褐變程度的影響

果肉的褐變程度是衡量桃子是否發(fā)生冷害現(xiàn)象的標(biāo)準(zhǔn)。由圖1可以看出，在貯藏期后期和貨架期，對照組的桃子均出現(xiàn)長斑腐爛的現(xiàn)象。由于桃子冷害最先表現(xiàn)在果肉中，因此，將桃子切開，發(fā)現(xiàn)在貯藏期間，減壓結(jié)合1-MCP處理與單一處理組的桃子褐變較輕，而對照組的桃子褐變現(xiàn)象嚴(yán)重。將貯藏的桃子轉(zhuǎn)入貨架溫度環(huán)境，經(jīng)過3 d的放置，桃子的冷害現(xiàn)象更加嚴(yán)重，對照組和1-MCP、減壓單獨(dú)處理組的桃子從果核向周圍開始有腐爛現(xiàn)象發(fā)生，果肉褐變嚴(yán)重，而經(jīng)過減壓結(jié)合1-MCP處理的桃子褐變較輕。這與陳文烜等[4]用減壓結(jié)合1-MCP處理可顯著延緩翠冠梨貯藏期的品質(zhì)劣變的結(jié)果一致。

圖1 不同處理對中華壽桃貯藏期60 d和貨架期 (60+3) d褐變程度的影響
Fig.1 Effects of different treatments on browning ofPrunuspersicaL. cv.Zhonghuashoutao during 60 days of storage and (60+3) days of shelf-life

2.2 不同處理對中華壽桃貯藏期及貨架期感官品質(zhì)的影響

圖2為10人評審小組對中華壽桃整體感官質(zhì)量的評定結(jié)果。在貯藏期至90 d時(shí)，經(jīng)過減壓結(jié)合1-MCP處理的桃子依然有商品價(jià)值(感官分值大于2)，而其他處理組的桃子在貯藏期至60 d貨架期3 d時(shí)，已經(jīng)失去了商品價(jià)值，這與圖1結(jié)果基本一致。這些結(jié)果表明，減壓結(jié)合1-MCP處理有效地減輕了中華壽桃的冷害，延長了其貯藏期及貨架期。

圖2 不同處理對中華壽桃不同時(shí)期感官品質(zhì)的影響
Fig.2 Effects of different treatments on the sensory effects ofPrunuspersicaL. cv.Zhonghuashoutao in different periods
注：圖中a～d分別表示同一時(shí)間差異顯著性分析，相同小寫字母代表 差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.3 不同處理對中華壽桃貯藏期及貨架期能量水平的影響

2.3.1 在貯藏期不同處理的果實(shí)中ATP、ADP和AMP含量的變化

果蔬采后成熟衰老過程中冷害的發(fā)生與能量的損失有著密切的關(guān)系[15]。由圖3-A可以看出，中華壽桃在貯藏中ATP含量呈先升高后降低的趨勢，減壓結(jié)合1-MCP處理的桃子ATP含量顯著高于(P<0.05)其他組。不同處理果實(shí)中ADP的含量都呈下降的趨勢(圖3-B)，其中對照組ADP下降的速度最快，從9.78 nmol/g降低到了4.12 nmol/g，說明減壓結(jié)合1-MCP處理有效地延緩了ADP含量的下降，促進(jìn)了貯藏期間果實(shí)ADP的積累。在圖3-C中，4個(gè)處理組AMP含量的變化均呈上升的趨勢，對照組的AMP含量上升最快，經(jīng)減壓結(jié)合1-MCP處理的果實(shí)AMP含量增加最少，說明減壓結(jié)合1-MCP處理能夠有效地抑制AMP的上升。以上研究結(jié)果均表明，減壓結(jié)合1-MCP處理能夠使果實(shí)維持一個(gè)較高的能量水平，從而保證桃子在貯藏期間的能量供應(yīng)，減輕果實(shí)在貯藏期間的冷害。SAQUET等[22]認(rèn)為，果蔬采后衰老和冷害褐變的發(fā)生可能與能量的供應(yīng)不及時(shí)和生成速度的下降有很大關(guān)系。陳京京等[23]研究也發(fā)現(xiàn)桃果實(shí)冷害發(fā)生可能與能量缺失有密切聯(lián)系。SAQUET等[22]指出在梨組織中能量在維持細(xì)胞膜的完整性中有很大的作用。引起梨果心褐色的主要因素是ATP的下降或者是能量的損失，ATP參與了果實(shí)脂質(zhì)的合成與脂肪鏈的去飽和，因此，較高的ATP含量有利于保持膜的完整性，提高果實(shí)的抗逆性[24]。這與本研究的結(jié)果一致，說明減壓結(jié)合1-MCP處理可以通過維持較高的ATP水平來提高果實(shí)的抗冷性。

