基于指紋圖譜的歐拉羊肉揮發性風味物質定量分析

陳學敏 朱國茵 羅海玲 余忠祥 羅 潔 張 昊，6

(1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京100083;2.中國農業大學動物科學技術學院，北京100193;3.中國農業大學動物營養學國家重點實驗室，北京100193;4.青海大學畜牧獸醫科學院，西寧810016;5.湖南農業大學食品科學技術學院，長沙410128;6.中國農業大學北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，北京100083)

0 引言

相比于食物的味道和質地，揮發性風味是更能區別肉類食品的重要質量特征［1-2］。肉類食品風味物質的前體主要包括水溶性的氨基酸、還原糖、核糖、硫胺素等小分子物質以及肌間和皮下脂肪［3］。在一定熟制條件下，前者通過美拉德反應或熱降解，后者通過脂肪氧化分解等途徑，產生雜環化合物、醛、酮、酯和酸等揮發性風味物質。羊肉的特征風味成分主要包括支鏈脂肪酸(如4-甲基辛酸、4-乙基辛酸、4-甲基壬酸等致膻類物質［4］)和短鏈脂肪醛(如己醛、辛醛等具有水果和青草氣味特征的物質)［5］。目前，我國已成為世界上綿羊和山羊飼養量、出欄量、羊肉產量最多的國家［6］，肉羊品種繁多，其中灘羊、湖羊和杜泊羊都是優良綿羊品種。灘羊是我國寧夏地區特有的肉裘兼用型地方良種，湖羊在全國主要養羊產區作為肉用羊或作為母羊進行雜交改良，兩者在我國的飼養量均超過百萬只［7-8］。杜泊羊自南非引入我國，其適應性強、生長發育快、生產穩定［9］，國內大部分地區利用羊的生物學特性與地方綿羊品種進行雜交利用［10］。羊的品種及相關遺傳因素對羊肉揮發性風味物質組成具有重要影響［11-12］，因此需對不同品種羊肉揮發性風味物質的組成特點進行研究。

歐拉羊屬藏系綿羊，生活在青藏高原，其羊肉符合消費者對天然、綠色高端羊肉產品的需求。目前對歐拉羊的研究主要集中于營養品質方面［13-14］，缺乏對其特征風味的研究。本文利用頂空固相微萃取(Solid-phase microextraction，SPME)對羊肉風味物質進行吸附，繼而通過氣相色譜質譜聯用法(Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)對這些物質進行定性定量分析，最后采用嗅覺檢測器鑒定呈香化合物，并與國內具有代表性的主要肉用綿羊品種的羊肉揮發性風味成分進行比較，明確歐拉羊肉的特征風味，并建立相應指紋圖譜，以促進歐拉羊肉產品的進一步開發。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從青海省黃南州河南蒙古族自治縣隨機選取自由放牧的10 只歐拉羊，皆為1.5 歲齡羯羊，當地天然草場植被以高寒草甸類為主，植被以線葉嵩草、小嵩草、火絨草、萎陵菜、披堿草、早熟禾、風毛菊等為主。同時選取相同年齡、性別，且自由放牧的灘羊、湖羊、杜泊羊各10 只作為對照。宰前禁食24 h、停水2 h，宰后取背最長肌300 g，裝入自封袋于-18℃保存。

C7-C30 正構烷烴混標，美國Sigma 公司;鄰二氯苯標準品、正己烷(色譜純)，中國百靈威公司;氯化鈉(分析純)，天津市永大化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

手動SPME 進樣器、75 μm 碳分子篩/聚二甲基硅氧烷(CAR/PDMS)萃取頭，美國Supelco 公司;7890B-5977B 型氣質聯用儀、DB-WAX UI 型色譜柱(30 m ×0.250 mm)，美國Agilent 公司;ODP3 型嗅覺檢測器，德國Gerstel 公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

參照文獻［15］的方法并稍作修改，將羊肉自然解凍，除去筋膜并絞碎，取10 g 樣品置于40 mL 頂空瓶中，加入2 g 氯化鈉固體，再加入50 μL 質量濃度為5 ×10-7g/mL 的鄰二氯苯溶液作為內標。封口后在120℃下加熱30 min，冷卻至室溫(20℃)，60℃恒溫水浴，以SPME 進樣器吸附30 min，吸附過程保持密封狀態，吸附完畢后進樣。

