基于核酸的分子生物學技術在食品過敏原檢測中的應用進展

蘇琰，李融

1(合肥職業技術學院，安徽 合肥，238000)2(巢湖學院，安徽 合肥，238000)

變態反應(allergy)是PIRQUET于1906年基于其傳染病學和免疫學領域的臨床研究提出的[1]，指機體免疫防御功能亢進引起的一種異常免疫應答。過敏原(allergen)即引起超敏反應的抗原。超敏反應的臨床表現多種多樣，其中食物過敏(food allergy)是由食物某些成分的誘導而產生以特異性IgE為主的病理性免疫應答，其癥狀不僅表現在消化道方面，也包括皮膚、神經系統及呼吸系統等。

2015年我國嬰幼兒過敏流行病學調查結果表明，大約40.9%嬰幼兒(2歲以下)家長報告嬰幼兒有過敏性疾病發生[2]。食品中過敏原的體外檢測主要包括蛋白質檢測與核酸檢測兩方面[3]。其中基于蛋白質檢測方法主要包括酶聯免疫吸附測定法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)和色譜分析(chromatography)等，傳統的基于蛋白質的過敏原檢測方法因食物在生產加工過程中蛋白質易變性和降解而導致假陰性結果；基于核酸水平檢測包括針對過敏原基因的擴增技術和雜交技術等，近年來核酸檢測技術尤其是PCR技術不斷建立并推廣應用。本文主要從食品過敏原的核酸擴增檢測技術和核酸雜交檢測技術兩方面，綜述了過敏原的核酸檢驗技術的研究進展。

1 常見過敏原

國際食品法典委員會是聯合國糧食及農業組織和世界衛生組織于1963年共同設立的國際組織并制定了具有重要指導意義的食品國際標準，其公布的《預包裝食品標簽通用標準》中對食品中可能存在的致敏成分應予以說明。國家食品發典委員會中規定的八類過敏原有：谷類(含麩質蛋白)；甲殼綱類動物及甲殼類制品，如蟹、蝦等；蛋類及蛋類制品，如雞蛋等；魚類及其魚類制品，如鱸魚、鱈魚等；花生、大豆及其制品；乳及乳制品(包括乳糖)；堅果及其制品，如杏仁、腰果、核桃等；濃度大于等于10 mg/kg的亞硫酸鹽[4]。

我國相關食品標簽法規對八大類過敏原及其他過敏原種類做出了強制或推薦標識的相關規定[5]。日本自2015年發布了《食品標識基準》對相關食品標簽作出規定[6]，韓國也對須標注的一些食品過敏原作出強制標注的規定。歐盟除強制標注八大類過敏原以外，還增加了芹菜及其制品等，將強制性標注過敏原種類增加到14類[7-8]。

2 基于核酸的分子檢驗技術在食品過敏原檢測中的應用

2.1 核酸擴增技術檢測過敏原

1985年MULLIS[9]發明了聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)，最初的PCR技術采用的是大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段，缺點是不耐熱，SAIKI等[10]于1988提取了水生嗜熱桿菌的耐熱的DNA聚合酶，提高了擴增特異性和靈敏度，極大推動分子生物學的發展。由普通PCR的定性或半定量檢測逐步發展到實時熒光定量PCR和數字PCR的定量檢測[11]，檢測準確度不斷提高，可擴增目的基因片段逐漸增大，引物設計也多樣化[12]。近年來衍生出RT-PCR、巢式-PCR、DPO-PCR、實時熒光定量PCR、多重PCR、數字PCR、PCR芯片和菌落PCR等，廣泛應用于食品安全檢測、基因分型、臨床檢驗和環境監測等各領域。實時熒光定量PCR實時測定探針標記的靶基因的熒光信號，通過信號強度、Ct值和靶基因的起始濃度之間的關系計算其擴增拷貝數或表達水平。與第一代PCR相比，該技術實現了定量檢測，然而其檢測靈敏度也受到模板濃度等的影響。數字PCR是近幾年來迅速發展的新型PCR檢測技術，被稱為第三代PCR技術，在克服了前兩代PCR缺點的基礎上，數字PCR具有對樣本需求量低、靈敏度高和絕對定量等優點[13]。

2.1.1 普通PCR檢測過敏原

與蛋白質檢測方法相比，核酸檢測的優勢在于：熱變性條件下DNA仍可有效提取且穩定性較好。普通PCR檢測過敏原基因的方法建立較早，如YANO等[14]在2007年就針對核桃matK基因設計了WAL-F/WAL-R引物對，建立了普通PCR方法對食品中的微量核桃進行定性檢測。然而最初的傳統PCR檢測技術僅能定性或半定量檢測食品中某一種過敏原基因，隨著分子生物學檢驗技術的不斷發展，能夠同時檢測多種過敏原或者準確度更高的PCR方法被不斷設計出。

