產胞外多糖葡糖桿菌的分離鑒定及系統發育分析

裴芳藝，馬巖石，陳雪

(齊齊哈爾醫學院 科研處，黑龍江 齊齊哈爾，161000)

微生物胞外多糖(exopolysaccharide，EPS)是細菌、真菌等生長代謝過程中分泌到細胞外的高分子量生物聚合物[1-2]，可通過有機溶劑沉淀、超濾、噴霧干燥及冷凍干燥等方法獲得[3]，具有價格便宜、提取工藝簡單和安全性高的優點[4-5]。微生物EPS具有抗腫瘤、增強免疫力、抗氧化、降低膽固醇等作用[6]，可應用于醫療、制藥、乳品和化妝品等領域，受到人們廣泛關注[7]。DI等[8]發現干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)SB27 EPS具有顯著的體外抗腫瘤活性，當0.6 g/L EPS作用HT-29人結腸癌細胞72 h時，對結腸癌細胞抑制率為(77.19±3.56)%。馬文錦等[9]的研究顯示，膠紅酵母(Rhodotorulamucilaginosa)CICC 33013 EPS具有抗氧化活性功能，當EPS質量濃度為8 mg/mL時，DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、還原力分別為49.1%、51.2%、0.352。

葡糖桿菌屬(Gluconobactersp.)屬于醋酸菌科(Acetobacteraceae)[10]，包括白葡糖桿菌(G.albidus)、蠟狀葡糖桿菌(G.cerinus)、啤酒葡糖桿菌(G.cerevisiae)、弗氏葡糖桿菌(G.frateurii)、日本葡糖桿菌(G.japonicuss)、北碧葡糖桿菌(G.kanchanaburiensis)、近藤葡糖桿菌(G.kondonii)等[11-12]。Gluconobactersp.廣泛存在于環境中，對人和動物安全無致病性[13]，主要應用于生化產品開發、酶學性質研究和快速檢測3個方面[14]。郭丹釗等[15]研究發現，Gluconobactersp. JS-1所產的EPS由P1(阿拉伯糖、木糖、半乳糖)、P2(鼠李糖、甘露糖)構成，具有顯著的抗氧化活性。JAKOB等[16]發現，G.frateuriiTMW 2.767、G.cerinusDSM 9533、清邁新朝井桿菌(Neoasaiachiangmaiensis)NBRC 101099和巴厘島公崎桿菌(Kozakiabaliensis)DSM 14400的EPS產量較高，當培養基中加入80 g/L蔗糖時，EPS產量為6～12 g/L，經高效液相分析，分離得到的多糖以葡聚糖為主。HERMANN等[17]的研究顯示菌株K.baliensisDSM 14 400和N.chiangmaiensisNBRC 101099以小麥、全麥等為基質的面團中發酵48 h，均可產生EPS，且EPS產量與起始蔗糖含量成正相關，最高可產生0.049 kg/kg EPS。

本試驗以自然發酵的草莓汁為試驗材料，利用MRS-S產糖培養基篩選出高產EPS的菌株，通過顯微形態觀察、菌落形態觀察、生理生化鑒定以及16S rDNA技術對所獲得菌種進行鑒定，并利用Neighbor-Joining法和Maximum-Parsimony法建立系統發育樹，確定菌株同源性和種屬水平。本研究不僅為EPS的生產提供菌種來源，也為今后利用Gluconobactersp.大規模生產EPS提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料

草莓：采摘自齊齊哈爾市周邊某草莓采摘園。

供試菌株：CGMCC 1.565氧化葡糖桿菌(G.oxydans)，購于中國普通微生物菌種保藏管理中心，用于生理生化檢定的模式菌株。

1.1.2 實驗試劑

葡萄糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖、蔗糖、木糖、蜜二糖、纖維二糖、松三糖、核糖、棉子糖、鼠李糖、水楊苷、甘油、肌醇、木糖醇、甘露醇、山梨醇、七葉苷、馬尿酸、硝酸鹽、亞硝酸鹽、賴氨酸脫羧酶、尿素酶，北京陸橋技術股份有限公司；海藻糖、菊糖、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖、赤蘚糖醇、核糖醇、3%過氧化氫酶、淀粉、明膠、乙酰甲基甲醇(V-P)試劑、硫化氫、L-精氨酸，青島高科技工業園海博生物技術有限公司；牛肉浸粉、酵母提取物、蛋白胨、瓊脂粉，北京奧博星生物技術有限責任公司；葡萄糖、蔗糖、CH3COONa、K2HPO4、MnSO4、MgSO4·7H2O、檸檬酸銨、吐溫(均為分析純)，天津市江天化工技術有限公司。

