探究鈷卟啉模擬結腸發酵對腸道菌群的調控

馮瀟，包璇，向沙沙，沈宇標，應軒宇，應劍，紀偉，朱炫*

1(浙江工商大學 食品與生物工程學院，浙江 杭州，310000)2(浙江清華長三角研究院，浙江 嘉興，314000) 3(中糧營養健康研究院有限公司，北京，100000)

鈷卟啉(又稱鈷胺素、VB12)是唯一一種含有金屬元素的維生素。鈷卟啉的核心為中心咕啉環(圖1)，由4個相連的吡咯和螯合在中心的3價鈷離子構成。環上方的Coβ配基不同則會形成不同形式的鈷卟啉，例如,和鈷離子相連的是—CN，則稱為氰鈷胺，—CH3則為甲鈷胺。

圖1 鈷卟啉的結構圖
Fig.1 The structure of vitamin B12

鈷卟啉是唯一一種需要腸道分泌物(內源因子)幫助才能被吸收的維生素。因此腸道健康對鈷卟啉的代謝利用非常重要。氰鈷胺是鈷卟啉中口服吸收最快的化合物，但不能被機體直接利用，需要在體內經過轉化生成甲鈷胺和腺苷鈷胺后方可起效。與氰鈷胺相比，甲鈷胺能夠較好地分布到神經組織，因此在治療周圍神經病變方面，甲鈷胺臨床應用的安全性及療效均優于氰鈷胺；而氰鈷胺的主要適應癥為巨幼紅細胞性貧血。

許多研究認為，鈷卟啉之所以能調節腸道微生態，是因為鈷卟啉是原核生物和藻類生長的限制性因子[1]。大多數微生物體內存在不可替代的鈷卟啉依賴通路，卻缺乏合成鈷卟啉的基因。由于外界環境中可獲得的鈷卟啉水平有限，因此鈷卟啉的攝入影響腸道菌群的生長及代謝。在腸道細菌從環境中獲得鈷卟啉的過程中，Btu家族蛋白具有核心作用[2]，其不同的家族成員負責不同結構鈷卟啉的轉運[3]。BERTRAND等[4]發現在低VB12的環境中，VB12轉運蛋白的表達量會上升以便攝取更多VB12。由于不同腸道菌群之間對VB12存在競爭，很可能改變菌群的組成和功能表達的變化[5]。例如，鈷卟啉刺激腸出血性大腸桿菌的Stx2基因表達，從而促進志賀毒素的產生[6]。

體外模擬結腸發酵模型是一種體外微生物培養體系，可以模擬人體腸道菌群的生長和代謝，適用于研究人體腸道微生態和食品微生物消化。該模型尤其適用于考察食品中的營養素與腸道微環境的相互作用。ALEXANDRA等[7]在體外單相連續發酵模型中接種固定化的兒童糞便菌群，結果發現鐵缺乏會削弱微生物群的屏障作用，對腸道健康產生負面影響。BOTHE等[8]利用計算機控制的大腸近端模型TIM-2系統評估了不同劑量乳果糖的益生作用，結果發現每天攝入5 g乳果糖，連續5 d后，能提高腸道中雙歧桿菌屬和乳酸菌豐度，增加丁酸和乳酸的含量。

本研究的目的，是在現有體外結腸發酵模型的基礎上，優化培養基和發酵氣體環境；開發電子鼻快速檢測方法判定腸道菌群的穩定性，從而建立可用于體外快速評價的多相連續結腸發酵模型。利用優化的系統，探討甲鈷胺和氰鈷胺這2種不同結構的鈷卟啉對腸道微生態的調控作用，考察對腸道菌群及其代謝產物的影響，為開發預防腸道疾病和治療腸病的藥物及功能性食品提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PBS緩沖液、蛋白胨、酵母提取物、胰蛋白胨、L-半胱氨酸鹽酸、豬膽鹽、3號膽鹽、血紅素、果膠、淀粉、葡萄糖、黏液素、NaCl、KCl、NaHCO3、K2HPO4、KH2PO4、MgCl2·6H2O、CaCl2·6H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、MnCl2·4H2O、七水硫酸鈷、ZnSO4·7H2O、六水氯化鎳、CuSO4·5H2O、N2(純度≥99.999%)、 CO2(純度≥99.999%)、甲鈷胺、氰鈷胺、DP320 TIANGEN細菌基因組提取試劑盒，TIANGEN公司。