1.3.2 GC-MS 分析和呈香物質的鑒定

色譜條件:萃取頭解吸5 min，進樣口溫度250℃，不分流，載氣為氦氣，流速0.8 mL/min。色譜柱采用程序升溫，起始柱溫40℃，保持3 min，以6℃/min 升至230℃，保留3 min。

質譜條件:電離方式EI(70 eV)，離子源溫度230℃，燈絲電流200 μA，檢測電壓350 V，接口溫度240℃，掃描速度1 562 u/s，掃描質量(質荷比)范圍為45 ～350。

嗅辨儀分析:氣相色譜儀流出物在毛細管末端以1∶1的分流比分別流入氫焰離子化檢測器和嗅覺檢測器。在嗅覺檢測器的嗅聞端口由8 名經過培訓的感官評價員進行嗅聞評定實驗，同一相對嗅聞時間內可以同時被4 名及以上人員感覺到時記錄結果，鑒定出呈香化合物。

定性方法:根據Mainlib/NIST/Wiley 7 質譜庫對風味物質進行初步定性(匹配度大于800)，然后計算待測物質的保留指數并與該物質的文獻參考值比較，相差在100 以內則認為定性結果準確。

正構烷烴標品在以上色譜與質譜條件下進樣分析，待測物質的保留指數計算公式為

式中 N——保留時間小于且最接近待測物質的正構烷烴碳數

TX——待測物質的保留時間，min

TY——小于且最接近待測物質的正構烷烴保留時間，min

TZ——大于且最接近待測物質的正構烷烴保留時間，min

定量方法:根據各風味物質峰面積與內標峰面積比計算相對含量，響應因子取1［11，16］。

1.4 數據分析

采用SPSS 軟件進行t 檢驗或單因素方差分析，同時用Dunnett 法進行多重比較，顯著性水平均設為0.05，并對風味物質進行主成分分析。采用Matlab 對風味物質進行系統聚類分析。

2 結果與分析

2.1 定性分析

由表1 可知，歐拉羊肉中共檢測到揮發性風味成分53 種，其中具有氣味活性的成分41 種，占總物質數目77%。湖羊、杜泊羊、灘羊羊肉中分別檢測到24、31、28 種揮發性成分。在檢測到的歐拉羊肉風味成分中，大部分為醛類風味物質，共20 種，它們主要是不飽和脂肪酸的衍生物。已有研究表明，歐拉羊肉的不飽和脂肪酸水平較高［14，17］，為其風味形成提供了良好的物質基礎。與其他3 種羊肉類似，歐拉羊肉揮發性風味物質中具有庚醛、壬醛、己醛等直鏈醛，分別具有油脂、青草味，是構成羊肉揮發性風味的主要物質。在4 種羊肉中均檢測到了由苯丙氨酸通過Strercker 途徑降解形成的苯乙醛［18］，具有蜂蜜甜味，氣味閾值較低。不同之處在于，歐拉羊肉風味物質中含有特征性的癸醛、4-乙基苯甲醛以及更多種單不飽和、多不飽和醛，具體包括(E)-2-己烯醛、(E)-2-庚烯醛、(E，E)-2，4-庚二烯醛、(E，Z)-2，6-壬二烯醛、(E，E)-2，4-辛二烯醛。其中，(E，E)-2，4-庚二烯醛(堅果味)、(E，Z)-2，6-壬二烯醛(黃瓜味)是α-亞麻酸衍生物［19］，這些風味成分的差異主要是由羊脂肪酸組成差異所致。

在檢測到的呈味雜環類化合物中，烷基衍生物大多是脂肪的降解產物，如2-正戊基呋喃、2-乙基吡啶分別是亞油酸［20］和二十碳五烯酸［7］的氧化分解產物，二者分別提供了烤肉味和焦糖味，其中2-乙基吡啶是歐拉羊肉中的特征風味物質。含硫雜環化合物大多是含硫氨基酸參與美拉德反應得到的衍生物，如2-乙酰基吡咯是谷胱甘肽-葡萄糖反應體系的產物［21］，其具有堅果味和面包香。同時，在歐拉羊肉揮發性風味物質中檢測到特征性的苯并噻唑，屬于熟肉的關鍵風味物質之一［22］，主要來源于半胱氨酸和葡萄糖反應體系，氣味閾值較低［23］，對羊肉油脂香味有很大貢獻。此外，區別于湖羊，沒有在歐拉羊肉中發現糠醇這一物質，其具有焦味。