細菌基因組DNA提取試劑盒(DP302)、Agarose LE瓊脂糖(RT101)、50×TAE Buffer(RT204)、GeneRed核酸染料(RT211)6×DNA電泳Loading(BufferRT201-01)、DL 15 000 DNA Marker(MD110-01)、DL 2 000 DNA Marker(MD114-01)、2×Taq PCR Mastermix(KT201-02)，天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.3 培養基

MRS培養基(g/L)：葡萄糖20，牛肉浸粉10，酵母提取物5，蛋白胨10，CH3COONa 5，K2HPO42，MnSO40.25，MgSO4·7H2O 0.58，檸檬酸銨2，吐溫1，121 ℃滅菌15 min，用于菌株培養。

MRS-S產糖培養基：在MRS培養基中加入100 g/L的蔗糖，用于產糖菌株的篩選。

MRS和MRS-S產糖固體培養基：在液體培養基內加入2%(質量分數)的瓊脂粉。

1.1.4 儀器與設備

DHP-9162電熱恒溫培養箱、HZQ-211C落地振蕩器，上海一恒科學儀器有限公司；CX31光學顯微鏡，日本奧林巴斯公司；FE28pH計、AL204電子天平，梅特勒-托利多集團；V-5000可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；22331Hamburg高速離心機、5804R臺式高速大容量冷凍離心機，德國艾本德公司；C1000-touch PCR儀、ChemiDoc MP全自動熒光和化學發光成像分析系統，美國伯樂公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 產糖菌株的初步分離篩選

將采摘的草莓搗碎，稱量25.0 g放入225 mL無菌水內振蕩混勻，30 ℃培養24 h，梯度稀釋至10-7，每個梯度分別取0.1 mL涂布于MRS和MRS-S產糖固體培養基上，分別做2個平行樣，30 ℃培養48 h，挑取單菌落，反復純化3次，保存備用。

1.2.2 形態特征觀察[18-20]

將菌株接種到MRS液體培養基中，30 ℃ 120 r/min培養24 h，觀察該菌種生長情況。將活化后的菌株采用三區劃線的方法，分別接種到MRS和MRS-S產糖平板上，30 ℃培養48 h，觀察菌落的大小、顏色、表面形態、黏稠度、質地、邊緣等特征。

取少量發酵液滴在載玻片上，均勻涂布，經革蘭氏染色后顯微鏡下觀察菌株形態。

1.2.3 高產EPS菌株的篩選

通過苯酚-硫酸法測定菌株發酵液中EPS的含量[21]，篩選產EPS量較高的菌株。取發酵液1.5 mL，離心，上清用去離子水適當稀釋，取1 mL稀釋液與1 mL體積分數為6%的苯酚溶液和5 mL濃H2SO4溶液混勻，靜置冷卻至室溫，于波長490 nm處測定吸光度值。根據標準曲線計算菌株發酵產EPS的含量，葡萄糖標準曲線的配制參照李晶晶的方法[22]。

1.2.4 生理生化特征鑒定[18-20]

按照試劑盒說明書要求，制備菌懸液，接種生化試劑管，30 ℃培養24 h后觀察。碳源主要包括葡萄糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖、蔗糖、木糖、蜜二糖、纖維二糖、松三糖、核糖、棉子糖、鼠李糖、海藻糖、菊糖、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖、水楊苷、甘油、肌醇、木糖醇、甘露醇、山梨醇、赤蘚糖醇、核糖醇、七葉苷、馬尿酸、淀粉。氮源主要包括硝酸鹽，亞硝酸鹽和賴氨酸脫羧酶、L-精氨酸。其他生化試驗主要包括3%過氧化氫酶試驗、葡萄糖產氣試驗、明膠液化試驗、乙酰甲基甲醇(V-P)試驗、硫化氫試驗、尿素酶試驗。

