綠原酸改性黑蕓豆蛋白抗氧化活性與乳化性能研究

李 楊 閆世長 齊寶坤 張 爽 謝鳳英

(1.東北農業大學食品學院，哈爾濱150030;2.國家大豆工程技術研究中心，哈爾濱150086)

0 引言

黑蕓豆不僅富含蛋白質、多糖、維生素等多種營養成分，還含有皂苷、尿毒酶等獨特成分，具有提高人體自身免疫能力、激活淋巴T 細胞、抑制腫瘤細胞的惡化、促進脫氧核苷酸的合成等功能［1］。黑蕓豆分離蛋白(Black kidney bean protein isolate，BKPI)是一種全價蛋白，含有8 種人體必需氨基酸與豐富的鐵、鈣、碳水化合物及多種微量元素等營養物質，具有很高的藥用價值，是一種新興植物蛋白資源［2］。然而，堿溶酸沉提取方式固有的缺陷致使BKPI 雖有較好的熱穩定性與凝膠特性，但乳化特性較差［3］，限制了其在食品工業中的應用。

研究表明，植物資源中獲得的酚類化合物可以作為金屬離子螯合劑、氫供體、單線態氧猝滅劑或還原劑［4］。在這些酚類化合物中，綠原酸(Chlorogenic acid，CA)是最常見的水溶性多酚，通常可作為調味劑添加到食品中［5］。這些酚類化合物易被氧氣、臭氧或多酚氧化酶氧化成醌，醌可以形成二聚體，或直接通過共價(C—N 或C—S)或氫鍵與蛋白質氨基的側鏈反應［6］。文獻［7］研究表明，酚類化合物可通過共價交聯顯著提高明膠的乳化活性指數和抗氧化活性。因此，酚類化合物可以充當蛋白質的交聯劑，與蛋白質相互作用形成穩定的復合物，這些復合物對變性劑的破壞作用具有一定抗性［8］。

近年來，研究者對蛋白與多酚的復合進行了相關研究。如，文獻［9］研究了綠原酸和凝乳蛋白的互作機制，發現綠原酸可以提高蛋白的抗氧化性;文獻［5］研究發現，低濃度的綠原酸通過介導蛋白質的結構修飾能夠提高氧化誘導的肌原纖維蛋白凝膠特性。文獻［10］研究發現，堿性條件下綠原酸與乳鐵蛋白復合，蛋白的二級結構發生改變，乳化性增強。可見，綠原酸對蛋白結構的修飾可以改善蛋白質的功能特性。這些研究多數聚焦于動物蛋白，對于菜豆蛋白在堿性條件下與多酚作用的研究尚未見報道。

本文選用不同質量濃度CA，在堿性條件下與BKPI 互作以形成CA-BKPI 復合物，通過接枝量與反應基團的變化驗證蛋白與多酚的結合程度，對改性后復合物的結構變化進行研究，揭示結構對乳化性質與抗氧化特性的影響，以期為高乳化性和高抗氧化性CA-BKPI 的開發提供技術支持與理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑蕓豆市售;綠原酸(純度99%以上)，上海源葉生物科技有限公司;福林酚試劑，1，1-二苯基-2-吡咯基肼(1，1-diphenyl-2-pycrylhydrazyl，DPPH)，美國Sigma-Aldrich 公司;L-亮氨酸、鄰苯二甲醛(OPA)、鹽酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、甲醇(均為分析純)，北京新光化工試劑廠;其它試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

AL204 型分析天平，梅勒特-托利多儀器(上海)有限公司;PHS-3C 型實驗室pH 計，中國上海雷磁公司;F-4500 型熒光分光光度計，日本Hitachi 公司;TU-1800 型紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司;JJ-1 型增力電動攪拌器，江蘇金城國勝儀器廠;Allegra64R 型臺式高速冷凍離心機，美國貝克曼公司;IRTracer-100 型傅里葉變換紅外光譜，日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 黑蕓豆分離蛋白的制備