1.2 儀器與設備

CP413電子精密天平,上海奧豪斯儀器有限公司；AW400SG/TG厭氧工作站,英國Electrotek公司；TGL-16臺式高速冷凍離心機,湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；CHA-S恒溫振蕩培養箱，常州國華電器有限公司；NanoDrop ND2000超微量分光光度計,Gene Company Limited；合作設計四聯玻璃發酵罐上海百倫生物科技有限公司；DK.8D恒溫水浴鍋,上海精宏實驗設備有限公司；電子鼻由實驗室自主研發。

1.3 實驗方法

1.3.1 發酵裝置的優化

1.3.1.1 實驗對象與樣品采集

選擇5名健康青年的糞便5 g，混合后在厭氧工作站中將糞便溶解于200 mL的PBS緩沖液， 600 r/min離心1 min，得到糞便細菌提取液。

1.3.1.2 正交實驗探究靜態發酵最佳培養基成分

對無機鹽、膽鹽、果膠、淀粉、葡萄糖、胰酶、黏液素這7個因素設計正交實驗，共得到8種培養基，如表1所示。

表1 正交實驗設計Table 1 Orthogonal experimental design

其中，簡單無機鹽配方(g/L)：NaCl 0.1、K2HPO40.04、KH2PO40.04、MgSO4·7H2O 0.01、CaCl2·6H2O 0.01、NaHCO32.0;復雜無機鹽配方(g/L)：NaCl 4.5、KCl 2.5、KH2PO40.4、MgCl2·6H2O 4.5、CaCl2·6H2O 0.2、MgSO4·7H2O 3.0、FeSO4·7H2O 0.1、CaCl2·2H2O 0.1、MnCl2·4H2O 0.32、七水硫酸鈷0.18、CuSO4·5H2O 0.01、ZnSO4·7H2O 0.18、六水氯化鎳0.092;不變的基礎成分(g/L)：蛋白胨 3.0、酵母提取物4.5、胰蛋白胨3.0、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.8、膽鹽0.4、血紅素0.05。

配制8種培養基各200 mL，接種10 mL的糞便菌，通N25 min后密封， 37 ℃恒溫振蕩培養48 h，每24 h取樣并測定OD600吸光值。取發酵樣液后用DP320 TIANGEN細菌基因組提取試劑盒提取細菌DNA并送至聯川生物公司進行16S rRNA測序分析[9]。

1.3.1.3 體外發酵氣體環境

搭建5組體外模擬單相發酵系統，初始培養基為300 mL，接種15 mL的糞便菌懸液后，先進行24 h的靜態發酵以穩定菌群。24 h后設置流速為12.5 mL/h，37 ℃、pH 6.8恒溫發酵7 d。5個發酵罐內分別通100%N2(純度≥99.999%)、80% N2和20% CO2(純度≥99.999%)混合氣、50%N2和50% CO2混合氣、20%N2和80% CO2混合氣、100% CO2以保持發酵罐內的厭氧環境。每天收集發酵液樣品提取DNA和做16S rRNA測序分析[9]。

取發酵液樣品15 mL裝于250 mL的錐形瓶中，保鮮膜封口，40 ℃水浴5 min。電子鼻實驗參數：清洗時間120 s，測定時間75 s，洗滌氣體為標準空氣。由SmartNose軟件每秒采樣10次，測量結束后保存各個傳感器的數據。

1.3.2 基于優化的模型探究兩種鈷卟啉對腸道菌群的調控作用

1.3.2.1 體外模擬發酵過程

搭建3組單相發酵系統，培養基900 mL接種90 mL的糞便菌。通過每日電子鼻測定，判斷發酵進入穩定期后，將大發酵罐中900 mL發酵液均勻分裝到a、b、c 3個小發酵罐中，在b和c中分別添加甲鈷胺和氰鈷胺使質量濃度達到1.25 mg/L。a、b、c分別為對照組(CON)、甲鈷胺組(MECBL)和氰鈷胺組(CNCBL)，進行7 d的連續發酵。攪拌轉子轉速為120 r/min，溫度37 ℃， pH 6.8，每日早、中、晚對每個發酵罐通5 min N2保持厭氧。每天收集發酵液樣品，提取DNA和16S rRNA測序分析[9]。

1.3.2.2 氣質聯用測定短鏈脂肪酸

取一定量的發酵液樣品8 000 r/min離心2min，取上清液再經0.45 μm的濾膜過濾。預處理和色譜條件參照文獻[10]，其中檢測器為電噴霧離子源,離子源溫度350 ℃。

