溶劑萃取分離-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定對蝦中12種抗生素的殘留量

李飛鵬，黃 炯，王明珠，陳 玲?，陶 紅

(1.上海理工大學(xué) 環(huán)境與建筑學(xué)院，上海 200093；2.同濟大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200092)

隨著人們對水產(chǎn)品消費需求的增加，對蝦等水產(chǎn)品的養(yǎng)殖面積和養(yǎng)殖密度不斷增加。然而，在大規(guī)模集約化養(yǎng)殖中，細菌性蝦病頻繁發(fā)生，抗生素作為防治細菌性疾病的藥物被廣泛應(yīng)用。殘留在水產(chǎn)品中的抗生素，經(jīng)過食物鏈的富集作用，會嚴(yán)重威脅人體的健康[1]。磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類等多種抗生素在不同水產(chǎn)品中不斷被檢出，部分水產(chǎn)品中抗生素的檢出量遠超過我國規(guī)定的最大殘留限量[2-5]。抗生素類藥物進入水產(chǎn)動物體內(nèi)，經(jīng)過吸收、代謝和排泄過程后，其殘留量一般在μg·L－1水平，但是由于水產(chǎn)品中含有蛋白質(zhì)、脂類、色素和水分等物質(zhì)，基質(zhì)十分復(fù)雜，其中任何一種基質(zhì)成分的含量都可能是藥物殘留組分的數(shù)百倍以上，不僅會干擾目標(biāo)物的檢測準(zhǔn)確度，還會污染儀器設(shè)備，降低儀器靈敏度和使用壽命[6]。因此，選擇有效的前處理方法和高靈敏度的檢測方法，是分析此類樣品的關(guān)鍵性步驟。

加速溶劑萃取法[7]、加壓液相萃取[8]、酶聯(lián)免疫法[9]等常見的預(yù)處理方法多用于提取水產(chǎn)品中的一類或兩類抗生素，水產(chǎn)品中多種類型抗生素同時檢測的報道尚不多見[10-12]。超聲溶劑萃取法被認為是有效、直接的一種提取方法，具有提取效果好、省時、操作簡單等優(yōu)點[13-15]，因此本工作選用超聲溶劑萃取法提取目標(biāo)物，并對其條件進行優(yōu)化改進，然后采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定南美白對蝦樣品中的5 種磺胺類抗生素及增效劑[磺胺嘧啶(SDZ)、磺胺甲惡唑(SMD)、磺胺二甲基嘧啶(SMZ)、磺胺對甲氧嘧啶(SMX)和甲氧芐胺嘧啶(TMP)]、2種喹諾酮類抗生素[諾氟沙星(NOF)和左氧氟沙星(LEOF)]、3種四環(huán)素類抗生素[土霉素(OTC)、四環(huán)素(TC)和金霉素(CTC)]以及2種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素[紅霉素(ETM)和羅紅霉素(RTM)]，旨在建立一種成本低、適用性廣且能同時檢測水產(chǎn)品中多種抗生素的分析方法。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

TSQ Quantum Access MAX 型高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀；TDL-5-A 型大容量離心機；Hei-VAP Advantage型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；KQ 2200B型超聲波清洗器；美國SULPELCO SPE-12型固相萃取裝置(內(nèi)置12管)；MTN-2800D 型氮吹儀；Scientz-12N 型冷凍干燥機；TL-2010型球磨機。

12種抗生素的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:500 mg·L－1，介質(zhì)為甲醇。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:1 mg·L－1，介質(zhì)為甲醇。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:介質(zhì)為甲醇，質(zhì)量濃度分別為1，2，5，10，20，50，100μg·L－1。

含0.1 mol·L－1Na2EDTA 的Mcllvaine緩沖溶液:稱取11.8 g一水合檸檬酸、13.72 g十二水合磷酸氫二鈉、33.62 g Na2EDTA 溶于1 L水中，溶解搖勻后，用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)pH 至4.0±0.05。

SDZ、SMX、SMZ、SMD、NOF、TC、OTC、CTC、ETM、RTM、TMP、回收率指示物13C-甲氧芐氨嘧啶(13C-TMP)、LEOF 等標(biāo)準(zhǔn)品的純度不小于97%；甲醇、乙腈、丙酮、正己烷、乙酸均為色譜純；乙二胺四乙酸二鈉鹽(Na2EDTA)、一水合檸檬酸(C6H8O7·H2O)、十二水合磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)均分析純；試驗用水均為超純水(電阻率18.2 MΩ·cm)。