1.2.5 16S rDNA序列分析及構建系統發育樹

細菌基因組DNA提取：取活化的種子液1.5 mL，10 000 r/min離心1 min，收集沉淀。按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書，提取基因組DNA。以27F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′；1 492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′為引物進行16S rDNA部分序列擴增。PCR擴增體系為25 μL 2×Taq PCR Mastermix；2 μL 模板DNA；1 μL 27F引物；1 μL 1 492 R引物；21 μL ddH2O。PCR擴增條件為95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個循環；72 ℃再延伸10 min。PCR產物經凝膠驗證后，送上海生工生物公司測序。測序結果上傳NCBI數據庫，獲得GeneBank登錄號。在NCBI數據庫中利用BLAST進行序列比對，選擇相似度高的菌株，利用MEGA 5.0中Neighbor-Joining法[23]和Maximum-Parsimony法建立系統發育樹，確定菌株同源性和種屬水平。

1.3 數據統計分析

系統發育樹構建使用MEGA 5.0，繪圖使用Excel 2016，統計分析使用SPSS 19.0。

2 結果與分析

2.1 試驗菌株的篩選[24]

通過苯酚-硫酸法標準曲線的繪制，得到葡萄糖標準曲線方程為：y=9.855x+0.009，R2=0.999。

通過觀察菌株在MRS-S平板上菌落形態，發現11株菌表面呈現黏稠狀，利用苯酚-硫酸法測定11株菌的EPS含量，發現其EPS產量分別為(9.13±0.61)g/L(PFY-T2)、(7.31±0.73)g/L(PFY-T3)、(4.53±0.31)g/L(PFY-T6)、(16.71±0.51)g/L(PFY-T8)、(19.41±0.71)g/L(PFY-1)、(17.11±0.82)g/L(PFY-3)、(18.26±0.73)g/L(PFY-4)、(22.93±0.61)g/L(PFY-7)、(23.81±0.51)g/L(PFY-8)、(15.83±0.54)g/L(PFY-P1)、(15.29±0.96)g/L(PFY-P6)。其中菌株PFY-7、PFY-8的產糖能力相對較高，因此，對這2菌株進行下一步鑒定。

2.2 菌株形態觀察

菌株PFY-7、PFY-8在MRS和MRS-S產糖固體培養基上形態如圖1所示。在MRS平板上菌落較小，大小在3 mm左右，灰白色，隆起，邊緣整齊，表面光滑。在MRS-S產糖固體培養基上，菌落較大，有黏稠的液體覆蓋其上，挑起具有黏性。革蘭氏染色結果如圖2所示，菌體呈紅色、短桿狀排列，為革蘭氏陰性菌。

a-菌株PFY-7(MRS平板);b-菌株PFY-7(MRS-S平板)； c-菌株PFY-8(MRS平板);d-菌株PFY-8(MRS-S平板)
圖1 菌株PFY-7、PFY-8在MRS、MRS-S平板上的菌落形態
Fig.1 Colony morphology of strain PFY-7 and PFY-8 on MRS and MRS-S agar plate

a-菌株PFY-7；b-菌株PFY-7局部;c-菌株PFY-8； d-菌株PFY-8局部
圖2 菌株PFY-7、PFY-8顯微形態觀察(1 600×)
Fig.2 The microscopic morphology of strain PFY-7 and strain PFY-8

2.3 生理生化鑒定

參考《常見細菌系統鑒定手冊》[18]、《乳酸菌分類鑒定及實驗方法》[19]、《伯杰細菌手冊》[20]，對菌株PFY-7、PFY-8的部分生理生化特性進行研究，結果如表2所示。菌株PFY-7和PFY-8在肌醇、甘露醇的利用上存在明顯差異，2株菌在種上可能存在差異，需要進一步驗證。2株菌的過氧化氫酶(接觸酶)試驗為強陽性，說明可以催化過氧化氫分解成水和氧氣。葡萄糖產酸產氣試驗可以看出菌株為同型發酵。同化碳源試驗可以判斷菌株對不同碳源的利用情況，結果為陽性的說明對該碳源利用較好，結果為陰性說明不可以利用該碳源做為唯一碳源進行發酵，結果為弱陽性說明利用該碳源為唯一碳源發酵時菌株生長受到抑制。七葉苷水解為陽性，說明菌株可以水解七葉苷，生成七葉亭，與檸檬酸鐵作用，生成黑色化合物。明膠液化試驗為陰性說明菌株不可以產生明膠蛋白酶。V-P試驗陰性說明菌株不能利用葡萄糖生成乙酰甲基甲醇。硫化氫產氣試驗為陰性，說明菌株不能分解有機硫化物。精氨酸水解試驗為陰性，說明菌株不能產生細菌水解酶，不能釋放出堿性物質，而是分解葡萄糖產酸。尿素酶試驗為陰性，說明菌株不能分解尿素生成氨。PFY-7、PFY-8的生理生化特征與模式菌株Gluconobactersp.的生理生化性質基本一致[18]。因此，初步判斷這2株菌屬于Gluconobactersp.。