2.1.2 多重PCR檢測過敏原

多重PCR(multiplex polymerase chain reaction，MPCR)是1988年由CHAMBERLAIN等提出[15]，與普通PCR相比，其原理及結果分析與普通PCR一致，不同點在于設計2對或多對引物在同一反應體系擴增出2個或多個相應基因片段。多重PCR既擁有傳統PCR較高特異性和靈敏度等的特點，也體現出同時擴增多種目的基因的高效性。由于多對引物在同一體系內擴增，為了準確擴增出目的條帶而不受其他因素干擾，對擴增條件要求較高，對引物設計、循環條件優化等方面要求較嚴格。目前該技術已廣泛應用于食品安全檢測，轉基因檢測及醫學檢驗等領域[16-17]。加工食品中可能會同時含有多種過敏原，單一成分過敏原檢測費時費力，可同時檢測多種過敏原成分的多重PCR檢測技術的高效性則顯得尤為重要，食品過敏原的多重PCR檢測應用見表1。

2.1.3 熒光定量PCR檢測過敏原

1996年美國Applied Biosystems公司推出實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR)，可分為兩類：一類是DNA結合染料如SYBR Green Ⅰ等以提高熒光強度進行檢測；另一類特異性檢測方法是Taqman法，即在PCR體系中引入Taqman探針，DNA聚合酶延伸至于探針所在位置將其水解產生熒光信號進行檢測。該技術的出現使分子檢驗技術領域發生重大的變化，目前已廣泛地應用于臨床醫學檢驗、動植物病原體感染以及食品安全如過敏原檢測等定量檢驗檢測等領域[22-23]。實時熒光定量PCR較上述幾種PCR技術靈敏度高，可定量檢測分析。也可將實時熒光定量PCR與多重PCR相結合，建立更為快捷準確的檢測體系。近年來建立多種食源性過敏原的qPCR檢測方法，詳見表2。

表1 基于多重PCR的食品過敏原檢測方法Table 1 Multiplex PCR based methods for food allergens

2.1.4 數字PCR檢測過敏原

數字PCR(digital PCR，dPCR)是將待檢核酸樣本分成多份，隨機分布于大量的獨立擴增體系中，盡可能使每擴增體系只包含單個拷貝模板，并對其反應信號進行檢測和統計學分析，從而實現絕對定量檢測。數字PCR于1999年由VOGELSTEIN等提出，并在96孔和384孔微量反應孔中進行致癌突變基因ras定量分析[34]。

表2 基于實時熒光定量PCR的食品過敏原檢測方法Table 2 Quantitative real-time PCR based methods for food allergens

與qPCR相比，數字PCR無需依賴標準品或建立標準曲線，檢測結果不受擴增效率的影響，最終的檢測結果通過對陽性和陰性反應單元數統計分析以及泊松分布修正，從而實現絕對定量分析。且隨著微納制造等相關技術和產業化的發展，實現了數以萬計甚至更多的PCR獨立反應單元的制備，全球各大生物儀器公司紛紛開發出各類商業化的數字PCR檢測系統[11]。

根據反應單元的劃分，目前商業化數字PCR平臺主要分為芯片式和微液滴式。微孔芯片dPCR系統指的是樣本分布在微容量固體反應單元中進行目的基因擴增并對每單元進行實時或終點熒光檢測分析。如Life Technologies公司的Open Array dPCR系統、QuantStudioTM12K Flex dPCR系統和QuantStudioTM3D dPCR系統等。微液滴式dPCR系統指的是將樣本分散在獨立的“油包水”微小液滴反應單元中進行目的基因擴增，并對每單元擴增結果進行實時或終點熒光檢測分析。如Bio-Rad公司開發的QX200TMdPCR系統和RainDance公司的RainDropTMdPCR系統[35]。目前，基于上述芯片式dPCR系統或微滴式dPCR系統商業檢測平臺已較多應用于轉基因、食品安全檢測以及臨床醫學檢驗等各領域[36-37]。

利用數字PCR系統檢驗食品過敏原的方法研究近年來也逐步開展和建立。PIERBONI等[38]建立了食品中大豆和花生的數字PCR檢測方法，針對大豆的Glym30、Glym5、Lectin基因和花生的Arah1、Arah2基因設計引物，利用dPCR檢測大豆和花生，并同時將dPCR與qPCR及ELISA等作對比研究。MAYER等[39]針對大豆的葉綠體DNA的ndhH基因設計數字PCR引物檢測大豆成分，靈敏度達到0.16 mg/kg。

2.1.5 環介導的核酸等溫擴增技術檢測過敏原

NOTOMI等開發了環介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)[40]，根據6對特異序列設計2對內外引物：2條較長的內引物和2條較短的外引物，通過鏈置換DNA聚合酶在約60～65 ℃等溫下完成基因的循環擴增，最終形成不同的梯度結構[41]。LAMP的焦磷酸鎂沉淀產物肉眼即可觀察其渾濁變化程度從而判斷來是否有目的基因擴增。除此以外，也可觀察凝膠電泳是否為梯形條帶；或將熒光染料摻入反應產物中，用紫外燈照射直接觀察其顏色的變化以判斷檢驗結果[42]；或通過比濁法檢測焦磷酸鎂沉淀。LAMP與普通PCR相比，檢測速度更快，不需要進行模板的變性、循環及電泳等過程，是一種新型的簡單、快速、特異性強、檢驗成本較低且可以不需要依賴精密儀器設備的分子生物學檢驗技術。LAMP目前已經應用于動植物病毒、細菌、真菌毒素、醫學檢驗以及食品安全監測等各領域[43-44]，具有較為廣闊的應用前景。環介導等溫擴增與其他擴增技術相比，更為簡單快捷，可不依靠精密儀器等優點，在食源性過敏原的快速檢測領域也逐漸受到關注(表3)。