1.3.2.3 酶活力的測定

取一定量的樣品搖床120 r/min振搖30 min，4 000 r/min 離心5 min，收集上清液即為酶液[11]。采用DNS比色法測定纖維素酶活力[12]，采用福林-酚試劑法測蛋白酶活力，碘-淀粉比色法測淀粉酶活力[13]。

1.3.3 數據分析

將16S rRNA測序后得到的數據，利用SPSS Statistics 20軟件對16S rDNA測序結果所有類群的相對豐度和多樣性指數進行數據前處理。將菌屬、菌門豐度表用SPSS計算出Z值，并導入MeV4.9.0創建熱圖。用SPSS計算出菌屬之間的Spearman相關性，后導入Cytoscape軟件繪制相關性網絡圖。將菌屬豐度表和短鏈脂肪酸(short chain fatty acid, SCFA)質量濃度表導入Canoco_2249軟件進行典型相關分析并繪圖。利用Origin 8.5將菌屬和菌門豐度表繪制成柱狀圖。選擇Chao1指數和Shannon指數導入Origin 8.5繪制箱線圖表現α-多樣性。利用Galaxy網站在線對OTU表的基因功能進行PICRUSt預測。

2 結果與分析

2.1 發酵裝置的優化

2.1.1 最優靜態發酵培養基

結果表明，經過48 h發酵后，7號培養基的菌門結構與糞便原樣最為相近，變形菌門(Proteobacteria)相對豐度很大，其他菌門豐度很小(圖2)。

m1～m8-1號～8號培養基的菌門結構；feces-糞便 原樣的菌門結構
圖2 菌門層面熱圖和聚類分析
Fig.2 Heatmap and Hierarchical clustering

在菌屬層面經過熱圖聚類發現(圖3)，菌屬結構與糞便原樣最為接近的是4號培養基，兩者的菌群結構中，埃希氏屬(Escherichia)所占的豐度最高，乳桿菌屬(Lactobacillus)次之。7號和4號培養基的具體組成成分見方法1.3.1.2。

m1～m8-1號～8號培養基的菌屬結構；feces-糞便 原樣的菌屬結構
圖3 菌屬層面熱圖和聚類分析
Fig.3 Heatmap and Hierarchical clustering

此外，根據在OD600下測得的吸光度值，細菌生長速度最快且沒有出現衰退的培養基是8號培養基(圖4)。

圖4 各組在發酵24 h和48 h的菌群相對生長速度
Fig.4 The relative growth rate of bacteria after 24 h and 48 h fermentation in each group

2.1.2 最優發酵氣體環境

對5組不同氣體環境的發酵樣品的菌群結構進行熱圖聚類分析(圖5)。C20、C50、C80組都聚為一類， C100和N100聚為一類，但組間代表菌豐度的色塊相差不大?？傮w上，氣體環境對模擬系統內的菌群影響很小。

C100、C80、C50、C20分別表示CO2體積分數為100%、80%、 50%、20%，剩余體積分數為N2的實驗組，N100表示 100%N2的對照組
圖5 菌屬層面的熱圖和聚類分析
Fig.5 Heatmap and hierarchical clustering

2.1.3 微生物檢測方法的優化

將電子鼻各個傳感器數據與16S rRNA測序的菌門豐度數據分別進行熱圖聚類分析，再將這2種方法的聚類結果進行比較。由附件1(kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20200317.2015.011.html)可知，2種方法的聚類結果基本一致。

在電子鼻和菌門數據之間建立矩陣，在所有樣品數據中隨機選擇40組導入，以傳感器1為例，建立回歸模型為y=5.047Firmicutes-0.057Bacteroidetes-0.066Actino-bacteria+0.043Fusobacteria+61.727+0.183Bacteria(R2=0.836)，該回歸模型預測率高達70.0%。由于電子鼻具有準確的定性與定量能力，且測定速度快，操作方便經濟，因此將其作為快速判定不同時間點發酵罐內的菌群結構是否相似的標志，即發酵罐是否進入穩定期的標志。

2.2 鈷卟啉對菌群結構和代謝的影響

2.2.1 菌群結構差異和Alpha多樣性

選取對照組、氰鈷胺組、甲鈷胺組第4天、第7天的樣品16S rRNA測序結果進行微生物譜圖分析，16S rRNA測序結果為352 403 reads，平均樣本深度為19 577.9 reads，標準差為9 002.1 reads。經97%的相似度聚類，共得到了2 422個OTU。

