酸棗葉醇提物對小鼠巨噬細胞M1和M2型極化的影響

董建新，劉曉光，李晨曦，祁雪慧，朱毓永，王 悅，單梅華*

1河北民族師范學院 生物與食品科學學院，承德 067000；2南開大學醫學院，天津 300071

巨噬細胞是免疫系統中重要的組成成員，具有吞噬和抗原提呈等功能。根據不同活化方式及功能，巨噬細胞主要分為M1和M2兩種表型[1]。M1型巨噬細胞又稱經典活化的巨噬細胞，由LPS 等誘導產生，高表達NO和TNF-α，是具有促炎效應的細胞，可發揮免疫監視的作用。M2型巨噬細胞又稱替代活化型巨噬細胞，由IL-4、IL-13和一些細胞因子等誘導產生，高表達Arg-1和CD206，是具有抑炎效應的細胞，在促進血管生成、腫瘤遷移侵襲等方面具有重要作用。近些年研究發現，多種天然藥物可以介導巨噬細胞的M1/M2型極化，從而調控細胞的不同生理反應。

酸棗(ZizyphusjujubaMill.var.spinosa(Bunge)Hu ex H.F.Chow)為鼠李科棗屬木本科植物。酸棗、酸棗仁和酸棗葉等產品都有很高的藥用價值[2]，其中酸棗仁在鎮靜、安神、抗血壓等方面療效顯著，而酸棗葉的研究相對較少。黃酮類化合物具有良好的抗炎、抗腫瘤、抗氧化等功效[3,4]。有文獻報道，酸棗葉醇提物富含蘆丁、槲皮素-3-O-α-L-(鼠李糖)(1→6)β-D-半乳糖等黃酮類物質[5]。本研究探究酸棗葉醇提物對巨噬細胞M1/M2型極化的影響，以期驗證酸棗葉的藥用功效。充分探究酸棗葉的功能及作用機制，將有利于綜合開發利用天然藥物資源，為抗炎、抗腫瘤治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系

小鼠單核巨噬細胞系RAW264.7由南開大學醫學院王悅教授實驗室饋贈，小鼠乳腺癌細胞系4T1購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.1.2 實驗藥物與試劑

酸棗葉采自河北省承德市雙橋區馮營子鎮崔梨溝，酸棗葉醇提物由本校生物資源開發實驗室提取，并用RPMI1640基礎培養基配制為1 g/mL的儲存液。胎牛血清(美國Gibco公司，批號：42F0266K)；RPMI1640培養基(以色列BI公司，批號：01-100-1A)；胰蛋白酶(以色列BI公司，批號：0032018)；青霉素-鏈霉素(以色列BI公司，批號：1831739)；脂多糖LPS(索萊寶，批號：L8880)；IL-4(索萊寶，批號：P00207)；CCK8試劑盒(碧云天，批號：C0042)；第一鏈cDNA合成試劑盒(諾唯贊，批號：R111-01/02)；NO試劑盒(南京建成，批號：A012-1-2)；引物(上海生工)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

小鼠單核巨噬細胞RAW264.7和小鼠乳腺癌細胞4T1均使用添加10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的RPMI1640基礎培養基培養，置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養，取對數生長期的細胞進行后續試驗。

1.2.2 CCK8法檢測酸棗葉醇提物對RAW264.7 M1和M2型細胞的增殖影響

將RAW264.7細胞接種至96孔板，37 ℃ 5% CO2培養。M1型：細胞分為對照組、M1模型組、M1加藥組(濃度分別為1.6、3.2、6.4 mg/mL)，每組設置三個復孔。M1模型組使用LPS處理12 h；加藥組則藥物預處理1 h，再LPS處理12 h。M2型：細胞分為對照組、M2模型組、M2加藥組(濃度分別為1.6和3.2 mg/mL)。M2模型組使用20 ng/mL的IL-4誘導培養48 h；加藥組先用IL-4誘導36 h，再加入藥物共培養12 h。上述分組處理完畢后，移除原培養基，加入含 10% CCK8 溶液的培養基，37 ℃孵育4 h，酶標儀檢測450 nm波長處OD值，并計算不同處理組的細胞活力。實驗重復三次。

細胞存活率=(OD實驗組-OD空白組)/

(OD對照組-OD空白組)×100%

1.2.3 Griess法檢測酸棗葉醇提物對RAW264.7 M1型細胞NO分泌的影響

將RAW264.7細胞以2×105個/孔的密度接種至12孔板，分組處理同“1.2.2”。藥物預處理1 h，LPS作用12 h后，收集細胞上清液，3 000 rpm離心20 min。取上清100 μL，使用Griess試劑盒測定各組NO含量，利用紫外分光光度計測定550 nm波長處的OD值。實驗重復三次。