與其他3 種羊不同，在歐拉羊肉揮發性風味物質中檢測到了沉香醇，屬于鏈狀萜烯醇類，具有柑橘味。其他特征性風味物質包括烷烴類的檸檬烯、4-異丙基甲苯和酮類的6-甲基-5-庚烯-2-酮、3-辛烯-2-酮、3，5-辛二烯-2-酮、苯乙酮等。另一方面，沒有在歐拉羊肉中檢測到具有氣味活性的戊醇和2-十一酮，也沒有發現辛酸、己酸等膻味物質。

圖1 展示了4 種羊肉不同種類揮發性風味物質種類數量所占百分比情況。歐拉羊肉揮發性成分中醛類數目占比最高，超過1/3 的物質為醛類，所含雜環類、烷烴類和醇類的數目占比次之，均占15%左右。與其他品種羊肉相比，歐拉羊肉風味中雜環類和酮類物質種類占比相對較高，醇類物質數目占比相對較低，并且沒有發現酸類物質。羊肉風味物質中大多數酸類物質是脂肪酸等前體物質在綿羊體內經過一系列代謝形成的［24］，這些代謝途徑受到細胞色素P450(Cytochrome P450 2A6，CYP2A6)、驅動蛋白樣蛋白KIF12(Kinesin-like protein 12，KIF12)、細胞溶質磺基轉移酶1C1(Sulfotransferase 1C1，SULT1C1)等關鍵酶和蛋白的調控［25］，歐拉羊肉揮發性風味物質中未發現酸類物質可能與其體內相應酶和蛋白的基因表達程度有關。

2.2 定量分析

圖2(圖中* 表示與歐拉羊相比差異顯著，p ＜0.05)顯示了相對含量占比大于5%的4 類風味物質對羊肉整體風味的貢獻。醛類物質在4 種羊肉風味物質中的相對含量均超過50%，在歐拉羊中占62%，在湖羊中最高達72%。與其他羊相比，歐拉羊肉揮發性風味物質組成中雜環類化合物含量占比相對較大，相對含量為10%，烷烴類物質含量占比相對較低，相對含量為20%。由表1 可知，歐拉羊肉中每類化合物含量較高的代表性物質分別為己醛((2 004 ±614)ng/(100 g))、2-正 戊 基 呋 喃((672±164)ng/(100g))、辛醇((251 ±67)ng/(100 g))、苯乙 烯((1 014 ± 264)ng/(100 g))、3-辛 稀-2 酮((72 ±1)ng/(100 g))等，其中己醛是所有揮發性風味物質中含量最高的，它們均有氣味活性。歐拉羊肉揮發性風味物質中(E，E)-2，4-己二烯醛含量顯著高于其他3 種羊，增強了風味中的青草氣味。鄰二甲苯含量顯著低于其他3 種羊，辛醛、苯甲醛、苯乙醛、苯甲醇和1-辛烯-3-醇水平較低，顯著低于杜泊羊和灘羊，這可能與綿羊體內脂肪酸、氨基酸等前體物質的組成有關［26］。

表1 歐拉羊肉及其他品種羊肉揮發性風味組成Tab.1 Identified volatile compounds of Oula lamb meat and other kinds of lamb meat

圖1 4 種羊肉揮發性風味中各類物質種類數量占比Fig.1 Distribution of amount of each volatile compound class in four kinds of lamb meat

圖2 4 種羊肉主要揮發性風味物質種類的相對含量Fig.2 Percentage of main volatile compound classes content in four kinds of lamb meat

2.3 主成分分析和聚類分析

2.3.1 主成分分析

以4 種羊肉揮發性風味物質含量原始數據矩陣進行主成分分析，降維后提取前兩個主成分，累積貢獻率為87.709%，表明信息保留程度較為完整，且可以通過前兩個主成分較好地區分4 種羊肉風味。將旋轉后的成分矩陣投影到二維空間平面圖內，直接觀察樣本點之間的相似關系及分布特點［27］，根據主成分分析原則，樣品點間距離越接近，其揮發性風味組成越相似［28］。由圖3 可知，絕大多數歐拉羊肉樣品區別于其他3 種羊肉樣品單獨聚集在一起，說明在整體風味輪廓上歐拉羊肉與其他品種羊肉存在明顯差異。