根據文獻［11］的方法，將黑蕓豆去皮磨粉，過60 目篩，用正己烷脫脂，將脫脂豆粉分散于去離子水中，液料比10 mL/g，用2 mol/L NaOH 溶液調節pH 值至9.0，攪拌1 h，9 000 r/min 離心30 min，取其上清液，然后用2 mol/L HCl 溶液調節pH 值至4.5，得到蛋白沉淀物，將蛋白沉淀物水洗3 次，6 500 r/min 離心30 min 得到沉淀物，將沉淀物溶解后，用2 mol/L NaOH 溶液調節pH 值至中性，凍干，即得黑蕓豆分離蛋白，使用凱氏定氮測定蛋白含量，蛋白質量分數為(90.62 ±0.59)%。

1.3.2 蛋白-多酚共價復合物的制備

參照文獻［12］制備共價復合物的方法，稍作修改。將1 g BKPI 粉末溶解于50 mL 去離子水中，調節pH 值至9.0，在4℃下攪拌24 h，以確保完全水合，然后分別將0.05、0.15、0.25 g CA 溶解于50 mL去離子水中并攪拌，將溶液pH 值調節到9.0，避光，與空氣接觸，將蛋白溶液與多酚溶液1∶1等體積混合，將兩種混合溶液室溫(20℃)下連續攪拌反應24 h，并維持pH 值為9.0，加入0.02%疊氮化鈉以防止微生物的生長，然后用3 000 W 的透析袋在4℃下用去離子水透析48 h 以除去未結合的綠原酸，將透析袋中的剩余混合液凍干，得到蛋白-多酚共價復合物，置于干燥器中備用，分別標記為0.05CABKPI、0.15CA-BKPI、0.25CA-BKPI。

1.3.3 多酚接枝量測定

采用福林酚法測定樣品中綠原酸的含量［13］。首先，取1 mL 樣品溶液(1 mg/mL)于試管內，加入5 mL 福林酚試劑(體積分數10%)，旋渦混勻，靜置5 min 后，加入4 mL Na2CO3溶液(0.075 g/mL)，旋渦混勻，置于25℃水浴鍋中振蕩2 h 后，在765 nm波長條件下測定吸光度，并對照綠原酸標準曲線計算樣品中綠原酸的含量。

1.3.4 熒光光譜測定

根據文獻［14］的方法，稍作修改。對BKPI、CA-BKPI 進行三維熒光光譜測定，使用F-4500 型光度計，在連續掃描模式下，發射光譜范圍為200 ～500 nm，激發波長設定為200 ～350 nm，并進行總共16 次掃描，進行光譜分析。

1.3.5 傅里葉變換紅外光譜

用IRTracer-100 型傅里葉變換分光光度計在室溫下記錄BKPI 與CA-BKPI 的紅外光譜。將樣品與KBr 混合，然后壓片。在500 ～4 000 cm-1的范圍內記錄光譜，分辨率為4 cm-1。采用Peakfit 4.0 軟件，高斯曲線擬合方法擬合α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規則卷曲的特征峰［15］，分析其含量。

1.3.6 自由氨基含量測定

根據文獻［16］的方法測定自由氨基含量。配制鄰苯二甲醛(OPA)溶液:準確稱取40 mg OPA 溶解于1 mL 甲醇中，分別加入0.01 g/mL 的SDS(十二烷基硫酸鈉)溶液2.5 mL、0.1 mol/L 的硼砂溶液25 mL、100 μL β-巰基乙醇，最后用蒸餾水定容到50 mL 容量瓶中。測定時，取OPA 溶液4 mL 于試管中，分別加入200 μL 樣品液，混勻后于35℃反應2 min，在340 nm 處測定其吸光度，以在OPA 試劑中加入200 μL 水為空白對照，并用L-亮氨酸制作標準曲線，根據其吸光度分析自由氨基含量。

1.3.7 粒徑分布的測定

利用Mastersizer 2000 型激光粒度儀對BKPI 和CA-BKPI 共價復合物溶液樣品進行粒徑分布測定。顆粒折射率1.45，分散劑折射率1.33，吸收參數0.001。實驗采用體積平均直徑D4，3表征液滴粒度大小［17］。