1.2.4 RT-PCR法檢測酸棗葉醇提物對RAW264.7 M1和M2型細胞因子表達的影響

將RAW264.7細胞接種至12孔板，分組處理方式同“1.2.2”。用Trizol裂解細胞，提取各組細胞總RNA，逆轉錄得到cDNA，再以cDNA為模板進行PCR擴增。擴增產物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，GelRed染色后利用凝膠成像系統觀察，并用ImageJ軟件對電泳條帶進行灰度分析。實驗重復3次。采用β-actin為內參，M1型細胞目的基因為IL-12p40、IL-1β、COX-2，M2型細胞目的基因為Arg1和CD206。引物序列見表1。

1.2.5 細胞劃痕實驗檢測酸棗葉醇提物對4T1細胞遷移能力的影響

1.2.5.1 條件培養基的制備

將RAW264.7細胞以2×105個/孔的密度接種至12孔板，37 ℃ 5% CO2培養。將細胞分為對照組、M2模型組、M2加藥組(濃度分別為1.6和3.2 mg/mL)。對照組細胞僅用完全培養基培養；M2模型組細胞用含20 ng/mL的IL-4的完全培養基培養36 h后，再加入含IL-4的無血清培養基培養12 h；M2加藥組細胞先用IL-4誘導培養36 h后，再加入藥物與含IL4的無血清培養基共培養12 h。收集各組細胞上清，3 000 rpm離心20 min，即可得到四組條件培養基(conditioned medium，CM)。收集的條件培養基可直接用于實驗或保存于-80 ℃。

表1 引物序列和產物長度

1.2.5.2 劃痕實驗

將4T1細胞以2×105個/孔的密度接種至12孔板，37 ℃ 5% CO2培養。待4T1細胞鋪滿后，用吸管尖端在12孔板底部輕劃一條力度和角度一致、粗細均勻的直線，棄除原有培養基，用PBS洗兩次。向各孔中加入添加4%血清的不同組別的條件培養基，置于細胞培養箱中培養。倒置顯微鏡下觀察0和12 h的劃痕距離并拍照，每樣品隨機選取3個視野，計算細胞遷移能力。

1.2.6 RT-PCR法檢測4T1細胞中MMP-2、MMP-9及NF-κBp65的表達變化

將4T1細胞以2×105個/孔的密度接種至12孔板，37 ℃ 5% CO2培養24 h后，向各孔中加入添加4%血清的不同組別的條件培養基繼續培養24 h。收集細胞，提取總RNA進行RT-PCR的檢測。實驗重復3次。采用β-actin為內參，4T1細胞目的基因為MMP-2、MMP-9以及NF-κBp65。

1.2.7 統計學處理

應用 SPSS 19.0 軟件進行統計學處理，顯著性水準P<0.05。

2 結果

2.1 酸棗葉醇提物不影響RAW264.7 M1和M2型細胞的增殖

如圖1顯示，在對照組、LPS誘導的M1模型組以及1.6～6.4 mg/mL濃度酸棗葉醇提物處理組中，RAW264.7細胞存活率無明顯變化(P>0.05)；在對照組、IL-4誘導的M2模型組以及1.6～3.2 mg/mL濃度酸棗葉醇提物處理組中，細胞增殖不受影響(P>0.05)。可見，在上述濃度范圍內，該藥物無細胞毒性。

2.2 酸棗葉醇提物抑制RAW264.7M1型細胞NO的釋放

由圖2可知，與對照組相比，LPS誘導的M1模型組細胞中NO釋放量明顯上升(P<0.05)。與M1模型組相比，酸棗葉醇提物在3.2～6.4 mg/mL濃度范圍內顯著下調NO釋放水平(P<0.05)，而在1.6 mg/mL無統計學意義(P>0.05)。NO釋放量在1.6～6.4 mg/mL酸棗葉醇提物濃度范圍內呈現明顯的濃度依賴性。

表2 引物序列和產物長度

圖1 酸棗葉醇提物對M1、M2型巨噬細胞增殖的影響

2.3 酸棗葉醇提物抑制M1型巨噬細胞極化

采用RT-PCR檢測RAW264.7細胞中M1型細胞因子IL-12p40、IL-1β和COX-2的表達。結果如圖3所示，與對照組相比，LPS誘導的M1模型組顯著上調了上述基因的mRNA表達水平(P<0.05)，不同濃度處理的酸棗葉醇提物則可以抑制IL-12p40、COX-2和IL-1βmRNA表達(P<0.05)。并且IL-12p40和COX-2的表達在1.6～6.4 mg/mL酸棗葉醇提物濃度范圍內存在劑量依賴關系，而IL-1β的表達在最低濃度1.6 mg/mL就被完全抑制。

2.4 酸棗葉醇提物抑制M2型細胞因子表達

RT-PCR檢測RAW264.7細胞中M2型細胞因子Arg1和CD206的mRNA水平。結果表明，與對照組相比，IL-4誘導的M2模型組中標志基因的表達顯著上調(P<0.05)，表示M2型巨噬細胞誘導成功；而加藥組Arg1和CD206的表達均被顯著抑制，且在1.6～3.2 mg/mL濃度范圍內呈現出良好的濃度依賴關系。

