檉柳黃素對3T3-L1脂肪細胞胰島素抵抗的影響及AMPK信號通路的作用機制

伍明江，張德芹，李 盼，石旭柳，劉 璐

1遵義醫藥高等專科學校藥學系，遵義 563006；2天津中醫藥大學 中醫藥研究院，天津 301617；3河北農業大學渤海校區理工學院，黃驊 061100；4北京中醫藥大學東方學院中藥學院，廊坊 065001

胰島素抵抗是2型糖尿病主要的發病機制之一，脂肪細胞作為胰島素敏感的靶細胞之一，在胰島素抵抗和2型糖尿病的發病中起著重要作用。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是細胞內能量代謝重要的一種調節因子，是研究糖尿病及其他代謝相關疾病的核心，其參與機體胰島素敏感性的調節，AMPK的激活能降低血糖、改善糖脂代謝紊亂和減輕胰島素抵抗。

檉柳黃素是槲皮素甲基化代謝產物[1,2]，在番石榴葉[3]、銀杏[4]、艾納香[5]等中藥中具有分布。在我們前期研究中發現，檉柳黃素是槲皮素體內主要的甲基化代謝產物，主要存在于尿液和糞便中[6]。槲皮素具有顯著改善胰島素抵抗作用[7,8]，而檉柳黃素作為槲皮素體內的主要代謝產物，研究其對胰島素抵抗的影響很有必要。據報道，檉柳黃素具有抗炎[9]、抗氧化[10]、抗腫瘤[11]、抗血栓[12]、心肌保護[13]等作用，但檉柳黃素在改善胰島素抵抗及其作用機制的研究尚未見報道，為了闡明槲皮素體內主要甲基化代謝產物檉柳黃素對胰島素抵抗的影響，本實驗擬通過建立3T3-L1脂肪細胞胰島素抵抗模型，觀察檉柳黃素對細胞增殖分化、Glu的攝取和細胞內TG的影響，并進一步探索AMPK信號通路中與糖脂代謝相關基因和蛋白在改善胰島素抵抗中的作用機制。該研究為檉柳黃素在糖脂代謝紊亂性疾病方面的作用及其作用機制探討奠定了一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞株

小鼠3T3-L1脂肪前體細胞，購自于北京醫學科學院基礎醫學研究所。

1.1.2 藥物與試劑

檉柳黃素(天津萬象恒遠科技有限公司，批號20160828)；地塞米松、MTT噻唑藍、羅格列酮、DMSO、油紅O、IBMX(美國Sigma公司，批號分別為D1756、M2128、R2408、V900090、O0625、I5879)；FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒，SYBR Green試劑盒(天根生化科技北京有限公司，批號分別為KR106-02和FP205-02)；DMEM(高糖)(美國HyClone公司，批號SH30022.01)；胎牛血清，胰蛋白酶(美國Gibco公司，批號分別為16000044、25210056)；PS，Trizol Reagent(美國 Invitrogen公司，批號分別為15070066、15596018)；重組人源胰島素(北京索萊寶科技有限公司，批號I8830)；葡萄糖含量測定試劑盒(北京普利萊基因技術有限公司，批號E1010)；甘油三酯含量測定試劑盒(北京諾博萊德科技有限公司，批號0510A17)；Phospho-AMPKα 抗體、Phospho-ACC 抗體、Phospho-PKB 抗體、Fatty Acid Synthase 抗體、β-Actin 抗體(美國CST公司，批號分別為2531S、11818T、4060T、3180T、4970T)；PPARα抗體(美國ABcam公司，批號ab24509)；Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)HRP(美國Affinity公司，批號S0001)；引物合成(上海生物工程技術服務有限公司)。

1.1.3 實驗儀器

OLYMPUS CKX31型倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)；IL-161HI型二氧化碳培養箱(施都凱儀器設備上海有限公司)；ClightCycler480II型實時熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司)；Varioskan Flash型全波長酶標儀(美國Thermo公司)；Nanodrop型超微量分光光度計(美國Thermo公司)；SW-CJ-2D型雙人單面凈化工作臺(蘇州凈化設備有限公司)；JY300C型電泳儀及水平電泳槽(北京市六一儀器廠)；MultiGel-21型多功能冷光熒光影像定量分析系統(臺灣TOPBIO公司)；ImageQuant 350 型熒光化學發光成像儀(美國GE公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 MTT法檢測檉柳黃素對3T3-L1脂肪細胞存活率的影響