A-ATP含量；B-ADP含量；C-AMP含量
圖3 不同處理對中華壽桃貯藏期ATP、ADP和AMP含量變化的影響
Fig.3 Effects of different treatments on ATP、ADP and AMP content ofPrunuspersicaL.cv.Zhonghuashoutao during storage

2.3.2 在貨架期不同處理的果實(shí)中ATP、ADP、AMP含量的變化

將貯藏不同時(shí)間的桃果實(shí)放入貨架溫度(20 ℃)下3 d和6 d，經(jīng)過減壓結(jié)合1-MCP處理的中華壽桃ATP的含量均顯著高于(P<0.05)單一處理組和對照組(圖4-A和圖4-D)，ADP的含量也顯著高于(P<0.05)其他組(圖4-B和圖4-E)。AMP的含量變化均呈上升趨勢，且減壓結(jié)合1-MCP處理組的AMP含量均低于其他處理組(圖4-C和圖4-F)，這與圖3-C貯藏期間AMP含量的變化一致。表明減壓處理和減壓結(jié)合1-MCP處理在貯藏后期的貨架期中都可以抑制AMP的上升，但是從整個(gè)貯藏期和貨架期期間來看，減壓結(jié)合1-MCP處理具有更佳的效果，能夠維持較高的ATP和ADP水平，顯著降低AMP的含量。

A-貨架期+3 d ATP含量；B-貨架期+3 d ADP含量；C-貨架期+3 d AMP含量；D-貨架期+6 d ATP含量；E-貨架期+6 d ADP含量； F-貨架期+6 d AMP含量
圖4 不同處理對中華壽桃貨架期ATP、ADP和AMP含量變化的影響
Fig.4 Effects of different treatments on ATP、ADP and AMP content ofPrunuspersicaL. cv.Zhonghuashoutao during shelf life

2.4 不同處理的果實(shí)貯藏期及貨架期間能荷的變化

由圖5-A可以看出，減壓結(jié)合1-MCP處理組的最高能荷水平為69.5%，而對照組的能荷水平最高值則為64%，并且在整個(gè)貯藏期間，結(jié)合處理組的平均能荷值比對照組高9.8%，結(jié)合處理組的能荷水平顯著高于(P<0.05)對照組。在貨架期內(nèi)(圖5-B和5-C)，經(jīng)過減壓結(jié)合1-MCP處理的果實(shí)的能荷水平也顯著高于(P<0.05)對照組，對照組的能荷水平最低，能量虧損也最嚴(yán)重。能荷水平的變化趨勢與ATP的變化趨勢相似，這與前人的研究結(jié)果一致[25]。以上結(jié)果說明，經(jīng)過減壓結(jié)合1-MCP處理的果實(shí)在整個(gè)貯藏期和貨架期間，能荷都維持在較高的水平，為果實(shí)提供能量，減輕果實(shí)的冷害。這與張苗等[26]發(fā)現(xiàn)通過冷激結(jié)合甜菜堿處理西葫蘆可維持較高的能荷水平從而減輕西葫蘆的冷害的研究結(jié)果一致。

A-貯藏期能荷；B-貨架期+3d能荷；C-貨架期+6d能荷
圖5 不同處理對中華壽桃貯藏期和貨架期能荷的影響
Fig.5 Effects of different treatments on energy charge ofPrunuspersicaL. cv.Zhonghuashoutao during storage and shelf life

2.5 不同處理對中華壽桃貯藏期及貨架期間SDH酶活性的影響

SDH酶是線粒體的一種標(biāo)志酶，為線粒體內(nèi)膜的結(jié)合酶，它不但能為呼吸鏈提供電子，還能連接氧化磷酸化與電子傳遞。不同處理在貯藏期間對果實(shí)SDH活性的影響如圖6-A所示，在整個(gè)貯藏過程中，SDH活性的變化呈先上升后下降的趨勢。對照組果實(shí)品質(zhì)劣變較快，在貯藏前期就呈現(xiàn)下降的趨勢，其他3個(gè)處理在前30 d，SDH活性有著緩慢上升的趨勢，在貯藏至30 d開始下降。在貯藏后期，雖然整體呈下降的趨勢，但單一處理組和結(jié)合處理組顯著高于(P<0.05)對照組，尤其是經(jīng)過減壓結(jié)合1-MCP處理的中華壽桃，在整個(gè)貯藏期都保持著較高的SDH活性，如圖6-B和圖6-C所示，在貨架期間，果實(shí)的SDH活性整體呈下降的趨勢，對照組在貨架期間的SDH活性都很低，減壓結(jié)合1-MCP處理能夠很好的保持較高的SDH活性水平，從而維持了果實(shí)內(nèi)能量水平，減輕了果實(shí)冷害，對果實(shí)起著較好的保鮮作用。