對蝦樣品隨機取自杭州灣南岸的南美白對蝦養(yǎng)殖基地中的3個蝦塘，每個塘采集10～15尾對蝦。

1.2 儀器工作條件

1)色譜條件 采用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(150 mm×2.1 mm，5μm)，柱溫30 ℃。流動相:A 為0.1%(體積分?jǐn)?shù)，下同)乙酸溶液；B 為甲醇；流量0.35 mL·min－1，進樣體積10μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program

2)質(zhì)譜條件 電噴霧(ESI)離子源；采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)正離子掃描模式；離子傳輸毛細管溫度350 ℃；鞘氣為氮氣，流量9 L·min－1；輔助氣為氮氣，流量3 L·min－1；碰撞氣為氬氣，流量0.18 mL·min－1；毛細管電壓4 000 V；霧化器壓力為275.79 k Pa。

目標(biāo)抗生素的定性/定量離子質(zhì)荷比和其他質(zhì)譜參數(shù)見表2，其中“?”為定量離子。

表2 質(zhì)譜參數(shù)Tab.2 MS parameters

表2 (續(xù))

1.3 試驗方法

將對蝦樣品冷凍干燥后，用球磨機磨成粉末狀，制成干基樣品，置于－20 ℃冷凍保存，待分析。稱取對蝦粉末狀試樣1.00 g于50 mL離心管中，加入10 mL體積比為1∶4的含0.1 mol·L－1Na2EDTA的Mcllvaine緩沖溶液-乙腈混合溶液，振蕩1 min，常溫超聲提取10 min，以5 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心5 min，以除去對蝦樣品中的蛋白質(zhì)，將上清液轉(zhuǎn)移至離心管中，再重復(fù)提取2次，合并提取液。在提取液中加入用乙腈飽和的正己烷20 mL，除去對蝦樣品中的脂類雜質(zhì)，振蕩5 min，以4 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心10 min。靜置分層，棄去上層正己烷，取下層溶液于40 ℃下旋蒸至體積不變，用水稀釋至200 mL，確保萃取液中有機溶劑的體積分?jǐn)?shù)小于5%，以防止目標(biāo)抗生素穿透固相萃取柱而無法保留。

CNWBOND LC-C18固相萃取小柱依次用5 mL甲醇和5 mL 水活化后，將樣品溶液以1.0～1.5 mL·min－1的速度過柱，待溶液完全流出后，用5%(體積分?jǐn)?shù))的甲醇溶液5 mL淋洗柱子，棄去全部流出液，用負壓抽干并以6 mL甲醇洗脫柱子，收集洗脫液并吹氮至近干，用甲醇定容至1.0 mL，經(jīng)0.22μm 針頭式過濾器過濾后，在儀器工作條件下進行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

按照儀器工作條件對50 ng·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進行測定，12種抗生素的色譜圖見圖1。

圖1 12種抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖Fig.1 TIC chromatogram of the mixed standard solution of the 12 antibiotics

2.2 提取劑的選擇

四環(huán)素類與氟喹諾酮類抗生素均能與Zn2＋、Fe3＋、Al3＋等金屬離子、有機固體顆粒形成穩(wěn)定的配合物[16-18]，使其提取效率降低，當(dāng)以含0.1 mol·L－1Na2EDTA 的Mcllvaine緩沖溶液為提取劑時，這兩種抗生素可以保持電離狀態(tài)，且氟喹諾酮類抗生素的回收率增加[13]，但是這類提取劑對磺胺類抗生素提取效果較差[19]，可使用乙腈或乙腈和其他緩沖溶液的混合溶液對磺胺類抗生素進行提取[20-23]，同時乙腈能使樣品中的蛋白質(zhì)變性生成沉淀通過離心去除，其在提取肉類殘留抗生素時有廣泛的應(yīng)用[24]。

試驗考察了以含0.1 mol·L－1Na2EDTA 的Mcllvaine緩沖溶液、不同體積比(1∶1、1∶4、4∶1)的含0.1 mol·L－1Na2EDTA 的Mcllvaine緩沖溶液-乙腈、乙腈為提取劑時對混合標(biāo)準(zhǔn)溶液添加量為50 ng·g－1的對蝦樣品中12種抗生素回收率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 提取劑對對蝦中12種抗生素回收率的影響Fig.2 Effect of extract on the recovery of the 12 antibiotics in prawn