如圖6所示，在體外模擬結腸發酵體系中加入甲鈷胺后，微生物的物種多樣性較其他2組都顯著下降。在物種均勻性方面，甲鈷胺和氰鈷胺Shannon指數都顯著下降，說明結腸不同種類的微生物均勻性下降。這些結果表明鈷卟啉對腸道菌群具有選擇性作用。血紅素含有1個卟啉環結構，具有同樣的效果[14]。

a-3組微生物多樣性指標Chao1值;b-3組微生物多樣性 指標Shannon值
圖6 對照組、甲鈷胺組和氰鈷胺組的alpha多樣性指數
Fig.6 Alpha diversity of CON, MECBL and CNCBL
注：*代表P<0.05，**代表P<0.001，***代表P<0.000 1

當持續7 d分別加入2種鈷卟啉后，不動桿菌屬占比都顯著上升，而擬桿菌屬、腸桿菌科某屬、瘤胃球菌科某屬等占比均有顯著下降(圖7)，梭菌屬(ClostridiumXIVa)、大腸埃希氏菌(Escherichia)占比發生了相對較小的下降。大腸埃希氏菌的減少可能是因為在鈷卟啉高濃度情況下，其btuB的VB12核糖體開關與VB12的結合呈關閉狀態，從而截斷下游基因表達[15]。

由LEfSe分析發現氰鈷胺提高了梭菌科(Fusobacteriaceae)、瘤胃球菌、Brevundimonas等細菌的相對豐度，而甲鈷胺促進了Clostridiumsensustricto、Clostridiaceae1、Clostridiale-IncertaeSedisⅪ等細菌的相對豐度(附件2， kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20200317.2015.011.html)。梭菌科、瘤胃球菌、Brevundimonas等與炎癥和癌癥相關，可見補充氰鈷胺存在引發腸道炎癥的風險，并且會加重炎癥性腸道疾病(inflammatorybowl disease，IBD)患者的炎癥[16]。甲鈷胺促進了產丁酸鹽細菌的相對豐度，而丁酸鹽具有包括抗炎、抗腫瘤活性、增強結腸屏障的作用[17]。此外，許多研究表明，缺少鈷卟啉與IBD有關[18-20]，因此及時補充鈷卟啉很有必要。而比起氰鈷胺，甲鈷胺是更好的選擇，能在補充鈷卟啉的同時減輕腸道炎癥。

a-對照組；b-甲鈷胺組；c-氰鈷胺組
圖7 發酵7 d后對照組、甲鈷胺組和氰鈷胺組的菌屬分布柱狀圖
Fig.7 Bacterial genus histogram after 7 days fermentation of CON, MECBL and CNCBL

2.2.2 短鏈脂肪酸和酶活變化

在甲鈷胺組中，丁酸含量在第1天遠高于其他2組，隨后下降；丙酸和異戊酸隨時間增多(圖8)。丙酸可以抑制膽固醇的合成，通過平衡乙酸與丙酸的比例可以降低心血管疾病的風險[21]。因此攝入甲鈷胺有益于脂代謝健康。丁酸在甲鈷胺組發酵第1天的占比最高，可能是因為在發酵過程中，Roseburia、Blautia以及Lachnospira的豐度在減少，這幾種菌主要參與丁酸的產生。由此可見，攝入甲鈷胺還有利于人體對蛋白質的吸收利用。

由圖9可知，甲鈷胺組的蛋白酶活力第2天迅速上升隨后又迅速下降(P<0．05)。除此以外，鈷卟啉組和對照組之間無顯著性差異。氰鈷胺組的淀粉酶活性在第2、3、5天顯著高于對照組，而甲鈷胺組第2、3、4、7天顯著低于對照組 (P<0．05)。對照組與鈷卟啉組的羧甲基纖維素酶活性沒有顯著性差異。其中，甲鈷胺組的蛋白酶活力迅速上升又迅速下降，可能與甲鈷胺組丁酸占比下降有關。結合有機酸結果，甲鈷胺組異戊酸日益增加，而蛋白質發酵主要產生支鏈脂肪酸[22]，蛋白酶的結果驗證了這一點。

a-對照組短鏈脂肪酸占比;b-甲鈷胺組短鏈脂肪酸占比; c-氰鈷胺組短鏈脂肪酸占比
圖8 對照組、甲鈷胺組和氰鈷胺組短鏈脂肪酸的占比
Fig.8 SCFA composition ratio in CON, MECBL and CNCBL

a-蛋白酶活力變化;b-淀粉酶活力變化;c-羧甲基纖維素酶活力變化
圖9 蛋白酶、淀粉酶和羧甲基纖維素酶活力隨發酵時間的變化
Fig.9 The change of protease, amylase and cellulose activity with fermentation time

