活性氧對宰后牦牛肉成熟過程中腺苷一磷酸活化蛋白激酶通路、糖酵解及肉品質的影響

藏磊,馬紀兵,韓玲,余群力*,宋仁德,石紅梅,孔祥穎

1(甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州，730070)2(青海省玉樹州畜牧獸醫工作站，青海 玉樹，815000) 3(甘肅省甘南州畜牧獸醫工作站，甘肅 甘南，747000)4(青海省海北州畜牧獸醫科學研究所，青海 海北，812200)

動物宰后，血液所攜帶的氧氣供應停止，氧化還原電位下降，細胞色素系統無法運轉[1]，機體喪失了通過電子傳遞鏈產生三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)的能力。糖酵解成為唯一的能量代謝途徑。這一過程與活體肌肉暫時性缺氧條件下發生的反應相似，但宰后這種變化一直延續到肌糖原耗盡或參與糖酵解的酶系失活。糖酵解過程產生的乳酸不會像活體動物那樣被轉運到肝臟中再合成肝糖原或通過血液循環被排除，而是在肌肉細胞內蓄積起來，導致肌肉pH值下降[2]。而pH值的變化速度與幅度會影響肌肉的色澤、嫩度、系水力、蒸煮損失等肉品質指標[3-4]。

腺苷一磷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)是一種重要的 “能量調節器”，由一個催化亞基(α)和2個調節亞基(β和γ亞基)組成的異源三聚體，屬絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它廣泛存在于真核細胞生物中[5]。活化的AMPK通過關閉合成代謝途徑以減少能量消耗，同時開啟分解代謝途徑增加能量產生以維持ATP水平[6-7]。AMPK活性調控信號通路如圖1所示，其中一種激活途徑是通過其上游的蛋白激酶發生磷酸化，進而直接啟動AMPK α 亞單位的蘇氨酸172位，激活細胞中AMPK活性[8]。目前發現2種AMPK上游激酶，即鈣/鈣調素依賴性蛋白激酶激酶β(calcium/calmodulin-dependent protein kinase kinase Beta，CaMKKβ)和肝臟激酶B1(liver kinase B1，LKB1)[9-10]。CaMKKβ對蘇氨酸(Thr)172位的磷酸化不依賴于AMP濃度的升高，而是通過增高Ca2+濃度從而激活AMPK，其調節是通過細胞內Ca2+濃度的升高而啟動[11-12]。低水平的胞內活性氧(reative oxygen species，ROS)現在被認為是維持細胞內穩態和正常生理功能的關鍵信號[13]，有研究報道，活性氧升高后可通過激活鈣釋放激活鈣通道 (Ca2+release-activated Ca2+channel, CRAC)導致細胞內Ca2+離子增多并活化CaMKKβ[14]。

然而牦牛肉宰后成熟過程中，活性氧對CaMKKβ-AMPK信號通路，糖酵解以及肉品質影響的研究報道較少。因此，本文通過H2O2、活性氧清除劑N-乙?；?L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)以及H2O2+ Compound C(AMPK抑制劑)處理牦牛肉作為研究對象，測定牦牛肉成熟過程中AMPK級聯反應相關指標、糖酵解關鍵酶活力、糖酵解產物等指標，初步探索活性氧對牦牛肉宰后成熟過程中AMPK的激活作用以及對宰后肌肉糖酵解及肉品質的影響。

圖1 AMPK活性調控信號通路
Fig.1 The signaling pathway of AMPK activity regulation

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

在甘肅甘南牧區，隨機選取健康無病，生長發育正常，平均年齡3～4歲，體質量(350 ± 20) kg的牦牛6頭，公母各3頭，宰前禁食16～18 h，禁水2 h。屠宰后立即取牦牛胴體中部背最長肌肉樣，置于4 ℃條件下成熟。

牛磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶酶聯免疫分析試劑盒、牛鈣調蛋白依賴性蛋白激酶激酶β酶聯免疫分析試劑盒，上海遠慕生物科技有限公司；丙酮酸激酶測定試劑盒、肌/肝糖原測定試劑盒、乳酸測試盒，南京建成生物工程研究所。Compound C(AMPK抑制劑)、D-甘露糖醇(D-mannitol)、Tris-base、乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸[ethylenebis(oxyethylenenitri)tetraacetic acid]，美國Amresco公司；乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA),二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT), 2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)，美國Sigma公司；H2O2、NAC、NaCl、濃H2SO4，國藥集團化學試劑有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

