甘肅各主產區當歸UPLC多成分含量測定及評析

徐小瓊，陳 博，張小波，陳 娟，晉 玲,5*

1甘肅中醫藥大學，蘭州 730000；2甘肅醫學院，平涼 744000；3中國中醫科學院中藥資源中心 道地藥材國家重點實驗室培育基地，北京 100700；4蘭州大學藥學院；5甘肅中醫藥大學中(藏)藥資源研究所，蘭州 73000

當歸為傘形科植物當歸Angelicasinensis(Oliv.)Diels的干燥根，秋季采挖，除去須根和泥沙，捆成小把，晾干。當歸味甘、辛，性溫，歸心、肝、脾經，具有活血、調經、止痛的功效[1,2]。甘肅自古為當歸道地產區，年產量占全國當歸總產量的80%以上，甘肅省作為全國當歸藥材生產大省，80年代初至今，種植面積大幅增加，盲目引種栽培，導致當歸產量供過于求，但藥材質量參差不齊[3-7]。本課題組在甘肅省各縣區實地調查采樣，采樣點達22個，樣品均為栽培品，采用UPLC建立了當歸指標含量測定方法，結合主成分分析方法進行分類分析，并測定其中8個指標成分含量，以期為甘肅省當歸質量控制提供依據。

1 儀器與材料

Waters Acquity UPLC超高效液相色譜儀(美國Waters公司)；CP114型電子分析天平(奧豪斯儀器(上海)有限公司)；101型電熱鼓風干燥箱(北京市永光明醫療器械廠)；Option R7 utra AN超純水系統(英國Elga Lab Waters公司)；KQ 5200DV型數控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；0.22 μm微孔濾膜(上海安譜實驗科技股份有限公司)。

綠原酸(批號：L-007-181112)、阿魏酸(批號：A-002-181216)、洋川芎內酯I(批號：Y-085-181011)、洋川芎內酯H(批號：Y-084-190527)、洋川芎內酯A(批號：Y-083-181011)、阿魏酸松柏酯(批號：A-001-181103)、藁本內酯(批號：G-010-181230)、丁烯基苯酞(批號：D-057-190506)對照品(成都瑞芬思生物科技有限公司，純度均在98%以上)。甲醇色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。22批當歸樣品均為本課題組自采，經甘肅中醫藥大學晉玲教授鑒定均為藥典正品。樣品陰干，打粉過3號篩(50目)備用，具體采樣信息見表1。

表1 當歸藥材樣品信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Waters ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流動相為甲醇(A)-1%乙酸水(B)，梯度洗脫(0～5 min，5%→30% A；5～6.5 min，30%→35% A；6.5～8.5 min，35%→50%A；8.5～14 min，50%→80%A；14～17 min，80% A；17～22 min，80%→100%A；22～27 min，100%→5%A)；流速0.3 mL/min；檢測波長270 nm；柱溫30 ℃；樣品溫度20 ℃，進樣量3 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 混合對照品溶液制備

分別取綠原酸、阿魏酸、洋川芎內酯I、洋川芎內酯H、洋川芎內酯A、阿魏酸松柏酯、藁本內酯、丁烯基苯酞對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL分別含綠原酸0.061 0 mg、阿魏酸0.050 0 mg、洋川芎內酯I 0.040 0 mg、洋川芎內酯H 0.024 0 mg、洋川芎內酯A 0.063 6 mg、阿魏酸松柏酯0.224 mg、藁本內酯2.00 mg、丁烯基苯酞0.032 8 mg的各對照品儲備液。再精密吸取各對照品儲備液各1 mL，置10 mL棕色容量瓶中，以甲醇定容至刻度，作為混合對照品溶液，混標色譜圖見圖1A。

2.2.2 供試品溶液制備

取樣品粉末約5.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入50%甲醇50 mL，稱定重量，超聲提取(60 kHz，250 W)45 min，放冷，稱重并用50%甲醇補足減失的重量，過濾，取續濾液，過0.22 μm微孔濾膜，即得，樣品色譜圖見圖1B。

2.2.3 線性范圍考察

分別精密吸取上述對照品儲備液各1 mL，再逐級稀釋1、10、20、30、40倍，制成5個系列濃度的對照品溶液。分別精密吸取3 μL注入高效液相色譜儀，測定峰面積，以峰面積(Y)對進樣量(X)進行線性回歸，結果見表2。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗

