連翹中雙四氫呋喃木脂素類化學成分及其波譜特征

閻新佳，江園園，溫 靜，李 暢，梁 偉，鄭 威，聶承冬，李文蘭

1哈爾濱商業大學 藥學院；2黑龍江省預防與治療老年病藥物研究重點實驗室 哈爾濱商業大學藥學院，哈爾濱 150076；3哈爾濱醫科大學 藥學院，哈爾濱 150081

連翹(Forsythiasuspensa(Thunb.)Vahl)是我國的傳統中藥，早在《本草圖經》中就有記載，其味苦，性微寒，歸肺、心、小腸經，具有清熱解毒、消腫散結之功效，常用于風熱感冒、溫病初起、溫熱入營、高熱煩渴、熱淋尿閉、癰疽、瘰疬、乳癰、丹毒和腫毒等癥，被譽為“瘡家圣藥”。主要分布于我國山西、陜西、山東、安徽西部、河南等地[1,2]。本課題組曾對連翹的化學成分進行過系統的研究，從中得到了一系列結構新穎且具有抗氧化、抗腫瘤和抗菌藥理活性的化合物[3-6]。本文對連翹的50%乙醇提取物經多種柱色譜分離純化，從中分離得到了7個雙四氫呋喃木脂素類化合物，分別(+)-8-hydroxyepipinoresinol-4-O-β-D-glucopyranoside(1)、(+)-8-Hydroxyepipinoresin-ol-4′-O-β-D-glucopyranoside(2)、(+)-松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷(3)、(+)-表松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷(4)、(+)-表松脂素-4′-O-β-D-葡萄糖苷(5)、(+)-phyllrin(6)和(+)-pinoresinol(7)。

長久以來，對于雙四氫呋喃木脂素類化學成分的相對構型和絕對構型的確認一直是一個難點[7-8]，構型上的微小差別可導致其活性的巨大差異，有文獻報道[4](+)-8-hydroxyepipinoresin-ol-4-O-β-D-glucopyranoside(1)對5種癌細胞(HL60、A549、Hep-3B、Colo-205和KB)具有顯著的細胞毒活性，其活性明顯好于陽性藥5-氟尿嘧啶(5-Fu)，且與紫杉醇活性相當，對人肝癌細胞Hep-3B的細胞毒活性甚至強于紫杉醇(taxol)。雙四氫呋喃木脂素8位有羥基，7位處于e鍵，7′位處于a鍵，且糖處于4位可能是其具有抗腫瘤活性的條件，其余構型均無活性。所以，立體構型的確認是判斷活性化合物的關鍵。13C NMR可以作為確定相對構型和絕對構型的有力工具[9]，本文通過對NMR數據的總結對7個雙四氫呋喃木脂素類化合物的13C NMR和CD特點進行了總結，為該類成分結構確認提供理論依據。

1 儀器和材料

核磁共振波譜儀(Bruker AV 600 NMR spectrometer，TMS 做內標)；紫外光譜儀(SHIMADZU UV1700)；CD光譜儀(Bio-LogicMOS 450)HR-ESI-TOF-MS(Bruker Co.，Karlsruhe，Germany)。高效液相色譜儀(HITACHI，檢測器655 variable wavelenth UV Monitor；Waters，檢測器2489 UV/Visible Detector)；制備色譜柱(YMC ODS-A，5 μm，250×10 mm)；分析色譜柱(YMC ODS-A，5 μm，150×4.6 mm)。柱色譜硅膠(100～200目，200～300目，青島海洋化工廠)；薄層色譜硅膠H(300～400目)；GF254(青島海洋化工廠)；ODS柱色譜填料(60～80 μm,德國Merck)；Sephadex LH-20(北京綠百草)；AB-8大孔吸附樹脂(中國滄州)。

連翹藥材：2009年購于河北安國藥材公司(產地：山西)，經鑒定為Forsythiasuspensa(Thunb.)Vahl的干燥果實。

2 提取與分離

中藥連翹(F.suspensa)的干燥果實8.3 kg，以50%乙醇回流提取3次，每次2 h，合并提取液，濃縮得到的浸膏(出膏率約等于6.51%)依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，減壓回收溶劑得氯仿層40 g、乙酸乙酯層100 g、正丁醇層350 g。

圖1 化合物1～7的化學結構

正丁醇層(350 g)部分以適量水溶解后用大孔吸附樹脂柱色譜分離，依次用純水，體積分數10%、30%、50%和95%的乙醇-水梯度洗脫。其中體積分數20%乙醇部分(40 g)經硅膠柱色譜分離，依次用CH2Cl2-MeOH(體積分數100∶1、50∶1、30∶1、20∶1、10∶1、8∶1、5∶1)進行梯度洗脫，得到流分Fr.1～Fr.7。經過反復Sephadex LH-20柱色譜，硅膠柱色譜，聚酰胺柱色譜并結合半制備液相分離純化得到化合物1～7(圖1)。

3 結構鑒定

化合物1～7的13C NMR數據如表1。

表1 化合物1～7的13C NMR光譜數據(150 MHz，DMSO-d6)

4 討論

連翹中含有大量木脂素類成分，2015版《國家藥典》規定將雙四氫呋喃木脂素成分連翹苷作為連翹質量控制的指標性成分[10]。雙四氫呋喃木脂素類化合物苷元母核結構中共有4個手性碳，但8位和8′位均以cis駢合[11]。故苷元結構中包含3個手性，構型有8種同分異構體[12]。

H-7和H-7′為(R，R)構型時(虛線表示)，該化合物旋光值通常為(+)，在CD譜中，235和280 nm下為(+)的Cotton效應；反之，H-7和H-7′為(S，S)構型時(實線表示)，該化合物旋光值通常為(-)，在CD譜中，235和280 nm下為(-)的Cotton效應。連翹中的化合物的旋光值均為右旋(圖2)。

圖2 雙四氫呋喃木脂素類的Cotton效應

在13C NMR(DMSO-d6)譜中，對于苯環取向(直立或平伏鍵)不同時，C-7/C-7′和C-8/C-8′的化學位移明顯不同，可以作為判斷苯環取向的特征，而且不受苯環上取代基的影響。4(4′)位為羥基時，當苯環處于平伏鍵(虛線)時，對應的C-1位上的δC為132.3左右；直立鍵(實線)對應的δC為129.0左右。當4位羥基被甲氧基取代，1位碳化學位移+1.6；羥基成苷1位碳化學位移+3.0左右[11]。當8或8′位被羥基取代，其對應的1位C的化學位移向高場方向移動(-4.0)(圖3)。當1位和1′位苯環均處在直立鍵時，Cotton效應消失(圖4)[12,13]。

圖3 取代基的不同對C-1、C-1′化學位移值的影響

圖4 當1/1′位為a鍵時無CE

連翹中含有大量四氫呋喃型木脂素，該類化合物遇到酸堿條件容易發生立體異構化(a鍵與e鍵互換)：是由于呋喃環上的氧原子與苯甲基相連，容易開環，重復閉環時發生構型變化[14](圖5)。

圖5 四氫呋喃型木脂素遇到酸堿條件容易發生立體異構化

雙四氫呋喃木脂素結構中手型碳較多，其構型的確定一直以來是個難點問題。本文總結了13C NMR譜和CD譜的相關數據，通過總結發現具有一定的規律，對今后確認連翹中的此類化合物以及其他植物中此類化合物的絕對構型具有借鑒意義。