圖3 4 種羊肉揮發性風味物質主成分分析Fig.3 PCA loadings plot of volatile compounds of lamb meat

2.3.2 聚類分析

為了進一步觀察4 種羊肉樣品組內和組間的相似程度與差異，并且在建立歐拉羊肉揮發性風味物質指紋圖譜時，排除組內差異較大樣本的干擾，得到更為標準化的信息［29］，因此對4 個品種羊肉揮發性風味物質進行聚類分析。方法上采用組間聯接法，對原始變量采用Z 得分法進行標準化的預處理，以歐氏距離為度量標準，得到聚類譜系圖。根據聚類原則，樣本間歐氏距離越短其相似性越高。由圖4(編號1 ～10、11 ～20、21 ～30、31 ～40 分別表示歐拉羊、湖羊、杜泊羊、灘羊樣本)可知，在歐氏距離小于12 時，10 個湖羊樣本、9 個杜泊羊樣本、10 個灘羊樣本、8 個歐拉羊樣本分別聚為一類，形成4 個組，說明4 種羊肉揮發性風味各自具有一定區別度，這與PCA 分析結果一致。當歐氏距離為10.5 時，前3組，即其他3 種羊肉樣本共同聚為一大類，說明歐拉羊肉揮發性風味物質與其他3 種羊具有一定差異。對于歐拉羊來說，第一大類具有8 個樣本，歐氏距離最大差值為11.5，隨著距離的繼續增大，樣本5 和樣本4 才相繼并入第一大類，說明樣本5 和樣本4與其余樣本之間相似度低，不宜將其納入后續指紋圖譜信息的計算中，以免影響對共有峰識別結果的可信度。

2.4 指紋圖譜構建

根據聚類分析的結果，選取相似性最高的8 個歐拉羊樣本為代表性樣品，根據其GC-MS 定性定量結果和嗅聞識別結果，在色譜峰分析過程中刪除峰面積低于10 000(濃度過低)和保留時間大于35 min 的峰(此類峰一般為高沸點化合物，沒有香氣)［30-31］，以40 種具有氣味活性物質的共有峰建立指紋圖譜。如圖5 所示，大多數風味物質的保留時間集中在5 ～25 min。響應值較高的物質主要是己醛、庚醛、壬醛、辛醛等直鏈脂肪醛及2-正戊基呋喃、苯乙烯等雜環類和烷烴類物質，它們具有油脂味、青草味等令人愉悅的氣味，對歐拉羊肉揮發性風味物質輪廓的構建貢獻很大。此外，一些歐拉羊肉獨有的特征性風味物質，包括具有花香味的苯乙酮、沉香醇，具有柑橘味的4-異丙基甲苯、檸檬烯，具有堅果味的(E，E)-2，4-庚二烯醛、3-辛烯-2-酮以及其他氣味閾值較低的風味物質如苯并噻唑、二甲基三硫醚等，都使歐拉羊揮發性風味物質輪廓更加豐富，共同構成了歐拉羊肉的風味物質指紋圖譜。

圖4 4 種羊肉揮發性風味物質聚類分析Fig.4 Cluster pedigree diagram of volatile compounds of lamb meat

圖5 歐拉羊肉揮發性風味物質指紋圖譜Fig.5 Fingerprint of volatiles of Oula lamb meat

3 結束語

利用SPME-GC-MS 和嗅聞技術對歐拉羊肉揮發性風味物質進行分析，檢測到揮發性物質53 種，同時檢測到湖羊、杜泊羊、灘羊3 種羊肉的揮發性風味物質分別為24、31、28 種，與這3 種羊肉相比，歐拉羊肉揮發性風味中雜環類含量占比高，烷烴類含量占比相對較低，未發現酸類物質。歐拉羊肉特征性風味物質主要包括(E)-2-己烯醛、(E，E)-2，4-庚二烯醛、(E，E)-2，4-辛二烯醛、3-辛烯-2-酮等不飽和醛酮，以及4-異丙基甲苯等烷烴類和苯并噻唑等其他呈味物質，它們共同貢獻了水果香、堅果味、青草味等令人愉悅的氣味。從主成分分析和聚類分析的結果可以看出，歐拉羊肉的整體風味物質輪廓與其他3 種羊有顯著性區別。最終建立了歐拉羊肉揮發性風味物質指紋圖譜，以為后續相關產品的開發提供參考。