取1號樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件連續進樣6次，測得8個共有峰相對峰面積RSD分別為2.67%、1.91%、1.02%、0.96%、2.91%、1.72%，2.02%、1.32%，表明儀器精密度良好。

圖1 混合對照品(A)和當歸樣品(B)UPLC圖

2.3.2 重復性試驗

取1號樣品6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件進樣測定，測得8個共有峰相對峰面積RSD分別為2.77%、2.58%、2.00%、1.96%、2.91%、2.42%、2.62%、2.02%，表明該方法重復性良好。

2.3.3 穩定性試驗

取1號樣品，按“2.2 2”項下方法制備供試品溶液，于0、2、4、12、48 h按“2.1”項色譜條件進樣測定5次，測得8個共有峰相對峰面積RSD分別為2.81%、2.58%、2.31%、2.00%、2.88%、2.52%，2.69%、2.43%，表明供試品溶液在48 h內穩定性良好。

表2 線性關系考察結果

2.3.4 加樣回收率試驗

取1號樣品6份，每份約5.0 g，精密稱定，分別精密加入綠原酸、阿魏酸、洋川芎內酯I、洋川芎內酯H、洋川芎內酯A、阿魏酸松柏酯、藁本內酯、丁烯基苯酞各對照品適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，供試品溶液均稀釋50倍，按“2.1”項色譜條件進樣測定。計算加樣回收率及RSD%，結果見表3，均符合要求。

表3 加樣回收實驗結果

續表3(Continued Tab.3)

化合物Compound樣品中含量Originalamount(mg)加入量Addedamount(mg)測得量Detectedamount(mg)回收率Recovery(%)平均回收率Averagerecovery(%)RSD(%)洋川芎內酯ISenkyunolideI0.02100.02100.04290.960393.303.000.02100.02100.04400.91430.02100.02100.04430.90260.02100.02100.04380.92240.02100.02100.04380.92240.02100.02100.04260.9736洋川芎內酯HSenkyunolideH0.00430.00410.00841.000094.902.800.00410.00410.00860.92580.00410.00410.00850.95150.00420.00410.00860.93210.00420.00410.00860.93640.00410.00410.00850.9471洋川芎內酯ASenkyunolideA0.00230.00240.00471.008598.602.700.00230.00240.00471.00510.00230.00240.00470.99500.00230.00240.00471.00300.00220.00240.00470.96000.00210.00240.00460.9440阿魏酸松柏酯Coniferylferulate0.02010.02620.04860.919692.702.700.02010.02620.04900.90690.01970.02620.04700.96010.01710.02620.04640.89450.01880.02620.04690.93270.01990.02620.04750.9496藁本內酯Ligustilide0.80480.81391.62900.987598.002.300.78820.81391.63100.96570.79930.81391.64900.95790.80920.81391.60701.02020.80520.81391.63200.98440.80520.81391.64800.9657丁烯基苯酞Butenylphthalide0.01470.01800.03290.989698.002.300.01440.01800.03310.96460.01480.01800.03300.99170.01440.01800.03221.01350.01540.01800.03410.96360.01540.01800.03430.9534

2.4 含量測定

吸取“2.2.1”，“2.2.2”項下混合對照品溶液和22份樣品溶液各3 μL，按“2.1”項色譜條件進樣測定，用外標法計算含量，結果見表4。

表4 含量測定結果

圖2 不同產區樣品8種成分含量箱線圖

2.5 P值分析[8,9]

2.6 當歸指標成分主成分分析(PCA)[10]

用SPSS 19.0軟件對22份不同產區當歸藥材中8個指標成分含量的原始數據進行標準化處理，以主成分的特征值及貢獻率為依據，進行主成分分析，計算相關系數矩陣，主成分特征值、累積貢獻率，并計算主成分綜合得分，對各產區當歸藥材綜合質量進行評價。根據因子分析結果可得主成分特征值見表5，由表5可知，當歸主成分分析中前2個主成分的特征值均大于1，第3個主成分特征值接近1，前3個主成分的連線較陡峭，累積方差貢獻率為75.358%，以因子的方差累計貢獻率達到70%以上作為主成分提取的標準，提取前3個主成分進行分析較為合適，當歸主成分矩陣見表6。

