QuEChERS-氣相色譜-串聯質譜法測定3種食用菌中6種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的殘留量

范良彪，吳清實，黃麗麗，黃月群，梁美娜，張 慶?

(1.泉州師范學院 化工與材料學院，泉州 362000；2.桂林理工大學 環境科學與工程學院，桂林 541006)

20世紀60年代，捷克科學家Musilek V 發現β-甲氧基丙烯酸是由生長在腐爛木頭上的蘑菇等真菌分泌生成的具有抗菌活性的天然化合物[1]。到20世紀90年代，先正達和巴斯夫等2家公司開發了嘧菌酯和醚菌酯等甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，隨后一系列甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑逐漸被研發并投入了使用[2]。甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑是通過抑制真菌線粒體呼吸，阻斷細胞色素之間電子傳遞，干擾三磷酸腺苷(ATP)產生，從而影響病原真菌體的能量循環，進而起到殺菌作用[3]。2018年，全球甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑銷售額累計超過30億美元，占殺菌劑市場份額的1/4，目前還以每年5%左右的速率增長[4]。蘑菇等真菌類食品深受廣大人民群眾的喜愛，是老百姓餐桌上的美食[5-6]。當受甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑污染的菌類產品被人類誤食后，會對人體產生毒害作用，輕者產生頭暈、心悸等癥狀，重者可能導致嘔吐、功能紊亂等癥狀[7]。因此，加強對蘑菇等食用菌類食品中甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑殘留的監測，具有重要的現實意義。

食品中甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑殘留的主要檢測方法有氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-串聯質譜法(GC-MS/MS)和超高效液相色譜-串聯質譜法(UPLC-MS/MS)[8-11]。其中色譜法(GC 和HPLC)檢出限高，但專屬性較差，對于微量的殺菌劑殘留適用性較差；UPLC-MS/MS價格較高，對低沸點的殺菌劑的檢測準確度偏低[12-14]。本工作采用QuEChERS[15-16]-GC-MS/MS法測定蘑菇等食用菌中6種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的殘留量，以期為食用菌類食品中甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑殘留的監測提供技術參考。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

島津GCMS-2010 PLUS 型氣相色譜儀；島津TQ-8040型三重四極桿質譜儀；Quintix 2102型電子天平；YGC-36型氮吹儀；H205 R 型高速冷凍臺式離心機；Milli-Q gradient a10型超純水系統。

甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑標準儲備溶液:取啶氧菌酯、醚菌酯、嘧螨酯、醚菌胺、吡唑醚菌酯、氟嘧菌酯標準物質各1.0 mL 于10 mL 容量中，用體積比為1∶1的環己烷-乙酸乙酯溶液稀釋至刻度，搖勻，配制成10.0 mg·L－1啶氧菌酯、醚菌酯、嘧螨酯、醚菌胺、吡唑醚菌酯、氟嘧菌酯的標準儲備溶液。

甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑混合標準溶液系列:取適量的甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑標準儲備溶液，用體積比為1∶1的環己烷-乙酸乙酯溶液稀釋，配制成0.02，0.04，0.1，0.2，0.4，1.0，2.0 mg·L－1的 混合標準溶液系列。

啶氧菌酯(編號:SB05-404－2017)、醚菌酯(編號:SB05-212－2008)、嘧螨酯(編號:IST25038-100)、醚菌胺(編號:IST21241)、吡唑醚菌酯(編號:SB05-293－2015)、氟嘧菌酯(編號:1ST27017-100M)等6種標準物質的質量濃度均為100 mg·L－1。

乙腈、丙酮、甲醇、環己烷、乙酸乙酯均為分析純；Qu ECh ERS萃取包(4g MgSO4和1 g乙酸鈉)，凈化管[400 mgN-丙基乙二胺(PSA)]。

1.2 儀器工作條件

1)色譜條件 Rtx-5 MS 色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25μm)；進樣口溫度230 ℃；載氣為高純氦氣，流量1.6 mL·min－1；恒流模式；不分流進樣；進樣量1μL。柱升溫程序見表1。

表1 色譜柱升溫程序Tab.1 Program of elevation of chromatographic column

2)質譜條件 電子轟擊離子源(EI)；離子源溫度240 ℃；轟擊能量70 eV；碰撞氣為高純氬氣；接口溫度270 ℃；溶劑延遲時間4.5 min；多反應監測模式(MRM)。其他質譜參數見表2。

表2 質譜參數Tab.2 MS parameters

1.3 試驗方法

稱取約200 g食用菌樣品，粉碎后置于自封袋中，如過夜保存，需將其置于－18 ℃環境中冷凍。稱取25.0 g 樣品于塑料離心管中，加入體積比為1∶1的環己烷-乙酸乙酯溶液25 mL，再加入Qu ECh ERS 萃取包，渦旋提取2.0 min，以10 000 r·min－1的轉速冷凍離心8 min；將上清液轉移至PSA 凈化管中，渦旋2.0 min，以10 000 r·min－1的轉速冷凍離心8 min；取10 mL上清液于刻度試管中，于60 ℃氮吹至近干，加入體積比為1∶1的環己烷-乙酸乙酯溶液1.0 mL，渦旋溶解后過0.22μm 濾膜，濾液在儀器工作條件下測定。

