耐釩微生物的分離鑒定及其去釩能力分析

伏媛 李迅 余雪梅 王洪婷 賀敏婕 張杰 彭書明

摘要：：隨著經(jīng)濟的發(fā)展，重金屬污染越來越嚴重。微生物修復技術作為一種新型的修復方法，越來越受到世界各國的重視，因此尋找可降解重金屬的微生物至關重要。從四川省攀枝花尾礦堆淤泥浸提液和水樣中篩選獲得2株耐釩菌株，分別命名為PFWT01和PFYN01。通過菌落形態(tài)觀察以及16S rDNA分子鑒定表明，菌株PFWT01為微桿菌Exiguobacterium sp.;菌株PFYN01為芽孢桿菌Bacillus sp.。在V5+濃度為0.1 mg/L條件下，高耐釩微生物PFWT01和PFYN01對釩的去除率分別為84.5%和76.9%。試驗結果表明，2株菌株在釩污染土壤的處理中具有良好的應用前景。

關鍵詞：釩污染;耐釩細菌;形態(tài)觀察;16S rDNA;系統(tǒng)發(fā)育樹;去除率

中圖分類號：S182 ??文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）10-0287-06

收稿日期：2019-05-09

基金項目：國家自然科學基金面上項目（編號：3137070605）;四川省科技計劃（編號：2017SZ0185）;科技部國際科技合作計劃專項（編號：2013DFA21690）。

作者簡介：伏媛（1992—），女，四川成都人，碩士研究生，主要從事礦山環(huán)境生態(tài)治理研究。E-mial：307593291@qq.com.

通信作者：彭書明，博士，副教授，主要從事水土介質(zhì)污染恢復與治理、退化生態(tài)系統(tǒng)恢復與治理研究。E-mial：pengshuming06@cdut.cn. ?隨著經(jīng)濟的發(fā)展，人類活動的日益增強，不可避免地加劇了環(huán)境污染[1]。釩鈦磁鐵礦是含有鐵、釩、鈦、鉻等多種重金屬的共生礦，有很高的綜合利用價值。我國67.56%的釩資源來自釩鈦磁鐵礦[2]。釩的冶煉是環(huán)境中金屬釩污染的重要來源，它作為人體必需的微量元素，具有多方面的生理作用，然而釩同時具有多方面的毒性和危害性[3]。據(jù)報道，釩的毒性作用與金屬釩的價態(tài)、溶解度、攝取的途徑等有關，價態(tài)越高，毒性越大[4]。除明顯的急性中毒外，它還對人體有生殖毒性、胚胎毒性，可能還有致突變、致畸、致癌等毒性[5-6]。

由于微生物對重金屬具有積累和解毒作用，近年來以凈化有毒金屬污染為目的的生物修復技術興起[7]。微生物修復技術因其處理費用低、效率高、對環(huán)境影響小等優(yōu)點，受到廣泛的關注[8-11]。在過去的幾十年里，國內(nèi)外一些研究機構在金屬釩的生物效應及其環(huán)境地球化學行為等方面開展了大量研究工作，并取得了一系列的成果[12-13]。這些研究成果是確定釩的環(huán)境行為以及客觀評價釩的生物可利用性和毒理性不可或缺的基礎數(shù)據(jù)，為人們有效地控制釩污染提供了科學依據(jù)。但有關釩污染生物修復方面的報道并不多見。

四川省攀枝花市巴關河礦區(qū)堆礦渣區(qū)位于攀枝花市西部，該礦區(qū)在開采期間，產(chǎn)生大量粉塵、廢水和廢渣，這些廢棄物中含有大量的釩，可通過揚塵、雨水沖刷等途徑擴散到周圍環(huán)境中，致使毗鄰的水資源、農(nóng)田土壤受到嚴重的重金屬污染。為此，本試驗從四川省攀枝花市巴關河尾礦堆淤泥浸提液和水樣中篩選高耐釩細菌，并結合形態(tài)學特征、生理生化以及分子鑒定等方法，對所篩選到的菌株進行初步鑒定，通過釩去除能力試驗來研究它們對釩的去除效果，以期為礦區(qū)釩污染的生態(tài)修復提供菌種儲備，為耐釩細菌在金屬釩污水處理中的應用提供一定技術支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品采集、主要試劑和培養(yǎng)基