FA2004B 型電子天平，上海佑科儀器有限公司；TGL-16M 型離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；TU-1810 型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；LRH-250型生化培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；XHF-DY型高速分散器，寧波新芝生物科技股份有限公司；HI99163型便攜式pH計，意大利哈納儀器公司；C-LM4 型數顯式肌肉嫩度儀，上海精密科學儀器有限公司；RF 5301-PC熒光分光光度計，日本島津公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品采集與處理

屠宰后立即取胴體中部背最長肌，剔除脂肪、筋腱及結締組織后，分割為每塊50 g的肉樣，隨機分為4組，第1組注射5 mmol/L H2O2溶液作為產生活性氧組，第2組注射20 mmol/L NAC溶液作為清除活性氧組，第3組注射0.9% NaCl溶液作為對照組，第4組注射5 mmol/L H2O2+ 40 μmol/L Compound C溶液作為抑制AMPK活性組，每組注射量均為肉質量的10%，采用真空包裝，在4 ℃條件下進行宰后成熟。對于0 h的肉樣立即用錫箔紙包裹后，放入液氮中冷凍待測。其余肉樣在成熟時間點6、12、24、48、72、120 h分別進行取樣，并測定AMPK活力等指標，對于不便立即測定的指標，用錫箔紙包裹，液氮迅速冷凍后置于-80 ℃凍藏待測。

1.3.2 ROS水平的測定

參照張玉林[15]和王琳琳[16]的方法并略作修改，將0.5 g肌肉組織放入4.5 mL的Tri-HCl緩沖液(10 mmol/L Tri-HCl，8 g/L NaCl，0.1 mmol/L EDTA-2Na，10 mmol/L 蔗糖，pH 7.4)中剪碎，冰浴勻漿1 min， 3 000×g冷凍離心15 min收集上清，并測定上清蛋白濃度。將上清液與反應緩沖液(10 mmol/L Tri-HCl，8 g/L NaCl，0.1 mmol/L EDTA-2Na，10 mmol/L 蔗糖，10 μmol/L DCFH-DA，pH 7.4)混合，快速放入水浴鍋37 ℃孵育15 min(注意避光操作)，最后用熒光分光光度計立即測定熒光強度值(激發波長488 nm，發射波長525 nm)。

1.3.3 胞漿中Ca2+水平的測定

參考辛國榮等[17]的方法并略作修改，取組織塊于10 mL燒杯中，加入預冷的勻漿介質[pH 7.4, 0.1 mol/L Tris-HCl，1 mmol/L KCl，1 mmol/L EDTA-2Na，0.25 mol/L(蔗糖去離子水配制)],固液比為1∶9(g∶mL),使用高速分散器冰浴、10 000 r/min的條件下制成100 g/L的組織勻漿。

取100 g/L的組織勻漿，在4 ℃、2 000 r/min條件下離心10 min，棄沉淀，取上清液以4 ℃、18 000 r/min離心15 min，沉淀物為線粒體，分離線粒體后的上清液即為胞漿。

采用火焰原子吸收法，取1.5 mL待測液于加蓋試管中加入濃HNO35 mL，置于陰暗處硝化1周，然后用烘箱加熱使HNO3盡量分解蒸發，留存即為樣品。加入10 g/L的氯化鑭至10 mL，混勻待測。

1.3.4 AMPK、CaMKKβ活力的測定

參照楊雅媛等[18]的方法并作修改，取冷凍的組織肉樣約0.5 g剁碎置于離心管中，加入預冷的勻漿液(pH 7.4，0.05 mol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L EGTA，1 mmol/L DTT，50 mmol/L NaF，5 mmol/L焦磷酸鈉，0.25 mol/LD-mannitol)冰浴勻漿(每15 s勻漿1次，間隙20 s，重復3次)。然后在4 ℃、10 000 r/min的條件下冷凍離心5 min，取上清液用于AMPK、CaMKKβ活力的測定。測定方法以及標準曲線制作參照酶聯免疫試劑盒進行。