表2 菌株PFY-7和PFY-8的部分生理生化特性Table 2 Physiological and biochemical results of the strain PFY-7 and strain PFY-8

注：“+”代表代謝反應陽性，“-”代表代謝反應陰性，“w”代表代謝反應弱陽性

2.4 16S rDNA序列分析和系統發育樹構建

分別提取菌株PFY-7、PFY-8的基因組DNA，PCR反應擴增菌株的16S rDNA序列，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳后，在1 500 bp處獲得清晰條帶，結果如圖3所示。PCR產物送上海生工生物工程有限公司進行測序，將測序結果與GenBank公布的數據庫進行比對，通過比對發現菌株PFY-7與G.kondoniiHD385(GeneBank登錄號：KJ130330)的相似度為99.78%，菌株PFY-8與G.frateuriiSL13-7(GeneBank登錄號：AB819118)的相似度為99.78%。結果上傳到NCBI數據庫，獲得GeneBank登錄號分別為MN960193和MN960194。

DL 2000 DNA Marker由DNA片段2 000、1 000、750、500、 250以及100 bp組成，共6條帶；泳道1為菌株PFY-7 的擴增產物；泳道2為菌株PFY-8的擴增產物
圖3 菌株PFY-7和PFY-8的16S rDNA PCR 擴增結果
Fig.3 Electrophoregram of 16S rDNA amplification products of strain PFY-7 and strain PFY-8

由于單一的方法構建系統發育樹不足以準確鑒定菌株種屬[24]，因此本試驗分別采用Neighbor- Joining和Maximum-Parsimony法共同構建菌株的16S rDNA系統發育樹，參數BootstrapReplications設置為1 000，移除序列中的模糊位點，將菌株PFY-7與20株菌的核酸序列進行比對，按比例繪制系統發育樹，如圖4所示。可知PFY-7菌株與G.kondoniiHD385的親緣關系在2種方法構建的系統發育樹中分別為63和70，結果比較接近，再結合NCBI基因序列比對結果和生理生化試驗結果，可以準確判斷PFY-7菌株為G.kondonii，命名為G.kondoniiPFY-7。將菌株PFY-8與13株菌的核酸序列進行比對，按比例繪制系統發育樹，如圖5所示。菌株在核糖醇中的生長情況可以作為鑒別葡糖桿菌種間鑒定的特征[18]，其中能利用核糖醇的菌株可以初步判斷為G.frateurii，這與在NCBI上比對的結果相一致，同時，結合16S rDNA系統發育樹構建的結果，即菌株PFY-8與菌株G.frateuriiSL13-7的親緣關系在2種方法構建的系統發育樹中均為62，結果一致，可以準確判斷PFY-8菌株為G.frateurii，命名為G.frateuriiPFY-8。

a-Neighbor- Joining法;b-Maximum-Parsimony法
圖4 Neighbor- Joining和Maximum-Parsimony 法構建菌株PFY-7的16S rDNA系統發育樹
Fig.4 Phylogenetic tree of strain PFY-7 16S rDNA base on using Neighbor- Joining method and Maximum-Parsimony method

3 結論

本試驗從草莓發酵液中分離得到2株高產EPS的葡糖桿菌，其胞外多糖的含量分別為(22.93±0.61) g/L、(23.81±0.51) g/L。經形態學鑒定、生理生化實驗和分子生物學實驗鑒定這2株菌為G.kondonii、G.frateurii。分別命出為G.kondoniiPFY-7和G.frateuriiPFY-8。因此，本試驗不僅為EPS的生產提供了菌種來源，也為今后利用葡糖桿菌大規模發酵生產EPS提供了理論基礎。

a-Neighbor- Joining法;b-Maximum-Parsimony法
圖5 Neighbor- Joining和Maximum-Parsimony 法構建菌株PFY-8的16S rDNA系統發育樹
Fig.5 Phylogenetic tree of strain PFY-8 16S rDNA base on using Neighbor- Joining method and Maximum-Parsimony method