圖2 酸棗葉醇提物對RAW264.7細胞中NO釋放的影響

圖3 酸棗葉醇提物對M1型細胞因子IL-12p40、IL-1β和COX-2表達的影響

2.5 酸棗葉醇提物通過M2型巨噬細胞抑制4T1細胞遷移

采用劃痕實驗檢測4T1細胞遷移情況。圖5中，與對照組相比，M2型巨噬細胞上清處理4T1細胞12 h時，劃痕寬度明顯變窄，細胞遷移能力顯著增強(P<0.05)；3.2 mg/mL酸棗葉醇提物處理的M2型巨噬細胞上清則明顯阻礙劃痕的愈合，從而抑制4T1細胞的遷移能力(P<0.05)。

圖5 酸棗葉醇提物通過M2型巨噬細胞對4T1細胞遷移的影響

2.6 酸棗葉醇提物通過M2型巨噬細胞抑制4T1細胞遷移相關基因的表達

RT-PCR檢測遷移相關基因的表達。如圖6所示，與對照組相比，M2 型巨噬細胞上清處理4T1細胞24 h 時，MMP-2和MMP-9和NF-κBp65的mRNA表達量顯著增加(P<0.05)；而各劑量組的酸棗葉醇提物均可通過M2型巨噬細胞顯著下調MMP-2、MMP-9和NF-κBp65mRNA的表達(P<0.05)，且存在劑量依賴關系。

3 討論

巨噬細胞具有較強的吞噬和抗原提呈等免疫功能，可在不同條件下被誘導分化成為M1型和M2型巨噬細胞。LPS可以促進炎癥因子的釋放，同時啟動iNOS 轉錄，釋放 NO，促使巨噬細胞向 M1 型極化[6,7]，從而介導巨噬細胞的炎癥反應[8,9]。本研究發現M1模型組的IL-12p40、IL-1β和COX-2 mRNA表達量與對照組相比大幅度提升，NO分泌量也顯著增多。而M1加藥組在1.6～6.4 mg/mL酸棗葉醇提物濃度范圍內，上述炎癥因子的mRNA表達量和NO含量均呈現出不同程度的下降趨勢，表明酸棗葉醇提物可顯著抑制巨噬細胞的M1型極化。

圖6 酸棗葉醇提物通過M2型巨噬細胞對4T1細胞中MMP-2、MMP-9和NF-κBp65 mRNA表達的影響

巨噬細胞經IL-4、IL-10、腫瘤細胞相關因子等誘導可得到M2型巨噬細胞。其高表達精氨酸酶I(Arg1)、甘露糖受體(mannose receptor，MR/CD206)等細胞因子，可促進組織修復，抑制腫瘤細胞生長轉移等免疫過程[10,11]。本實驗結果表明M2模型組中標志基因Arg1和CD206的表達較對照組顯著提升。而M2加藥組在1.6～3.2 mg/mL酸棗葉醇提物濃度范圍處理時，二者的mRNA表達量均明顯降低，且呈現較好的濃度依賴性。表明該藥物不僅可抑制M1型極化，對M2型的誘導也有較強的抑制作用。

在腫瘤微環境中，M2型巨噬細胞作為其中主要的基質細胞，可以通過分泌多種細胞因子、趨化因子來促進腫瘤細胞的遷移侵襲[12]。有研究表明多種天然藥物可通過逆轉M2型巨噬細胞的極化來抑制腫瘤細胞的遷移[13]。本研究進一步從腫瘤微環境的角度，探究酸棗葉醇提物通過調節巨噬細胞的極性對腫瘤細胞遷移的影響，從而深入闡釋酸棗葉醇提物的藥用功效。M2型巨噬細胞參與腫瘤轉移的途徑之一為：釋放多種基質金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9等，降解細胞外基質，從而促進新生血管的建立，參與腫瘤轉移[14]。MMP-2和MMP-9在維持降解和重塑細胞外基質的動態平衡過程中發揮著重要作用[15]，抑制MMP活性是腫瘤治療的又一新靶點[16]。MMP-2和MMP-9是NF-κB信號通路下游相關蛋白。NF-κB是細胞內重要的核轉錄因子，NF-κBp65 是該家族成員中重要的功能性亞單位[17]。有許多研究報道NF-κB對腫瘤侵襲遷移非常重要，其機制之一為轉錄調控遷移相關基因的表達[18,19]。一些天然化合物如姜黃素和槲皮素，可以靶向 NF-κB的活性來抑制乳腺癌轉移[20]。本研究發現酸棗葉醇提物處理的M2型巨噬細胞上清可明顯阻礙劃痕的愈合，顯著抑制4T1細胞的遷移能力。其機制可能是通過抑制NF-κB信號通路來降低細胞遷移相關基因MMP-2和MMP-9的表達。

綜上所述，酸棗葉醇提物不僅能夠抑制巨噬細胞的M1型極化，具有良好的抗炎活性；還可以抑制M2型細胞因子的表達，調控M2型巨噬細胞極化，并進而通過NF-κB信號通路阻滯4T1乳腺癌細胞的遷移。以上研究可以為酸棗葉作為保健、治療藥物提供可靠依據。