以采自攀枝花市巴關河西渣場堆渣區(qū)旁的池塘水樣和淤泥本試驗樣品。水樣和淤泥樣品采集完后立即密封保存，儲存于實驗室4 ℃冰箱中。LB液體（固體）培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化鈉10 g，加蒸餾水至1 000 mL，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0（配置LB固體培養(yǎng)基時再加一定量的瓊脂粉），于 121 ℃ 下高壓滅菌20 min。在無菌條件下向LB培養(yǎng)基中加入一定體積偏釩酸銨（NH4VO3）母液，配置成含有一定濃度V5+的培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 耐釩菌株的篩選 將培養(yǎng)基的含釩濃度分別設置為5、10、20、30 mmol/L，分別吸取2 mL水樣和淤泥上清液，加入到50 mL上述培養(yǎng)基中，對耐受性菌種進行馴化。將分別混有水樣和淤泥的液體培養(yǎng)基置于30 ℃、120 r/min恒溫搖床上培養(yǎng)4 d后，吸取0.5～2.0 mL培養(yǎng)物在新配制的液體培養(yǎng)基中接種，于30 ℃、120 r/min恒溫搖床上繼續(xù)培養(yǎng)4 d。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時間后，觀察LB固體培養(yǎng)基上菌落出現(xiàn)的形態(tài)特征并做好記錄，用接種環(huán)挑取單菌落，以平板劃線法接種到新的培養(yǎng)平板中，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。多次重復上述步驟直到獲得純培養(yǎng)物為止。

1.2.2 菌株的理化性質(zhì)測定 取對數(shù)生長期的所篩選到的菌種做革蘭氏染色試驗，在生物顯微鏡下觀察細菌形態(tài)學特征。理化性質(zhì)測定的試驗方法借鑒《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[14]。

1.2.3 耐釩菌株的鑒定 以十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取的細菌基因組DNA片段為模板，選用細菌通用引物進行PCR擴增，其中正向引物為27F，反向引物為1492R，它們的序列分別為27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG;1492R：CGGTTACCTTGTTACGACTTC。反應體系：25 μL 2XMix（PCR預混液）;1 μL 27F（正向引物，10 μmol/L）;1 μL 1492R（反向引物，10 μmol/L）;2 μL DNA模板;加雙蒸水（ddH2O）至50 μL。反應步驟：94 ℃預變性5 min; 94 ℃變性30 s，54 ℃退火 30 s，72 ℃延伸90 s，35次循環(huán);72 ℃延伸 10 min。將清潔純化回收后的PCR產(chǎn)物送往北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司進行測序。將測得的16S rDNA序列結果提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，并利用基本局域聯(lián)配搜尋工具（Blastn）將菌種的16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已登錄的序列進行同源性比對，對菌株進行分子鑒定。采用軟件MEGA 7.0構建16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 耐釩菌株在不同釩濃度下的生長情況

從-70 ℃冰箱中取出保藏好的菌株將其活化，將菌株接種于已配置好的滅菌的培養(yǎng)基，于30 ℃、120 r/min恒溫搖床上振蕩培養(yǎng)24 h，作為種子液備用。取一定量的種子液轉(zhuǎn)入盛有100 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL三角錐形瓶中，加入一定量的釩溶液，使培養(yǎng)基中最終釩濃度為20 mg/L，每個處理3個重復，于30 ℃恒溫搖床上振蕩培養(yǎng)（每隔4 h取次樣）0、4、8、12、16、…、56、60 h后取樣，使用紫外分光光度計在波長為600 nm處測定吸光值D600 nm，并記錄。以不加釩為對照。

1.4 攀枝花巴關河西渣場區(qū)采樣樣品釩含量的測定

樣品的pH值測定：配制pH值分別為4.00、686、918的3種不同pH值標準緩沖液，使用pH計測量樣品的pH值。

樣品消解：取水樣2 mL，加入6 mL濃HNO3 10 min 后加入2 mL的過氧化氫溶液，利用高溫高壓消解泵進行消解，將消解后的溶液稀釋到一定倍數(shù)。最后用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS）檢測樣品釩含量。