1.3.5 糖酵解指標的測定

肌糖原、乳酸、丙酮酸激酶等指標通過南京建成生物工程研究所的試劑盒進行測定，具體操作步驟和結果計算參照各試劑盒的說明書進行。

1.3.6 pH值的測定

將便攜式pH計的探針插入肉樣中，使pH計的電極與肌肉組織充分接觸，讀數穩定后記錄，每個肉樣重復測定3次，取平均值。

1.3.7 肉品質指標的測定

蒸煮損失：參考馬秀麗等[19]的方法，將長×寬×高不少于 6 cm × 3 cm × 3 cm 的肉樣，修整去除肉塊表面的脂肪和結締組織，稱重記為Ma，80 ℃恒溫水浴加熱，用數顯溫度計記錄加熱過程中肉塊的中心溫度。當中心溫度達到75 ℃時，恒溫保持5 min后取出冷卻至室溫，再次稱重記為Mb，蒸煮損失計算如公式(1)所示:

(1)

剪切力：將測定完蒸煮損失的肉樣沿肌纖維方向取3個直徑為1.27 cm肉柱，用C-LM4 型數顯式肌肉嫩度儀垂直肌纖維方向剪切肉柱，每組重復3次，取平均值。

1.4 統計分析

試驗結果均采用平均值±標準差表示，數據平行測定3次，所有數據使用SPSS 19.0軟件進行數據分析(多重比較分析采用 Duncan 法，P<0.05)，使用Excel 2016軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 ROS對宰后牦牛肉CaMKKβ-AMPK通路的影響

ROS和Ca2+是公認的細胞重要信使。如圖2所示，宰后H2O2組活性氧水平呈上升趨勢，對照組與NAC組ROS水平呈先下降后上升趨勢，對照組在12 h達到最小值，NAC組在24 h到達最小值；H2O2組活性氧水平在宰后0～12 h顯著高于其他2組，NAC組顯著低于其他2組(P<0.05)。說明H2O2處理提高了宰后肉ROS水平，NAC能夠抑制ROS的產生。3組Ca2+濃度均逐漸升高， H2O2組顯著(P<0.05)高于NAC組，這說明清除活性氧能夠降低胞漿中Ca2+濃度。王琳琳[16]研究的Ca2+介導宰后牦牛肉線粒體凋亡途徑激活機制中也指出，宰后成熟過程中，確實存在Ca2+超載現象。在12 h時，H2O2組Ca2+濃度顯著(P<0.05)高于對照組14.61%，對照組顯著(P<0.05)高于NAC組11.81%，隨后均呈現逐漸下降的趨勢。綜上所述，H2O2處理能夠激活鈣釋放激活鈣通道致使內質網中Ca2+大量釋放至胞漿中。

a-ROS水平；b-Ca2+質量濃度
圖2 宰后背最長肌成熟過程中ROS水平 及胞漿Ca2+質量濃度的變化
Fig.2 Changes of ROS levels and Ca2+concentrations in cytoplasm oflongissimusdorsimuscle during postmortem aging
注：小寫字母不同表示同一時間點不同處理方式間差異顯著 (P<0.05)，小寫字母相同表示同一時間點不同處理方式間 差異不顯著(P>0.05)；不同時間點間差異顯著性未標出(下同)

CaMKKβ作為唯一不依賴于AMP濃度的升高而激活AMPK的蛋白激酶，在AMPK級聯反應中的地位舉足輕重。如圖3所示，在宰后牦牛肉成熟過程中CaMKKβ活力呈現先升高后降低的趨勢，在6 h達到最大值，且3組間差異顯著(P<0.05)，其中，H2O2組為122.43 IU/L，對照組為112.15 IU/L，NAC組為84.39 IU/L。這可能是由于胞漿中Ca2+濃度的升高，從而起到了激活CaMKKβ的作用。廖海含[20]的研究也發現前體脂肪細胞胞內Ca2+激活CaMKKβ-AMPK信號通路以維持前體脂肪細胞因子-1。在成熟6～24 h，3組牦牛肉樣CaMKKβ活力均呈現下降的趨勢。這可能是由于肉成熟過程中細胞內環境變化導致酶空間結構破壞從而酶活力快速下降。綜上，H2O2顯著提高CaMKKβ酶活力，可能對宰后牦牛肉AMPK活性及糖酵解產生影響。