待96孔細胞培養板中細胞貼壁生長至覆蓋板底70～80%左右，配制濃度分別為0、0.195、0.390、0.781、1.563、3.125、6.250、12.500、25.000、50.000 μg/mL的待測樣品，棄掉原培養液，加入樣品，置于37 ℃、5%CO2培養箱內繼續培養，48 h后按20 μL/孔加入5×MTT溶液，繼續培養4 h，取出后吸去舊培養液，加入150 μL/孔DMSO，放于酶標儀中，振蕩30 s，測定OD在492 nm處的吸收值。

1.2.2 3T3-L1脂肪細胞油紅O染色鑒定

將培養液換成含有0.5 mmol/L IBMX、1 μmol/L地塞米松和10 μg/mL胰島素的高糖DMEM完全培養液進行誘導分化，培養48 h后，換為含10 μg/mL胰島素的高糖DMEM完全培養液培養，繼續培養48 h后，換為高糖DMEM完全培養液維持培養，培養至第12 天，約90%細胞分化為成熟脂肪細胞，收集，PBS洗3次，加10%中性甲醛固定30 min，油紅O染料室溫下孵育15 min，脫色液(60%異丙醇)洗3次，倒置顯微下觀察細胞分化情況。

1.2.3 3T3-L1脂肪細胞胰島素抵抗模型的建立

3T3-L1脂肪細胞誘導分化成功后，分別在高糖DMEM完全培養液(含1 μmol/L地塞米松)中繼續培養24、48、72 h，按照葡萄糖含量測定試劑盒說明書檢測細胞對葡萄糖攝取情況。

1.2.4 檉柳黃素對細胞Glu攝取量和細胞內TG含量的測定

1.2.4.1 細胞對Glu攝取量測定

誘導成功后，將培養液換成含有1 μmol/L地塞米松的DMEM(高糖)完全培養基孵育24 h，使用含有1 μmol/L地塞米松的DMEM(高糖)完全培養基配制藥物并進行細胞換液，孵育48 h，根據葡萄糖含量測定試劑盒說明書檢測細胞對葡萄糖攝取情況。

1.2.4.2 細胞內TG含量測定[14]

按照“1.2.4.1”操作，根據甘油三酯含量測定試劑盒說明書測定細胞內甘油三酯含量。

1.2.5 qRT-PCR檢測AMPK信號通路相關基因的表達

1.2.5.1 抽提總RNA及cDNA的合成

細胞誘導成功后，在高糖DMEM完全培養液(含1 μmol/L地塞米松)中繼續培養24 h后，使用含有1 μmol/L地塞米松的DMEM(高糖)完全培養液配制藥物，設置正常對照組、模型對照組、羅格列酮組及藥物組，繼續培養48 h后，用Trizol 法抽提細胞中的總RNA，測定總RNA濃度及OD在260 nm和280 nm的比值，按FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒說明進行反轉錄，合成cDNA。

1.2.5.2 引物設計及合成

根據NCBI公布的小鼠基因序列，設計上下游引物，引物序列見表1。

1.2.5.3 qRT-PCR

根據SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)試劑盒說明應用于實時熒光定量PCR儀進行實驗，采用2-△△CT方法計算各基因相對含量，每組實驗重復3次。

1.2.6 檉柳黃素與AMPK信號通路相關蛋白分子對接

結合AMPK信號通路，在PDB數據庫(www.rcsb.org)中搜索相關蛋白，通過Discovery Studio 4.5軟件對靶蛋白進行處理，使用Chembio 3D軟件構建各化合物的三維結構，導入Discovery Studio 4.5軟件。采用不同對接方法(CDOCKER、LibDock、LigandFit)將結晶復合物中小分子配體對接到蛋白結晶中，然后與原結晶復合物中的小分子進行均方根偏差(RMSD)值比較，以此驗證和選擇對接方法。