2.2.3 典型關聯分析

由圖10可知，甲鈷胺和假單胞菌(Pseudomonas)、丙酸、丁酸皆呈正相關,說明加入一定量的甲鈷胺可以提高假單胞菌的相對豐度，促進丙酸和丁酸的產生。不動桿菌屬(Acinetobacter)、腸桿菌屬(Enterobacteriaceae)以及埃希氏桿菌屬(Escheriehia)與異戊酸和異丁酸含量呈正相關，其原因可能是甲鈷胺和氰鈷胺大大增加了不動桿菌屬的豐度，相比之下腸桿菌屬和埃希氏桿菌屬的減少并不重要。甲鈷胺組的異戊酸和異丁酸含量在增加，氰鈷胺組不變，可能還存在其他影響因素。脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)等與乙酸正相關，甲鈷胺組的發酵過程中乙酸含量日益減少，這表明甲鈷胺族脫硫弧菌屬的豐度可能在減少。

圖10 三組菌群典型關聯分析
Fig.10 Canonical correspondence analysis of microbiota in three groups

2.2.4 腸道菌群功能分析

通過PICRUSt預測得到24個二級代謝通路，262個三級代謝通路。由圖11可知，大多數二級代謝沒有受到鈷卟啉的影響。鈷卟啉能促進腸道菌的脂質代謝、萜類化合物和聚酮類的代謝、外源性物質降解代謝，抑制轉錄和其他次生代謝產物的合成。選取三級代謝中鈷卟啉組與對照組有顯著性差異的前10個代謝途徑作圖，如圖12所示。

圖11 菌群主要二級代謝通路的比較
Fig.11 Comparisons of the predominant secondary metabolism pathways of the microbiota

圖12 菌群主要三級代謝通路的比較
Fig.12 Comparisons of the predominant third-level metabolism pathways of the microbiota

在三級代謝層面，與對照組相比，在卟啉組中ABC轉運蛋白(ko02010)通路、DNA修復和重組蛋白(ko03400)通路、氮代謝 (ko00910)、磷酸轉移酶系統(ko02060)表達量均顯著下降，氰鈷胺組比甲鈷胺組的代謝通路表達量更低。

3 結論

本研究首先對體外腸道模擬體系進行優化。通過正交實驗得到與糞便菌群菌門、菌屬相似度最高的培養基以及菌生長最快的培養基。氣體環境對模擬系統內菌群的影響較小。針對目前微生物檢測方式耗時長的局限性，本研究提出可利用電子鼻快速評估腸道菌落的方法。該方法具有較好的定性能力，定量檢測準確度為70%，可用于判定菌群結構是否進入穩定期。

本研究考察了不同鈷卟啉對腸道菌群的調控作用。結果表明，甲鈷胺和氰鈷胺都降低了腸道菌群α-多樣性。在菌屬的相對豐度層面，加入2種鈷卟啉后不動桿菌屬占比都顯著上升，而擬桿菌屬、腸桿菌科某屬、瘤胃球菌、大腸埃希氏菌都下降。氰鈷胺提高了梭菌科(Fusobacteriaceae)、瘤胃球菌、Brevundimonas等與炎癥和癌癥相關細菌的相對豐度；而甲鈷胺促進了Clostridiumsensustricto、Clostridiaceae1、Clostridiale-IncertaeSedisⅪ等產丁酸細菌鹽的相對豐度，從而具有抗炎、抗腫瘤、增強結腸屏障等作用。在消化酶方面，氰鈷胺促進淀粉消化，甲鈷胺抑制淀粉消化，2種鈷卟啉對蛋白質、纖維素的消化無顯著影響。通過對代謝通路的預測，2種鈷卟啉都促進脂質代謝、萜類和聚酮類代謝、外源性物質降解，同時抑制轉錄因子等次生代謝產物的合成、ABC轉運蛋白、DNA修復和重組蛋白代謝、氮代謝以及磷酸轉移酶系統代謝，且氰鈷胺組抑制作用比甲鈷胺組更強。鑒于本課題的研究結果，建議在將鈷卟啉作為膳食補充劑時，將甲鈷胺代替常用的氰鈷胺作為首選，這有利于人體腸道菌群產生更有益的代謝產物，使宿主更健康。