1.3.8 Zeta 電位測定

采用Zeta 電位儀測定樣品的Zeta 電位，將BKPI 與CA-BKPI 共價復合物進行適度稀釋，上樣體積為1 mL，測定溫度為25℃，溫度平衡時間為2 min［17］。

1.3.9 濁度測定

將待測樣品適當稀釋后(樣品質量濃度為5 mg/mL)倒入石英比色皿中，并利用紫外分光光度計在波長600 nm 處對樣品進行測定，在25℃條件下測量濁度［18］。

1.3.10 乳化活性與乳化穩定性測定

文獻［17］的方法稍作修改。將上述樣品溶液用磷酸鹽緩沖液稀釋(10 mmol/L，pH 值7.0)至蛋白質量濃度為1 mg/mL，將稀釋的樣品以體積比3∶1溶解于葵花油中，使用高剪切均質機以10 000 r/min均質1 min 形成乳狀液，立即從其乳狀液底部提取50 μL 的乳液分散于0.1%的SDS 溶液稀釋100 倍。經旋渦振蕩后用分光光度法在波長500 nm 處測定樣品的吸光度A500nm，用相同濃度SDS 溶液作為空白對照。經10 min 后再次測量其吸光度。乳化活性指數和乳化穩定性指數計算公式為

式中 EAI——乳化活性指數，m2/g

ESI——乳化穩定性指數，min

D——稀釋倍數，取100

θ——油相體積分數，取0.25

L——比色杯厚度，取1 cm

C——蛋白質質量濃度，mg/mL

A0、A10——在0、10 min 乳狀液的吸光度

1.3.11 抗氧化性的測量

根據文獻［19］的方法測量DPPH 自由基清除活性，稍作修改。用乙醇配制0.15 mmol 的DPPH溶液，取1.5 mL 樣品加入到1.5 mL 的DPPH 乙醇溶液中，室溫避光反應60 min，隨后檢測在517 nm處的吸光度，用Trolox 繪制標準曲線，以Trolox 質量摩爾濃度(單位:μmol/g)表明其抗氧化能力。

1.4 數據統計

所有實驗重復3 次，實驗結果采用平均值±標準差表示。利用SPSS 20 軟件進行ANOVA 差異顯著性分析及相關分析，當P ＜0.05 時，差異性顯著。利用Origin 2018 進行制圖。

2 結果與討論

2.1 多酚接枝量與反應基團分析

為表征BKPI 與不同濃度CA 的結合量，通過建立綠原酸標準曲線，用福林酚檢測復合物中CA的接枝量，結果表明，隨著綠原酸含量的增加，與BKPI 結合的多酚質量摩爾濃度分別為(54.6±3.92)nmol/mg、(74.85 ±2.33)nmol/mg、(98.76±2.53)nmol/mg。可以得知，綠原酸添加量為0.25 g/(100 mL)時，接枝量達到最大。綠原酸分子含有3 個醇羥基和2 個酚羥基，在堿性條件下酚羥基可以氧化為醌與氨基酸殘基反應，形成強而穩定的共價鍵(C—N，C—S)，進而使CA 與BKPI 發生緊密結合［6，12］。

由于多酚在pH 值為9.0 和有氧的情況下極易氧化成醌，與蛋白接觸時，可以與蛋白的側鏈氨基酸等親核基團發生反應，形成共價鍵(C—N，C—S)［6，12］。不同質量濃度的CA-BKPI 共價復合物自由氨基含量測定結果表明，蛋白-多酚共階復合物的自由氨基含量顯著低于對照蛋白，BKPI、0.05CABKPI、0.15CA-BKPI、0.25CA-BKPI 自由氨基質量摩爾濃度分別為(0.493 ±0.006)nmol/mg、(0.381±0.005)nmol/mg、(0.317 ±0.005)nmol/mg、(0.251 ±0.003)nmol/mg，相比對照BKPI，自由氨基含量分別減少了22.72%、35.70%、49.09%，表明隨著綠原酸濃度增大，蛋白與綠原酸反應程度增大，共價結合程度增加。文獻［20］研究了豬骨蛋白水解物與蘆丁的共價結合作用，發現蛋白的自由氨基含量減少，且該方法中使用了1% SDS，SDS 可以破壞蛋白多酚之間形成的非共價鍵，因此可知，蛋白-多酚共階復合物中自由氨基殘基含量的減少可能是由于與多酚發生共價結合導致的。