A-貯藏期SDH活性；B-貨架期+3 d SDH活性；C-貨架期+6 d SDH活性
圖6 不同處理對中華壽桃貯藏期和貨架期SDH活性的影響
Fig.6 Effects of different treatments on SDH activity ofPrunuspersicaL. cv.Zhonghuashoutao during storage and shelf life

2.6 不同處理對中華壽桃貯藏期及貨架期間CCO酶活性的影響

CCO酶是線粒體電子傳遞鏈末端氧化酶，它主要通過氧化磷酸化為細(xì)胞提供能量，其在ATP合成中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[24,27]。不同處理對中華壽桃貯藏期間CCO活性的影響如圖7-A所示，隨著貯藏時(shí)間的增加，CCO活性呈先上升后下降趨勢，其中對照組的CCO活性下降最明顯，而經(jīng)過減壓結(jié)合1-MCP處理的果實(shí)在30 d的CCO活性最高，之后快速下降，但是在整個(gè)貯藏期內(nèi)，CCO酶活性顯著高于(P<0.05)對照組。1-MCP和減壓單一處理的果實(shí)CCO酶活性沒有顯著差異(P>0.05)。在貨架期間，4種處理果實(shí)的CCO酶活性總體呈下降的趨勢(圖7-B和圖7-C)。整個(gè)貨架期間的酶活性較低，CCO酶活性的變化比較緩慢，其中經(jīng)過減壓結(jié)合1-MCP處理的果實(shí)在后期的CCO酶活性顯著高于(P<0.05)其他3個(gè)處理組。其中經(jīng)過1-MCP處理的中華壽桃果實(shí)CCO酶活性在貯藏30 d后放入貨架期6 d時(shí)有快速下降的現(xiàn)象(圖7-C)，這可能是由于1-MCP化學(xué)性質(zhì)的不穩(wěn)定性造成的，但是果實(shí)放入貨架后，減壓結(jié)合1-MCP處理的果實(shí)CCO酶活性明顯高于其他處理組。

貯藏期和貨架期結(jié)果均表明，減壓結(jié)合1-MCP處理能夠保持較高的SDH酶和CCO酶活性。LIU等[28]研究發(fā)現(xiàn)，可以通過提高SDH和CCO兩種酶的活性而提高采后竹筍的ATP含量和能荷水平，從而減輕竹筍在貯藏期間的褐變現(xiàn)象。梨果實(shí)經(jīng)過ASM處理后，2種酶活性顯著提高，維持了較高的能量和能荷水平，有利于提高梨果實(shí)在貯藏過程中的抗冷性和抗病性[25]。WANG等[29]在桃果實(shí)采后上也有相似的研究結(jié)果。以上結(jié)果表明減壓結(jié)合1-MCP處理很好的保持SDH酶和CCO酶的活性，從而維持了細(xì)胞的正常功能，減緩了ATP能量的下降，保證了果實(shí)的能量水平，延緩了果實(shí)冷害的發(fā)生。而單一的處理組和對照組在果實(shí)貯藏的后期，酶活性受到抑制，使得細(xì)胞能量不能順利的傳遞，細(xì)胞的功能活動(dòng)不能正常進(jìn)行，因此細(xì)胞衰老速度加快[30]，從而加劇了果實(shí)的衰老，導(dǎo)致了褐變的發(fā)生。

A-貯藏期CCO活性；B-貨架期+3 d CCO活性；C-貨架期+6 d CCO活性
圖7 不同處理對中華壽桃貯藏期和貨架期CCO活性的影響
Fig.7 Effects of different treatments on CCO activity ofPrunuspersicaL. cv.Zhonghuashoutao during storage and shelf life

3 結(jié)論

1-MCP處理、減壓處理和減壓結(jié)合1-MCP處理能夠有效地延緩冷害造成的果肉褐變現(xiàn)象，提高貯藏品質(zhì)，其中減壓結(jié)合1-MCP處理在貯藏期30 d后效果明顯好于單獨(dú)處理。經(jīng)過減壓結(jié)合1-MCP處理后的中華壽桃果實(shí)能夠維持較高的ATP和ADP，顯著降低AMP水平，減緩SDH酶和CCO酶活性的下降，保證了能量生成速率，為貯藏期和貨架期的果實(shí)提供能量，減輕了果實(shí)的冷害，從而延長了果實(shí)的貯藏期和貨架期。