圖3 宰后背最長肌成熟過程中CaMKKβ活力的變化
Fig.3 Changes of CaMKKβ activity oflongissimusdorsimuscle during postmortem aging

AMPK是廣泛存在于真核細胞內高度保守的蛋白激酶下游組件，作為細胞內能量穩態的關鍵感受器和調節器[21-22]，與能量代謝有著密切關聯。宰后牦牛肉成熟過程中AMPK活力變化如圖4所示，成熟0～120 h，3組牦牛肉樣AMPK活力整體呈現降低的趨勢，H2O2組與對照組有所升高，且在12 h時達到最大值，其中，NAC組顯著(P<0.05)低于對照組13.02%，顯著(P<0.05)低于H2O2組16.73%。在12～48 h，處理組與對照組間均顯著(P<0.05)高于NAC組。這說明宰后牦牛肉成熟過程中ROS誘導CaMKKβ的激活，對其下游激酶AMPK具有活化作用。廖海含[20]研究CaMKKβ在心肌纖維化的作用時也指出在小鼠心肌組織中，CaMKKβ缺失后AMPK磷酸化水平顯著降低。H2O2組與對照組牦牛肉在12 h均達到成熟期間最大值，這與楊雅媛等[18]的研究結果相類似。SCHEFFLER等[23]的研究也表明，骨骼肌中AMPK被激活來維持細胞能量的供應。綜上，宰后牦牛肉成熟過程中在活性氧誘導下，上游激酶CaMKKβ通過Ca2+的活化，從而激活下游蛋白激酶AMPK。

圖4 宰后背最長肌成熟過程中AMPK活力的變化
Fig.4 Changes of AMPK activity oflongissimusdorsimuscle during postmortem aging

2.2 ROS對宰后牦牛肉糖酵解的影響

糖酵解是葡萄糖被分解生成丙酮酸的過程，在缺氧的條件下丙酮酸進一步被還原為乳酸。丙酮酸激酶(pyruvate kinase, PK)是該過程的限速酶之一，宰后牦牛肉成熟過程中變化如圖5所示。隨著成熟時間的延長，4組牦牛肉樣PK活力表現出下降趨勢，在成熟12～48 h，H2O2處理組PK活力顯著(P<0.05)高于其他3組，加入抑制劑Compound C組則顯著(P<0.05)低于其他3組。這說明AMPK能夠對PK起到激活作用，加入AMPK抑制劑組能夠明顯抑制PK活力。張一敏等[24]在研究不同部位肉中AMPK差異表達時也發現，AMPK能夠通過磷酸化激活PK。DING等[25]在研究牦牛對海拔高度適應性時指出糖酵解酶活力與高海拔呈正比，這可能與低氧適應下牦牛肉中AMPK活力更強[18， 26]有關。

圖5 宰后背最長肌成熟過程中丙酮酸激酶活性的變化
Fig.5 Changes of PK activity oflongissimusdorsimuscle during postmortem aging

圖6 宰后背最長肌成熟過程中肌糖原的變化
Fig.6 Changes of muscle glycogen oflongissimusdorsimuscle during postmortem aging

肌糖原作為肌肉中重要的儲能物質，在宰后牦牛肉成熟過程中，變化規律如圖6所示，隨著成熟地進行，肌糖原含量呈現逐漸下降的趨勢，在成熟24～48 h，H2O2組顯著(P<0.05)低于NAC組18.89%，34.46%；而清除了活性氧的NAC組和抑制AMPK活性的Compound C組則顯著(P<0.05)高于對照組與H2O2組。這表明在宰后活化的AMPK可以通過加速肌糖原的分解來影響糖酵解，活性氧誘導的CaMKKβ-AMPK通路在這一過程中起到了重要作用。與此相似的是，李澤[27]在研究AMPK對羊肉能量代謝和肉質的影響及其機理時也指出,羊肉AMPK活力高的部位肌糖原代謝速率更快。