表3 基于環介導等溫擴增技術的食品過敏原檢測方法Table 3 Loop-mediated isothermal amplification based methods for food allergens

2.2 核酸分子雜交技術檢測過敏原

基于核酸的分子雜交技術有固相、液相和原位雜交等。固相核酸雜交技術將待檢DNA/RNA轉移并固定在固相膜上，對應的互補探針在載體膜上與待檢靶序列雜交反應，并檢測雜交的探針信號。該技術的優點是高靈敏度、高效及高通量等，也已應用于動、植物等病毒檢測、食品安全檢測以及基因的鑒定及定性分析等[51]。液相反應系統如懸浮芯片技術(suspension array technology，SAT)是用特殊編碼的微球顆粒作為載體來固定探針，是一種集編碼、流式細胞技術和電子信息技術等于一體的檢測技術。該技術在食品過敏原檢測也有應用，CHRISTOPOULOU等人設計了探針微球同時檢測加工食品中所含榛子、花生和核桃3種過敏原，最低檢出限可達0.01%[52]。

2.2.1 基于DNA的芯片檢測技術檢測過敏原

基于核酸的生物芯片檢測技術是利用核酸分子雜交的原理，將其中已知序列核酸鏈(探針)標記后固化于芯片基質表面，與待測樣本核酸(靶序列)利用堿基互補配對原則進行分子雜交檢測，通過雜交信號檢測完成對靶序列的定性或定量檢測，分析待測樣本靶基因的有無或其表達的變化[53]。因此，與傳統的核酸印跡雜交技術如DNA印跡(southern blotting)或RNA印跡(northern blotting)等不同，基因芯片技術采用的是一種反向雜交。其突出優點是能夠大規模、高通量、準確快速地同步分析待檢基因。

2.2.2 基于DNA的生物傳感器檢測技術檢測過敏原

基于DNA的生物傳感器是將核酸雜交信號通過轉換器轉換為光電等物理信號并對此進行定量檢測，將高度特異性的核酸雜交與高度敏感性的物理信號轉導相互協作[54]，具有準確、高效、自動化、專一性強，可連續重復利用以及操作簡便等優點。

核酸雜交檢測技術在過敏原檢測領域具有突出優勢，通過開發精密檢測儀器不斷提高檢測的準確度，多種過敏原的相關鑒定方法相繼建立(表4)。

3 展望

隨著食品加工技術的多元化發展，加工食品的功能和特性均得到了提升改善，但亦可能在生產過程中引入多種過敏原，從而增加了過敏風險，因此建立高效準確的食源性過敏原的檢測方法具有重要意義。

目前過敏原檢測仍然以蛋白質檢測為主，其中應用較為廣泛的是免疫學檢驗技術，如酶聯免疫吸附試驗和化學發光免疫分析等，具有特異性強和準確率高等優點，但檢測耗時較長。市場上大部分商業化的試劑盒仍然是針對食品中單一過敏原成分進行檢測，不能同時檢測多種蛋白過敏原，且在痕量檢測方面略顯不足。近年來也相繼建立起多種過敏原的質譜檢測體系[60]，需注意的是不同樣本處理方法對結果影響較大且成本較高。

表4 基于核酸雜交技術的食品過敏原檢測方法Table 4 Nucleic acid hybridization based methods for food allergens

與蛋白質檢測相比，基于核酸的分子生物學檢測技術能夠更加簡便、快捷、高靈敏度地檢測食品中存在的過敏原基因。基于基因擴增的PCR技術從定性檢測發展到定量檢測，其檢測精確度不斷提高，引物設計越來越多樣化，可檢測范圍逐漸擴大。核酸雜交技術可在同時、短時內分析多種過敏原基因，使得過敏原基因檢測更加簡便快速，實現了高通量和自動化檢測。然而核酸檢測技術也存在一些缺點，比如對儀器設備要求高，檢測步驟較為繁瑣以及檢測時間較長，檢測對象為核酸而非致敏蛋白等。

綜上所述，現階段的檢測手段仍不能完全滿足實際檢測工作的需求。對于過敏原的核酸檢測技術，今后一方面需對核酸檢測技術的條件進行優化和改進，不斷提高其特異性和靈敏度；另一方面則需要研發更為先進便攜的檢測設備，為實現快速高效的現場核酸檢測提供方便。此外，蛋白質檢測和核酸檢測各具優點，可將多種檢測技術相互結合以滿足實際檢測工作中的多元化要求。