表1 AMPK信號通路相關基因引物序列

1.2.7 Western blot檢測AMPK信號通路相關蛋白的表達

誘導成功后，在高糖DMEM完全培養液(含1 μmol/L地塞米松)中繼續培養24 h后，使用含有1 μmol/L地塞米松的DMEM(高糖)完全培養液配制藥物，設置正常組、模型組、陽性對照組及藥物組，繼續培養48 h后，收集細胞，去培養液后用預冷的PBS沖洗3遍，加入配好的裂解液，刮下細胞后在EP管中冰上充分裂解30 min，期間渦旋3次。4 ℃下以12 000 rpm離心10 min，用BCA檢測試劑盒測蛋白質濃度，樣品分別加5×緩沖液(稀釋成1×)，渦旋，99 ℃煮10 min，冷卻到室溫后-20 ℃保存。依次進行SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉及抗體孵育、發光及顯影，采用Image J軟件對條帶進行灰度分析，每組實驗重復3次。

1.2.8 數據處理

2 結果

2.1 MTT法檢測檉柳黃素對3T3-L1脂肪細胞存活的影響

隨著藥物濃度的增加，檉柳黃素對細胞生長的抑制作用逐漸增強，通過計算，檉柳黃素IC50為33.79±13.60 μg/mL，結果見表2。

2.2 油紅O染色鑒定

誘導分化前3T3-L1細胞呈不規則梭形成纖維細胞形態，細胞內無脂滴；誘導分化后細胞呈橢圓形、圓形，并分化為成熟脂肪細胞，細胞內脂滴明顯，分布于細胞核周圍，油紅O染色后，脂滴呈紅色，鑒定結果見圖1。

表2 檉柳黃素對3T3-L1脂肪細胞存活的影響

圖1 T3-L1脂肪細胞誘導前(A)和誘導后(B)顯微圖

2.3 3T3-L1脂肪細胞胰島素抵抗模型的建立

3T3-L1脂肪細胞的誘導分化成功后，在地塞米松中孵育48 h，模型組細胞對葡萄糖的攝取較正常對照組顯著降低(P<0.05)；在地塞米松中孵育72 h，模型組細胞對葡萄糖的攝取較正常對照組顯著降低(P<0.01)，表明誘導分化后3T3-L1脂肪細胞在地塞米松中孵育48～72 h后胰島素抵抗模型建立成功，結果見表3。

表3 3T3-L1脂肪細胞胰島素抵抗中的Glu攝取

注：與正常組比較，*P<0.05；**P<0.01。

Note:Compared with normal group,*P<0.05;**P<0.01.

2.4 細胞對Glu的攝取

與模型組比較，檉柳黃素低、高兩個劑量組均對3T3-L1脂肪細胞葡萄糖的攝取顯著增加(P<0.01)，表明檉柳黃素具有促進3T3-L1脂肪細胞對Glu的攝取，結果見表4。

2.5 細胞內TG的含量

與模型組比較，檉柳黃素高劑量組對3T3-L1脂肪細胞內甘油三酯有顯著降低(P<0.05)，表明檉柳黃素具有降低3T3-L1脂肪細胞內TG的作用，結果見表5。

2.6 qRT-PCR檢測AMPK信號通路相關基因的表達

與模型組比較，檉柳黃素顯著提高AMPK基因的表達(P<0.01)，以及顯著降低FAS基因的表達(P<0.05)，結果見表6和圖2。

2.7 檉柳黃素與AMPK信號通路相關蛋白分子對接

檉柳黃素與AMPK、FAS、PPARα和PKB蛋白均具有一定的分子對接結合能力，其中能與FAS蛋白上多個氨基酸殘基靶點結合，主要有范德華力、π鍵、氫鍵等結合鍵，表明檉柳黃素與FAS蛋白對接較好，檉柳黃素與FAS蛋白分子對接模擬圖見圖3。

表4 化合物對3T3-L1脂肪細胞Glu攝取的影響

注：與模型組比較，**P<0.01。

Note:Compared with modell group,**P<0.01.

表5 化合物對3T3-L1脂肪細胞內TG含量的影響

注：與模型組比較，*P<0.05；**P<0.01。

Note:Compared with modell group,*P<0.05;**P<0.01.

表6 3T3-L1脂肪細胞AMPK信號通路相關基因的mRNA相對表達量

注：與模型組比較，*P<0.05；**P<0.01。

Note:Compared with model group,*P<0.05;**P<0.01.