根據表5、6，以X1、X2、X3代表3個主成分，作為22份不同產區當歸8個指標成分所表達的信息，建立當歸質量的評價模型，得出如下線性關系表達式：

X1=0.209H1-0.016H2-0.165H3+0.26H4+0.136H5-0.143H6-0.247H7+0.281H8

X2=-0.109H1+0.458H2+0.401H3+0.244H4-0.073H5-0.25H6+0.078H7+0.094H8

X3=0.425H1+0.334H2-0.191H3+0.119H4-0.598H5+0.525H6+0.159H7+0.176H8

表達式中各變量不是原始變量，而是標準化變量，將上述表達式，與所對應的3個主成分的方差貢獻率結合，得到當歸質量綜合評價函數的表達式X綜合得分=(39.418X1+23.828X2+12.112X3)/75.358，根據以上表達式得到不同產區當歸綜合得分及排序見表7。綜合得分越高，表明當歸質量越好。甘肅省各產區當歸的綜合得分為：定西岷縣>定西漳縣>定西臨洮縣>定西渭源縣>隴南宕昌縣>隴南文縣>隴南禮縣>隴南武都縣>天水清水縣>天水武山縣>臨夏康樂縣>臨夏積石山縣>臨夏臨夏縣>武威古浪縣>甘南卓尼縣>甘南臨潭縣>甘南舟曲縣>甘南迭部縣>武威天柱縣>張掖肅南縣>張掖民樂縣>蘭州永登縣。

表5 主成分特征值

續表6(Continued Tab.6)

化合物Compound主成分1Component1主成分2Component2主成分3Component3洋川芎內酯ASenkyunolideA0.136-0.073-0.598阿魏酸松柏酯Coniferylferulate-0.143-0.250.525藁本內酯Ligustilide-0.2470.0780.159丁烯基苯酞Butenylphthalide0.2810.0940.176

表7 當歸主成分得分及綜合得分排名

3 討論

揮發油是當歸藥材的重要有效成分之一，實驗數據表明藁本內酯含量最高，除此之外還有丁烯基酞內酯、洋川芎內酯、亞丁基苯酞以及當歸酮等[11-12]，Song等[11]研究發現當歸中的揮發油能穩定心肌細胞膜，保護線粒體和溶酸體的正常功能，增強心肌細胞抗缺氧能力，從而減輕缺氧對心肌細胞的損傷程度。Chang等[12]研究發現阿魏酸能抑制膽固醇的合成，降低血脂，還具有一定的抗氧化和自由基清除作用，抑制脂質在血管壁的沉積，從而保護血管內膜不受損傷，阿魏酸、藁本內酯、丁烯基酞酞能增強血漿纖維蛋白的溶解活性，促進血漿纖維蛋白的溶解過程，延長血栓形成時間，發揮明顯的抗血栓作用。故本研究選擇綠原酸、阿魏酸、洋川芎內酯I、洋川芎內酯H、洋川芎內酯A、阿魏酸松柏酯、藁本內酯、丁烯基苯酞作為當歸藥材的指標成分進行研究。

當歸為2015年版《中國藥典》收載品種，藥典以HPLC測定的阿魏酸含量作為當歸藥材的考察指標，專屬性不強，指標成分單一。故本研究采用UPLC技術同時測定當歸藥材中8個指標成分含量，該方法簡便、快捷，重復性好，可以更全面評價當歸藥材質量。在實驗過程中通過全波長掃描(200～500 nm)確定指標成分在270 nm處均有最大吸收，在最大吸收波長測定，提高了檢測的靈敏度。

主成分分析是一種多指標的綜合評價方法，本研究以22份當歸的8個指標成分檢測結果為基礎，采用主成分分析得到了3個主成分因子，主成分分析結果中，定西岷縣當歸藥材的綜合得分最高，且定西市、隴南市、天水市各產地當歸藥材綜合得分排名靠前，蘭州市當歸綜合得分最低。因此，定西市當歸總體質量優于甘肅省其它產區。

為進一步了解不同產地當歸藥材中指標成分含量差異的來源，對當歸樣品多指標成分進行定量分析，并結合1個易于計算和可見的參數P值進行分析，得到綠原酸、洋川芎內酯A、藁本內酯在各個樣品中含量存在較大波動，對當歸藥材的質量有較大影響。