由圖2 可以看出:以含0.1 mol· L－1Na2EDTA 的Mcllvaine緩沖溶液或含0.1 mol·L－1Na2EDTA 的Mcllvaine緩沖溶液-乙腈(體積比為4∶1)作為提取劑時，磺胺類抗生素的回收率均低于60%；以含0.1 mol·L－1Na2EDTA 的Mcllvaine緩沖溶液-乙腈(體積比為1∶1)或含0.1 mol·L－1Na2EDTA 的Mcllvaine緩沖溶液-乙腈(體積比為1∶4)為提取劑時，磺胺類抗生素的回收率明顯提高，且后者的效果較明顯。這是因為磺胺類抗生素難溶于含0.1 mol·L－1Na2EDTA 的Mcllvaine緩沖溶液等非極性有機溶劑，添加一定量的乙腈有助于增加磺胺類抗生素的溶解度。試驗選擇含0.1 mol·L－1Na2EDTA 的Mcllvaine緩沖溶液-乙腈(體積比為1∶4)為提取劑。

2.3 提取劑體積的選擇

提取劑的體積不僅影響提取效果，還影響后續(xù)的旋蒸時間。試驗考察了不同體積(10，15，20 mL)的提取劑對對混合標(biāo)準(zhǔn)溶液添加量為50 ng·g－1的對蝦樣品中12種抗生素回收率的影響，見圖3。

圖3 提取劑體積對對蝦中12種抗生素回收率的影響Fig.3 Effect of volume of the extract on the recovery of the 12 antibiotics in prawn

如圖3所示:當(dāng)提取劑體積為10 mL 時，各抗生素的回收率為74%～109%，可滿足試驗要求；而當(dāng)提取劑的體積由10 mL增加至20 mL時，磺胺類抗生素的回收率增加約5%，其他類抗生素的回收率沒有明顯變化。為減少有機溶劑的用量及雜質(zhì)干擾，縮短后續(xù)旋蒸時間，試驗選擇提取劑的體積為10 mL。

2.4 超聲時間的選擇

試驗考察了不同超聲(5，10，20，30 min)時間對混合標(biāo)準(zhǔn)溶液添加量為50 ng·g－1的對蝦樣品中12種抗生素回收率的影響，見圖4。

如圖4所示:當(dāng)超聲時間為5 min時，各抗生素的回收率均較低(小于80%)；當(dāng)超聲時間為10～20 min時，提取效果較好且比較穩(wěn)定；當(dāng)超聲時間為30 min時(超聲水浴溫度升高10 ℃以上)，各抗生素回收率明顯下降，尤其是四環(huán)素類和磺胺類抗生素，這是由于隨著超聲時間的延長，超聲對抗生素降解作用越來越明顯[25]。試驗選擇超聲時間為10 min。

2.5 固相萃取柱的選擇

圖4 超聲時間對對蝦中12種抗生素回收率的影響Fig.4 Effect of ultrasound time on the recovery of the 12 antibiotics in prawn

在對對蝦樣品進行提取后，需要使用反相固相萃取柱進行進一步的凈化以除去其他雜質(zhì)。常用的反相固相萃取柱有HLB柱和C18柱，前者使用的填料為親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮兩種單體按一定比例聚合成的大孔共聚物，其可應(yīng)用的酸度范圍較大；后者以十八烷基鍵合硅膠為基質(zhì)，對上樣操作要求比較嚴(yán)格。為了排除同種填料凈化效果的差異，試驗考察了Waters Oasis HLB、Supelco LC-18 和CNWBOND LC-C18等3 種反相固相萃取柱(3種小柱柱容量均為500 mg/6 mL)對混合標(biāo)準(zhǔn)溶液添加量為50 ng·g－1的對蝦樣品中12種抗生素回收率的影響，見圖5。

圖5 固相萃取柱對對蝦中12種抗生素回收率的影響Fig.5 Effect of SPE column on the recovery of the 12 antibiotics in prawn