2.2 熒光光譜分析

圖1 為BKPI 與CA-BKPI 三維熒光光譜圖，peak a(λEx= λEm)是瑞利散射峰，peak b(2λEx=λEm)是二階散射峰，peak 1(λEx= 280 nm，λEm=330 nm)主要代表蛋白中酪氨酸殘基和色氨酸殘基的變化［21］，其中λEx和λEm表示激發波長和發射波長。色氨酸熒光強度的改變表征了蛋白的三級結構的改變，蛋白質疏水基團內部主要包裹著色氨酸，當蛋白與多酚形成復合物以后，色氨酸殘基暴露，多酚經堿處理氧化為醌與部分氨基酸殘基反應，進而導致熒光強度降低［17］。如圖1 所示，隨著綠原酸濃度的增加，等高線顯示峰的顏色變淺，且根據peak 1處熒光強度計算得知，與未加綠原酸的對照蛋白相比，0.05CA-BKPI、0.15CA-BKPI、0.25CA-BKPI 的peak 1 處熒光強度分別降低了72.32%、83.46%、92.17%，表示黑蕓豆蛋白的熒光強度隨著綠原酸的加入逐漸降低，黑蕓豆蛋白與綠原酸的結合力逐漸增強。此外，peak 2(λEx=230 nm，λEm=330 nm)主要代表多肽鏈骨架的特征峰［22］，由圖可知，在綠原酸和蛋白結合之后，峰的面積和強度變弱，0.25CABKPI 的熒光強度降低最為明顯，這表明隨著綠原酸的加入，蛋白多肽鏈骨架伸展，當蛋白與多酚形成共價復合物時，綠原酸使蛋白的結構發生改變。

2.3 紅外光譜分析

通過紅外光譜(FTIR)分析來證明蛋白與多酚之間的共價結合，不同樣品的FTIR 光譜如圖2 所示，BKPI 表現出幾個特征峰，3 278.63 cm-1(酰胺A帶，N—H 鍵的拉伸振動和氫鍵的吸收峰)、1 634.31 cm-1(酰胺Ⅰ帶區，C—O 鍵之間的伸縮振動)和1 519.76 cm-1(酰胺Ⅱ帶區，C—N 鍵的拉伸振動、N—H 鍵的彎曲振動)［23］。與對照BKPI 相比，0.05CA-BKPI、0.15CA-BKPI、0.25CA-BKPI 酰胺Ⅰ帶的吸收峰均發生了藍移，分別從1 634.31 cm-1移至1 635.10、1 639.00、1 639.01 cm-1，其中，樣 品0.25CA-BKPI 的酰胺Ⅰ帶變化最為明顯，這表明了多酚與蛋白的復合消耗了蛋白的氨基酸殘基，這與蛋白氨基酸殘基變化的結果一致。

圖1 不同質量濃度CA-BKPI 結合物三維熒光光譜圖Fig.1 Three-dimensional fluorescence spectral analysis of CA-BKPI complexes with different concentrations