1.5 耐釩菌株在不同釩濃度下對釩的去除能力

將90 mL液體培養(yǎng)基裝入250 mL培養(yǎng)瓶中，高溫高壓滅菌后冷卻至不燙手時，在超凈工作臺里取經(jīng)過液體培養(yǎng)基過夜活化的菌液200 μL接入到冷卻的培養(yǎng)瓶中，加入10 mL已過濾滅菌的偏釩酸銨溶液母液（釩離子濃度為1、10、100 mg/L），使得培養(yǎng)基釩離子最終濃度分別為0.1、1.0、10.0 mg/L，這些濃度的設置是根據(jù)渣場實地釩含量的大概范圍來設定的。2種菌液各取2 μL，依次加入到濃度為0.1、1.0、10.0 mg/L的液體培養(yǎng)基中，每個濃度做3個重復，用等體積液體培養(yǎng)基不接菌的空白樣作對照。培養(yǎng)8 d后，吸取5 mL菌液于離心管中，在高速冷凍離心機上10 000 r/min條件下離心 10 min，取上層清液，用HNO3和H2O2進行消解，用ICP-MS測定消解液中釩離子含量。按照上述方法進一步檢測菌株在不同釩濃度下的去釩率。菌體對釩的去除率（R）按如下公式計算：

R=（C0-C）/C0×100%。

式中：C0為空白培養(yǎng)液釩濃度，mg/L;C為去釩后培養(yǎng)液釩濃度，mg/L。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016處理試驗數(shù)據(jù)并進行誤差分析;采用Origin 9.0軟件對數(shù)據(jù)進行擬合。

2 結果與分析

2.1 菌落形態(tài)觀察及生長情況

2.1.1 耐釩菌株的篩選 通過采用含釩LB固體和液體培養(yǎng)基進行馴化培養(yǎng)，從水樣和和池塘淤泥中各篩選出1種對釩具有高耐受性的菌株，分別標記為PFWT01和PFYN01。它們能在含釩固體培養(yǎng)基上生長，若繼續(xù)增加培養(yǎng)基含釩濃度，平板不冷凝，2種菌株能在較高濃度的釩固體平板上生長，說明2種菌株具有高耐釩抗釩性能。培養(yǎng)2 d后，2種菌株在固體培養(yǎng)基上的菌落和菌苔出現(xiàn)不同程度的顏色變化（圖1）。在液體培養(yǎng)基中同樣出現(xiàn)變色的現(xiàn)象（圖2）。菌株PFYN01和PFWT01具有降低釩的價態(tài)從而還原釩的能力，在高濃度釩培養(yǎng)基中，菌株PFWT01同菌株PFYN01所觀察到的現(xiàn)象一致，說明菌株PFWT01、PFYN01均具有還原釩的能力。

2.1.2 菌株PFWT01的形態(tài)學特征 在LB培養(yǎng)基上，30 ℃下培養(yǎng)24 h后，菌株PFWT01形成不規(guī)則圓形，表面光滑濕潤，菌落中央稍有凸起，邊緣不整齊，質(zhì)地軟，橙黃色，色素不擴散的菌落（圖3-a）。革蘭氏染色后，在顯微鏡下呈紫色，為革蘭氏陽性。在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，PFWT01為短桿菌，兩端鈍圓（圖3-b）。

2.1.3 菌株PFYN01的形態(tài)學特征 在LB培養(yǎng)基上，30 ℃下培養(yǎng)24 h后，菌株PFYN01形成近似圓形，表面光滑濕潤，邊緣不整齊，質(zhì)地軟，乳白色，色素不擴散的菌落（圖3-c）。革蘭氏染色后，在顯微鏡下呈紫色，為革蘭氏陽性。在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，細胞呈桿狀，兩端鈍圓（圖3-d）。

2.1.4 耐釩菌株的生理生化鑒定 通過對2種菌株生理生化試驗得出，在淀粉水解試驗中，菌株PFWT01、PFYN01都能使淀粉水解;在甲基紅試驗中，菌株PFWT01顯陰性，菌株PFYN01顯陽性;在H2S試驗中，菌株PFWT01能使培養(yǎng)基產(chǎn)生黑色硫化鉛，而菌株PFYN01不能;2種菌株都不能水解明膠和油脂;在糖類發(fā)酵試驗中，菌株PFWT01顯陰性，菌株PFYN01顯陽性（表1）。

2.1.5 耐釩菌株的分子鑒定 經(jīng)北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司測序，獲得2菌株的16S rDNA序列。采用序列局部相似性查詢系統(tǒng)（BLAST）進行序列比對分析，利用生物分析軟件MEGA 7.0構建2株菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，結果（圖4、圖5）表明，菌株PFWT01與Exiguobacterium profundum strain B09的親緣關系較近，同源性為99 %，在進化樹中與微小桿菌在同一類群中，它們的親緣關系最近;菌株PFYN01與Bacillus sp.L25親緣關系較近，同源性為99%。