圖2 檉柳黃素對AMPK信號通路相關基因的影響

圖3 檉柳黃素與FAS蛋白分子對接3D(A)和2D(B)模擬圖

圖4 檉柳黃素對AMPK信號通路相關蛋白的影響

2.8 Western blot檢測AMPK信號通路相關蛋白的表達

與模型組比較，檉柳黃素可增加磷酸化AMPK(P-AMPK)、磷酸化ACC(P-ACC)、磷酸化PKB(P-PKB)和PPARα蛋白的表達，可抑制FAS蛋白的表達，但無顯著性差異，結果見圖4、5和表7。

3 結論

檉柳黃素給予劑量增大到25 μg/mL時，細胞存活下降；油紅O染色法鑒定誘導分化前后3T3-L1脂肪細胞發現，細胞誘導分化后出現明顯的紅色脂滴；利用地塞米松孵育48～72 h后，模型細胞對葡萄糖的攝取量(或消耗量)明顯減少(P<0.01)，胰島素抵抗模型建立；藥效學研究考察發現檉柳黃素作用48 h后，細胞對Glu的攝取顯著增加(P<0.01)，細胞內TG含量顯著降低(P<0.05或P<0.01)，說明檉柳黃素具有一定的降糖調脂作用。

表7 3T3-L1前體細胞AMPK信號通路相關蛋白的相對表達量

圖5 檉柳黃素對AMPK信號通路相關蛋白的表達

AMPK是生物能量代謝調節的關鍵分子，是研究糖脂代謝紊亂及其他相關代謝疾病的核心，它表達于各種代謝相關器官中，能被機體各種刺激激活，對機體保持葡萄糖平衡起著重要的調節作用[15]。磷酸化的AMPK能開啟GLUT4的基因表達，而GLUT4數量的增加，促進了細胞對Glu的攝取；ACC和FAS分別是脂肪酸合成的限速酶和合成酶，它們的表達影響著脂肪的含量，AMPK的活化能磷酸化ACC抑制其發揮作用，同時還通過抑制ACC基因的表達限制脂肪酸的合成[16]，激活AMPK導致SREBP-lc基因表達的降低，從而抑制FAS基因的表達，影響TG的生成[17]；Adiponectin能增加骨骼肌細胞脂肪酸氧化和糖吸收，可以激活AMPK，而Leptin參與糖、脂肪及能量代謝的調節，增加能量釋放，抑制脂肪細胞的合成[18]；IRS-1、IRS-2屬于胰島素底物受體，其表達水平的降低可導致胰島素信號轉導障礙進而引發胰島素抵抗[19]；PKB表達的降低，會使胰島素信號傳遞受阻，導致葡萄糖攝取和糖原合成減少[20]；而PPARα的表達，增加脂肪酸氧化，減少細胞內TG的含量。

在進行檉柳黃素對3T3-L1脂肪細胞作用機制探討中，我們選擇AMPK信號通路主要相關基因和蛋白進行研究，這些基因或因子直接或間接影響AMPK的表達，從而影響葡萄糖和脂肪水平。通過檉柳黃素對10個基因進行qRT-PCR的研究，發現檉柳黃素顯著提高AMPK基因的表達(P<0.01)和顯著降低FAS基因的表達(P<0.05)，可見，檉柳黃素影響AMPK信號通路，對FAS基因的表達具有顯著抑制作用，從而影響TG的生成；在進行Western blot研究前，將檉柳黃素與相關蛋白進行分子對接，以此預測化合物與蛋白的結合能力[21,22]，其中檉柳黃素與FAS蛋白結合較好；Western blot檢測結果顯示檉柳黃素均可增加磷酸化AMPK、磷酸化ACC、磷酸化PKB和PPARα蛋白和抑制FAS蛋白的表達，但無顯著性差異。

檉柳黃素作為槲皮素體內的主要代謝產物，在對3T3-L1脂肪細胞胰島素抵抗的改善方面具有與槲皮素相似的作用。上述結果說明，檉柳黃素具有增加3T3-L1脂肪細胞對Glu的攝取和降低細胞內TG含量，其作用機制可能與AMPK信號通路中相關基因和蛋白表達有關，具體機制還需進一步研究。該研究闡明了槲皮素體內代謝產物檉柳黃素具有調節糖脂代謝紊亂的作用，為檉柳黃素降糖調脂方面的研究和開發奠定了基礎。