乳酸是無氧糖酵解的最終產物，其含量會直接影響到宰后肉的pH變化[28]，繼而對系水力、嫩度等品質產生影響。如圖7所示，宰后0～72 h，4組牦牛肉樣均呈現升高趨勢，且在72 h達到最大值，但4組間差異不顯著(P>0.05)。在6～48 h，H2O2組乳酸含量顯著(P<0.05)高于AMPK抑制劑組。這說明成熟期間AMPK活力的升高，能夠提高宰后牦牛肉糖酵解能力。楊雅媛等[18]的研究認為，當糖酵解底物充足時，糖原的分解不是影響乳酸含量進而改變肉質的關鍵因素，從而解釋了不同肉品質差異。

圖7 宰后背最長肌成熟過程中乳酸的變化
Fig.7 Changes of lactic acid oflongissimusdorsimuscle during postmortem aging

pH值是乳酸含量的直觀反映，乳酸含量越高，pH值越低，如圖8所示，宰后成熟期間，牦牛肉4組肉樣pH值均表現出先降低后有所緩慢升高的現象，H2O2組與其他3組相比，在6～12 h下降更快且在第12 h顯著(P<0.05)低于其他3組；在成熟6～48 h AMPK抑制劑組pH值高于其他3組但差異不顯著(P>0.05)。

圖8 宰后背最長肌成熟過程中pH值的變化
Fig.8 Changes of pH oflongissimusdorsimuscle during postmortem aging

2.3 ROS對宰后牦牛肉品質的影響

剪切力能夠直接反應肉的嫩度，剪切力越大，肌肉嫩度越小。如圖9所示，4組肉樣均呈現先升高后降低的趨勢，H2O2組在第24 h達到最大值8.54 kgf隨后顯著(P<0.05)降低，而其他3組則在第72 h達到最大值。這表明活性氧加快了肌肉的成熟時間，顯著提高了肉的嫩度。張玉林[15]在研究ROS對宰后鵝肉品質的影響時也指出活性氧能夠改善肉的嫩度。張小濤[29]、WANG等[30]認為ROS通過誘導細胞凋亡來降解肌原纖維蛋白從而改善肌肉嫩度，而細胞凋亡途徑中的Bcl-2蛋白家族是通過AMPK磷酸化激活的[22]。在48～120 h, AMPK抑制劑組剪切力顯著(P<0.05)高于對照組，這表明AMPK活力高肉的剪切力越小。高永芳等[31]指出通過AMPK激活劑AICAR處理，顯著改善了宰后牛肉的嫩度。

圖9 宰后背最長肌成熟過程中剪切力的變化
Fig.9 Changes of shear force oflongissimusdorsimuscle during postmortem aging

保水性與肉的嫩度，風味，營養等品質有著直接關系，其中蒸煮損失是衡量保水性的主要指標。宰后牦牛肉成熟過程中蒸煮損失的變化如圖10所示，4組肉樣均呈現先升高后降低的趨勢，在第48 h達到最大值。其中清除活性氧的NAC組顯著(P<0.05)低于其他3組，保水性最好。這與張玉林研究鵝肉品質的結果相一致，認為ROS能夠通過改變肌原纖維蛋白二級結構來影響保水性[15]。在成熟6～24 h，AMPK抑制劑組則低于H2O2組，這可能是因為AMPK活性被抑制，糖酵解過程產生的乳酸含量低于H2O2組，pH值遠離蛋白質等電點，保水性好。張一敏等[24]的研究也指出，AMPK能夠通過調節糖酵解進程而影響牛肉的保水性等品質。

圖10 宰后背最長肌成熟過程中蒸煮損失的變化
Fig.10 Changes of cooking loss oflongissimusdorsimuscle during postmortem aging

3 結論

在宰后牦牛肉成熟過程中，通過H2O2處理，產生ROS誘導鈣泵中Ca2+釋放，導致胞漿中Ca2+濃度升高，從而激活了CaMKKβ-AMPK通路，致使活化的AMPK磷酸化糖酵解過程中的關鍵酶，如丙酮酸激酶，繼而加速肌糖原降解，乳酸積累及pH值下降，促進宰后肌肉糖酵解代謝，同時，ROS能夠通過AMPK途徑提高肉的嫩度，清除活性氧能夠顯著(P<0.05)提高肉的保水性。AMPK活力高能夠加速糖酵解過程致使肉的保水性下降。因此，宰后肉成熟過程中能夠通過調控AMPK級聯反應及糖酵解過程來改善肉的品質。