根據(jù)以上形態(tài)學觀察、16S rDNA序列及系統(tǒng)進化發(fā)育樹分析結果可得出，從攀枝花巴關河西渣場堆渣區(qū)旁池塘水樣中得到的微生物PFWT01可鑒定為微小桿菌Exiguobacterium sp.;從渣場堆渣區(qū)旁池塘淤泥中得到的微生物PFYN01可鑒定為芽孢桿菌Bacillus sp.。

2.2 耐釩菌株在20 mg/L釩濃度下的生長情況

2.2.1 菌株PFWT01的生長曲線測定 由圖6可知，從對數(shù)期一直到生長穩(wěn)定期前期，菌株PFWT01在有釩條件下D600 nm大于無釩條件下。菌株在有釩條件下培養(yǎng)44 h時D600 nm最大。菌株在無釩條件下培養(yǎng)48 h時D600 nm最大。說明一定量的重金屬釩對細菌的生長可能有一定的促進作用的;另外可能是由于5價釩轉(zhuǎn)化為4價釩，引起了菌液顏色變化，使得在有釩條件下菌液D600 nm偏大。

2.2.2 菌株PFYN01的生長曲線測定 從圖7可得出，從對數(shù)期一直到生長穩(wěn)定期開始，菌株PFYN01在有釩條件下D600 nm值大于無釩條件下。菌株在有釩條件下培養(yǎng)36 h時D600 nm最大。菌株在無釩條件下培養(yǎng)42 h時D600 nm最大。說明一定量的重金屬釩對細菌的生長可能有一定的促進作用的;另外可能是由于5價釩轉(zhuǎn)化為4價釩，引起了菌液顏色變化，使得在有釩條件下菌液D600 nm偏大。

2.3 耐釩微生物的釩去除能力

2.3.1 樣品釩含量 水樣的pH值為8.61，呈堿性，這說明前述培養(yǎng)的菌株適合在堿性條件下生長。如表2所示，渣場淤泥處的釩濃度為0.499 mg/L，渣場邊的池塘水釩濃度為0.106 mg/L。

2.3.2 耐釩菌株在不同釩濃度下對釩的去除能力 如圖8所示，在培養(yǎng)液的釩濃度為 0.1 mg/L 時，2種菌株PFWT01 、PFYN01對釩去除率的最高，分別為84.5%、76.9%;隨著培養(yǎng)液中釩濃度的升高，菌株對釩去除率逐漸降低;在培養(yǎng)液的釩濃度為10 mg/L時，2菌株對釩的去除率差異不大，分別為32.8%、31.7%;當培養(yǎng)液中釩離子濃度為10 mg/L時，菌株PFWT01對釩的去除率要比PFYN01低，菌株PFWT01、PFYN01對釩的去除率分別為9.7%、15.0%。

篩選的2種菌株通過間接或直接的氧化作用，在厭氧條件下與乳酸鹽、甲酸鹽和丙酮酸鹽等共同作用，將V5+還原成V4+，并最終形成含V4+的固體沉淀，這與Carpentier等的研究結果[15]一致。

3 討論與結論

本試驗從污染水樣和淤泥中篩選出對釩具有較高抗性的菌株PFWT01和菌株PFYN01，分別對其進行了形態(tài)觀察、16S rDNA測序及系統(tǒng)進化樹分析，確定了菌株PFWT01為微小桿菌，菌株PFYN01為芽孢桿菌。微小桿菌在分解有機污染物，如農(nóng)藥、石油和偶氮染料等，轉(zhuǎn)化重金屬，根際促生，工業(yè)污水處理等領域有很大的應用潛力[16]。研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌通過使Cu、Cd和Pb等以硅酸鹽或氫氧化物形式結合在其細胞表面來吸附重金屬[17]。結合這2種菌在已報道中的研究成果，它們有望用于對土壤和水體的重金屬修復。

2種菌株在培養(yǎng)基釩含量為0.1 mg/L時對釩的去除率最高，達到80%左右，隨著培養(yǎng)基釩濃度的升高，去除率逐漸下降;在釩濃度為1.0 mg/L時，2菌株對釩的去除率無明顯差異，分別為32.8 %、31.7%;在釩離子濃度為10.0 mg/L時，菌株PFWT01、PFYN01對釩的去除率最低，分別為97%、15.0%。試驗結果說明，不同菌株對釩的去除能力有其適應的釩離子濃度范圍，篩選的菌株在釩污染土壤處理中具有良好的應用前景。

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