2 結果與討論

2.1 前處理方法的選擇

食用菌中甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的前處理方法主要有液液萃取法、固相萃取法、凝膠凈化色譜(GPC)-濃縮法和QuEChERS提取法等。液液萃取法操作繁瑣，基質去除不徹底，提取率較低，且易出現假陽性結果；固相萃取法凈化效果好，但凈化過程步驟冗長，易造成待測殺菌劑的損失，導致檢測準確度偏低；GPC-濃縮法凈化效果好，但溶劑消耗量較大，處理時間久，儀器成本較高，不利于該方法的推廣應用；Qu ECh ERS提取法是近年來發展起來的一種前處理方法，具有提取步驟簡單、凈化效果好，且待測殺菌劑在提取過程中損失小等特點。試驗考察了固相萃取法和Qu ECh ERS提取法等2種前處理方法對加標量為0.1 mg·L－1的樣品中待測殺菌劑回收率的影響，結果見表3。

由表3 可知:Qu ECh ERS 提取法的回收率較高，推斷原因是固相萃取法的操作步驟較為繁瑣，凈化、富集等過程造成了待測殺菌劑的損失，而Qu ECh ERS提取法步驟簡單，待測殺菌劑在處理過程中的損失較小。試驗選擇前處理方法為Qu ECh-ERS提取法。

2.2 提取溶劑的選擇

食用菌樣品基質比較復雜，含有大量的蛋白質、糖類、脂肪、纖維素及礦物質等，提取溶劑是影響檢測結果準確度的重要因素。合適的提取溶劑不僅能將樣品中的甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑提取完全，還能減少對基質中的雜質，尤其是干擾雜質的提取。按照試驗方法進行測定，并考察了甲醇、乙腈、乙酸乙酯、環己烷和體積比為1∶1的環己烷-乙酸乙酯溶液等5種不同極性的提取溶劑對食用菌樣品基質中6種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑提取效果的影響，結果見表4。

表3 前處理方法對6種殺菌劑回收率的影響Tab.3 Effect of the pretreatment method on the recovery of the 6 fungicides

表4 不同提取溶劑得到的提取回收率Tab.4 Extraction recoveries obtained with different extraction solvents

由表4可知:當以體積比為1∶1的環己烷-乙酸乙酯溶液作為提取溶劑時，6種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑提取的效果最佳。試驗選擇體積比為1∶1的環己烷-乙酸乙酯溶液為提取溶劑。

2.3 分散固相吸附劑的選擇

QuEChERS提取法常用的分散固相吸附劑主要有C18、石墨化碳黑(GCB)、PSA 等3種萃取劑。由于食用菌樣品基質較為復雜，含有大量的極性、中等極性和弱極性化合物，選擇合適的吸附劑，不僅能夠降低基質成分干擾，還能提高檢測靈敏度和準確度。試驗考察了上述3種吸附劑對待測樣品凈化效果的影響。結果顯示，C18萃取劑和GCB萃取劑對6種待測殺菌劑的吸附作用明顯，回收率偏低；PSA萃取劑不僅能較好地去除基質效應，且對6種待測殺菌劑吸附較少，檢測準確度好。因此，試驗選擇PSA 作分散固相吸附劑。

2.4 質譜參數的優化

取6種10 mg·L－1殺菌劑單標準溶液，在質譜儀的全掃描模式進樣分析，得到各殺菌劑母離子；再采用產物離子掃描模式，得到各殺菌劑的產物離子，選擇豐度較高的3個產物離子作為定量離子、定性離子1和2，最后采用MRM，優化了碰撞電壓、碰撞時間等參數。優化后的參數見表2。6種殺菌劑的色譜圖見圖1。

圖1 6種殺菌劑的色譜圖Fig.1 Chromatogram of the 6 fungicides

2.5 標準曲線和檢出限

按照儀器工作條件對甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑混合標準溶液系列進行測試，以6種殺菌劑的質量濃度為橫坐標，其對應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線，以3倍信噪比計算檢出限(3S/N)，10倍信噪比計算測定下限(10S/N)，結果見表5。

2.6 精密度與回收試驗

按照試驗方法對香菇、金針菇和雞腿菇等3種市售常見食用菌陰性樣品進行低、中、高等3個濃度水平的加標回收試驗，計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD)，結果見表6。

表5 線性參數、檢出限和測定下限Tab.5 Linearity parameters，detection limits and lower limits of determination

表6 精密度和回收試驗結果Tab.6 Results of tests for precision and recovery

表6 (續)

由表6可知:6種殺菌劑的回收率為83.5%～106%，RSD 為1.7%～5.0%。

2.7 重復性試驗

制備6份含0.02 mg·L－1的6種殺菌劑混合標準溶液的陰性食用菌樣品，并按照試驗方法進行測定，計算測定值的RSD。結果顯示:啶氧菌酯、醚菌酯、嘧螨酯、醚菌胺、吡唑醚菌酯、氟嘧菌酯的RSD 分別為4.2%，3.5%，4.1%，2.7%，2.9%，3.5%，表明該方法具有良好的重復性。

本工作建立一種Qu ECh ERS-GC-MS/MS 測定3種食用菌中6種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑殘留量的分析方法，該方法具有前處理速度快、操作簡便、準確度高等優點，適用于食用菌類食品中甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑殘留的監測，可為國家標準建立提供技術參考。