圖2 BKPI 與CA-BKPI 復合物的傅里葉變換紅外光譜Fig.2 FTIR spectrum of BKPI and CA-BKPI complexes

BKPI 及CA-BKPI 共價復合物樣品的不同二級結構相對含量如表1 所示，BKPI 含有17.74%的α-螺旋、28.51%的β-轉角、32.79%的β-折疊、20.95%的無規則卷曲，不同濃度的多酚反應體系中蛋白的二級結構均發生顯著變化，隨著多酚的添加，α-螺旋與無規則卷曲相對含量顯著降低，β-轉角相對含量顯著增加，樣品0.25CA-BKPI 二級結果改變最為顯著，相比對照BKPI，α-螺旋與無規則卷曲相對含量分別降低到14.07%、15.67%，β-轉角相對含量增加到37.79%。樣品0.25CABKPI 的熒光強度變化也最為顯著，這與熒光的結果相同，表明多酚與蛋白共價結合可以使蛋白解折疊，使得部分蛋白結構展開［24］。文獻［13］研究了南瓜蛋白和焦性沒食子酸的共價結合，蛋白的二級結構α-螺旋與無規則卷曲相對含量顯著降低。α-螺旋形成和穩定性受蛋白側鏈的分子量和電荷狀態的影響，另外極性基團或帶電基團與氨基酸側鏈的連接對β-轉角結構的形成具有促進作用，因此，從這一方面也證明了CA-BKPI 復合物是共價結合的［25］。

表1 不同質量濃度CA-BKPI 復合物二級結構相對含量Tab.1 Secondary structure of CA-BKPI complexes with different concentrations %

2.4 粒徑電位分析

圖3 為BKPI 和CA-BKPI 共價復合物的粒徑分布，粒徑分布可以體現出體系的穩定性，由圖可知，共價復合物的粒徑主要呈單峰分布，表明所形成的體系較穩定。隨著綠原酸濃度的增加，共價復合物的平均粒徑減小，BKPI、0.05CA-BKPI、0.15CABKPI 、0.25CA-BKPI 的平均粒徑分別為(203.4 ±10.32)nm、(180.8 ±15.92)nm、(155.9 ±4.7)nm、(134.9 ±2.65)nm。文獻［26］研究表明，蛋白與多酚共價復合后可改變蛋白性質，復合物的粒徑更為均一，蛋白與多酚內部連接更加緊密，本研究與其結果一致。

圖3 BKPI 與CA-BKPI 的粒徑分布Fig.3 Particle size distribution of BKPI and CA-BKPI conjugates

蛋白與復合物的電位結果顯示，未加入綠原酸的蛋白電位為低負電性，電位為(-19.5±1.01)mV。隨著綠原酸濃度的增加，共價復合物呈現出帶有較高的負電性，這表明綠原酸中和了蛋白的正電荷，使蛋白共價結合后呈現出較高的負電性，電位分別為(30.7 ± 3.52)mV、(32.3 ± 3.19)mV、(38.7 ±1.74)mV。當綠原酸添加量為0.25 g/(100 mL)時，共價復合物帶有最強的負電荷，其粒子之間的相互斥力也最強，粒徑最小，與粒徑分布結果一致。文獻［17］研究了大豆蛋白與花青素的共價復合，結果表明，共價復合后蛋白的負電性顯著增強，粒徑分布均一。

2.5 濁度分析

濁度通常用于研究蛋白質或水解產物與酚類化合物之間通過共價或非共價相互作用的復雜行為，濁度的增加是蛋白與多酚交聯的重要表現形式［8］。從不同濃度的CA 改性BKPI 溶液的濁度變化結果可知，在600 nm 處測定的BKPI、0.05CA-BKPI、0.15CA-BKPI 、0.25CA-BKPI 的濁度分別為0.07、0.411、0.895、1.138。可以得知，與對照組(BKPI)相比，隨著CA 濃度的增加，濁度顯著增強，表明蛋白和多酚發生交聯作用［27］。文獻［8］報道，濁度的增加是由于酚類化合物的加入和蛋白發生交聯引起的。文獻［28］也表明，CA 可作為一種蛋白質交聯劑，介導蛋白進行共價復合，特別是在較高水平的CA 時。多酚與多肽的巰基或氨基側鏈通過共價C—S 或C—N 鍵形成二聚體或共價綴合物，豬血漿蛋白和CA 之間通過共價相互作用誘導微聚集，從而導致濁度增加。