如圖5所示:對于四環(huán)素類物質(zhì)，Supelco LC-18小柱的回收率偏低(約60%)，保留能力不如CNWBOND LC-C18小柱，且洗脫液易出現(xiàn)絮狀物；而提取液過Waters Oasis HLB小柱和CNWBOND LC-C18小柱后均呈澄清狀態(tài)，凈化效果明顯，并且除SDZ、SMD、SMZ、SMX、ETM 外，過CNWBOND LC-C18小柱后的其余7 種抗生素的回收率高于過Waters Oasis HLB小柱的回收率。綜合考慮回收率、凈化效果及經(jīng)濟成本，試驗最終選定的固相萃取柱為CNWBOND LC-C18小柱。

2.6 洗脫劑用量的選擇

洗脫劑的用量是影響洗脫效果的重要因素，洗脫劑用量過少會導(dǎo)致洗脫不完全，回收率降低；用量過多，不僅會延長吹氮濃縮的時間，還會引入更多的雜質(zhì)，影響后續(xù)檢測。以混合標(biāo)準(zhǔn)溶液添加量為50 ng·g－1的對蝦樣品為研究對象，試驗選擇用8 mL甲醇對負壓抽干的固相萃取柱分8次進行洗脫，每次1 mL，收集第3、4、5、6、7、8次的洗脫液，按照試驗方法進行測定，結(jié)果見表2。

表2 不同洗脫次數(shù)收集的洗脫液中抗生素的含量Tab.2 Content of antibiotics in eluate collected with the different elution times

由表2可知:第5次的洗脫液中已檢測不到目標(biāo)抗生素，為了保證前處理過程的有效性，試驗選擇洗脫劑的用量為6 mL。

2.7 色譜條件的優(yōu)化

當(dāng)溫度高于40℃時，磺胺類抗生素會變得極不穩(wěn)定[26]。研究發(fā)現(xiàn)，在30 ℃的色譜柱溫下，3種磺胺類抗生素的吸收值均較高[27]，因此試驗選擇的色譜柱柱溫為30 ℃。

由于試驗采用甲醇處理樣品，以甲醇作為流動相B時，可以獲得尖銳對稱的峰形，因此試驗選擇甲醇作為流動相B。由于酸性的流動相能夠增強離子化效果，使抗生素出峰效果更加明顯[28]，因此試驗選用0.1%乙酸溶液作為流動相A。

2.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

按照儀器工作條件對混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進行測定，用外標(biāo)法定量。以12種抗生素的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，其對應(yīng)的的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，12種抗生素的質(zhì)量濃度均在1～100μg·L－1內(nèi)與其對應(yīng)的峰面積呈線性關(guān)系，線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表3。

按照試驗方法對加標(biāo)量為10 ng·g－1對蝦樣品進行測定，以3倍信噪比計算12種目標(biāo)抗生素的檢出限(3S/N)，結(jié)果見表3。

表3 12種抗生素的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Tab.3 Linear regression equations，correlation coefficients and detection limits of the 12 antibiotics

由表3 可知:12 種抗生素的檢出限為0.52～3.02 ng·g－1(干重)，說明該方法的靈敏度好，滿足我國對水產(chǎn)品藥物殘留監(jiān)控的限量要求。

2.9 精密度和回收試驗

按照試驗方法對空白對蝦樣品中進行低、中、高等3個濃度的加標(biāo)回收試驗，每個濃度水平平行測定5 次，計算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表4。

表4 精密度和回收試驗結(jié)果(n＝5)Tab.4 Results of tests for precision and recovery(n＝5)%

由表4可以看出:對蝦中12種抗生素的回收率為70.2%～102%，RSD 均小于14%，說明該方法有較好的準(zhǔn)確度和精密度，符合GB/T 27404－2008中的準(zhǔn)確度和精密度要求(回收率大于60%，RSD小于20%)。

2.10 方法適用性的驗證

飼料和對蝦均為富含蛋白質(zhì)的樣品，為驗證該方法的適用性，以飼料樣品為基底，加入100 ng回收率指示物13C-TMP，按照試驗方法進行測定。結(jié)果表明:13C-TMP回收率為70.3%～104%，說明本方法對富含蛋白質(zhì)的飼料樣品也具有一定的適用性。

本工作建立了超聲萃取溶劑法-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定南美對蝦中12種抗生素的方法，該方法的檢出限為0.52～3.02 ng·g－1(干重)；回收率為70.2%～102%，RSD＜14%，符合抗生素類藥物殘留的檢測要求，同時對富含蛋白質(zhì)的其他樣品(如飼料)也具有較好的適用性。