2.6 乳化活性與乳化穩定性分析

乳化活性指數(EAI)與乳化穩定性指數(ESI)分別反映CA-BKPI 復合物形成油-水界面的能力和形成小液滴的抗應變能力。復合物的乳化性受多種因素的影響，如多酚的結合量、蛋白的柔性等［29］。BKPI 與CA-BKPI 的乳化特性如圖4(圖中不同大、小寫字母分別表示乳化穩定性指數、乳化活性指數差異顯著)所示，隨著CA 濃度的增加，共價復合物的EAI、ESI 顯著增強，由于CA 與BKPI 共價結合，蛋白的二級、三級結構發生改變，疏水氨基酸處的環境發生改變，多肽鏈伸展，使蛋白的親水親油性增強，從而降低了油相與水相之間界面張力，形成更穩定的界面膜，增大復合物的乳化性［6］。當綠原酸添加量為0.25 g/(100 mL)時，復合物的ESI、EAI 與單純蛋白相比分別增加了29.06%，72.88%，這與粒徑電位的研究結果一致，0.25CA-BKPI 具有較強的負電荷和較小的粒徑，從而具有更強的乳化活性與乳化穩定性。然而，其乳化活性較0.15CA-BKPI 時變化差異不顯著，這可能是綠原酸添加量為0.25 g/(100 mL)時，蛋白接枝較多的親水性多酚變得更加親水，進而改變了油水平衡，降低了其乳化活性。結果與文獻［6］研究的一致，蛋白與多酚共價復合可以改變蛋白的結構和表面電荷，從而提高復合物的乳化特性。文獻［28］還表明，當綠原酸的濃度在一定范圍內持續增加時，豬血漿蛋白疏水性降低，豬血漿蛋白的乳化活性變化不明顯，乳化穩定性持續增加。

圖4 BKPI 與CA-BKPI 復合物的乳化活性指數和乳化穩定性指數Fig.4 EAI and ESI of BKPI and CA-BKPI conjugates

2.7 抗氧化性分析

DPPH 廣泛用于評估蛋白質的抗氧化活性。BKPI 的DPPH 自由基清除活性被測定，對照組(BKPI)的DPPH 自由基清除活性為82.57 μmol/g。隨著CA 添加量的增加，BKPI 的DPPH 自由基清除活性顯著增加，分別為95.79、142.43、168.95 μmol/g(P ＜0.05)。DPPH 自由基清除活性的增強表明，酚類化合物的羥基在供給氫和電子中起關鍵作用，導致自由基鏈反應的終止，從而改善食品質量和安全性［30］。因此，結果表明，用CA 改性BKPI 可以通過引入羥基提供電子來改善DPPH 自由基清除活性，從而導致較低程度的氧化。文獻［28］發現豬血漿蛋白中添加綠原酸可以提高蛋白的抗氧化性，與本文的結論相一致。

3 結論

(1)隨著CA 添加量的增加，復合物的多酚接枝量與濁度增加，游離氨基含量減少，表明共價鍵(C—N、C—S)的形成，復合物的電位增強，粒徑分布變得均勻，溶液的穩定性增強。

(2)FTIR 和熒光光譜法分析表明，CA-BKPI 共價復合物中酪氨酸與色氨酸所處的極性微環境發生改變，發色基團逐漸被猝滅，多肽鏈伸展從而改變了蛋白質的構象。CA 會導致BKPI 的α-螺旋與無規則卷曲結構相對含量降低，β-轉角結構相對含量增加。β-轉角的松散結構使蛋白柔性增加，結構更易發生改變和伸展，進而影響BKPI 的界面性質，說明CA 的復合對BKPI 的界面性質及蛋白的二級結構與構象具有不可忽視的影響。

(3)乳化特性和抗氧化特性分析結果表明，隨著CA 濃度的增加，復合物的乳化性增強。所有樣品中，CA 添加量為0.25 g/(100 mL)時，復合物乳化穩定性最佳，乳液最穩定。同時，DPPH 法表明，CA 與BKPI 發生共價作用，復合物的抗氧化性隨CA 添加量的增加而增強。由此可見，CA 的添加可以增強蛋白的抗氧化性。