硒對赤霞珠釀酒葡萄果實品質的影響

朱娟娟，馬海軍*，李敏，杜夢，田婷婷

1(北方民族大學 生物科學與工程學院，寧夏 銀川，750021)2(寧夏葡萄與葡萄酒技術創新中心，寧夏 銀川，750021)

近年來，隨著我國國民經濟水平持續快速增長、居民消費水平不斷提升和消費者飲酒習慣逐漸改變，我國釀酒工業呈現了快速發展趨勢，特別是葡萄酒消費逐年增長，已成為我國工業經濟中增長較快且具活力的產業之一。當前消費者對葡萄酒質量的要求也逐漸增高，既要求其具有獨特的風味又要求其具有高的保健功能。

硒是谷胱甘肽過氧化物酶、谷氧還蛋白還原酶、硫氧還蛋白還原酶及其他一些脫碘酶等含硒酶蛋白的必需組分，還能形成多種硒代謝產物參與代謝活動[1]，對維持人體正常代謝，特別是對機體自身免疫功能、局部物質能量代謝以及重要內分泌器官功能具有重要作用，缺硒不僅容易導致正常發育障礙，還會促使多種疾病發生[2]。無機硒不能被人體直接吸收利用且易引起中毒，而植物能夠將其轉化成有機硒，通過食物鏈被人體吸收利用[3-4]，則富硒食品的研發成為當前研究的熱點。大量研究證實，葉面噴施硒后樹體葉片吸收的硒可直接向果實中轉運，從而提高釀酒葡萄硒含量，且具有用量低、利用率高等優點[5]，因此，通過添加外源硒提升釀酒葡萄硒含量成為釀制富硒葡萄酒的途徑之一。

隨著富硒食品的研發，研究者們發現適量硒除了提高植物組織含硒量外，還可以增加葉綠素含量、促進光合作用、提高可溶性蛋白質含量、清除自由基、增強免疫機能、抵抗真菌病害的入侵以及拮抗環境毒害等作用，并對氮、硫及氨基酸代謝產生影響[6]。葉面噴施富硒肥可使奧迪亞無核葡萄平均單株產量增加4.45%[7]，提高鮮食葡萄和釀酒葡萄果實單粒重、橫徑、縱徑、可溶性糖和VC含量[5，8-9]；降低甜柿葉片和果實中的鎘、鉛、汞含量，增加果實可溶性糖、VC和可溶性固形物含量，降低果實可滴定酸含量[10]。釀酒葡萄富含酚類物質，它們是葡萄中重要的次生代謝產物，也是葡萄酒中最重要的風味物質之一，不僅賦予葡萄酒各種顏色而且使葡萄酒具有各種復雜的口感和味感特征；然而，葡萄中酚類物質含量受氣候條件、土壤狀況、栽培措施以及品種等多因素影響[11]。有關硒對葡萄生長發育、抗氧化酶活性、硒的累積和分配以及果實糖酸含量影響的報道屢見不鮮，但對釀酒葡萄果實酚類物質、營養元素以及抗氧化特性的研究甚少。因此，本研究通過大田葉面噴施不同濃度亞硒酸鈉，監測發育期果實總糖、還原糖、可溶性固形物、可滴定酸、pH值、總酚、總黃烷醇和花色苷含量以及礦質元素含量，并測定果實DPPH自由基清除活性、ABTS自由基陽離子清除活性和總還原力，運用灰色系統關聯度，綜合評價不同濃度硒對釀酒葡萄品質的影響，旨在為生產優良葡萄酒原料提供理論基礎和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑

沒食子酸、葡萄糖、抗壞血酸、三氯乙酸、鐵氰化鉀、甲醇、濃HNO3、濃H2SO4、1，1-二苯基-2-三硝基苯(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)、2，2′-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽[2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid,ABTS)]、福林試劑、兒茶酚、6-羥基-2，5，7，8-四甲基色烷-2-羧酸(Trolox)、H2O2均為分析純，天津市大茂化學試劑廠；高純氬氣(純度 ≥99.99%)，上海恒箐特種氣體有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-2100紫外可見分光光度計，上海尤尼柯上海尤尼柯儀器有限公司；AUW 220D電子天平，日本島津公司；PHS-3C型酸度計，上海儀電科學儀器股份有限公司；PAL-1型手持折射儀，上海鑫際儀器有限公司；Millipore純水儀，Millipore 公司；15-ESICP全譜直讀電感耦合等離子體發射光譜儀，美國VARIAN公司；MDS-6型微波快速制樣系統，上海新儀微波化學科技公司；ECH-1型電子控溫加熱板，上海新儀微波化學科技公司。

1.3 試驗設計

試驗于2017年在寧夏園林場葡萄試驗基地(北緯37°43′～39°23′，東經105°45′～106°47′)進行，該地區屬于中溫帶大陸性氣候，年均降水量193.4 mm，年均氣溫9.4 ℃，年均日照時數3 000 h，無霜期185 d。供試品種為歐亞種釀酒葡萄(VitisviniferalL.)赤霞珠(Cabernet sauvignon)，2006年定值，東西行向，行距3.0 m，株距0.5 m，葡萄架勢為單臂籬架，沿葡萄行每隔8 m豎立水泥支柱，其上拉3道鐵絲，葡萄架高約1.5 m。

分別在葡萄的幼果期(7月8日)和著色前期(7月28日)進行葉面噴施一定濃度的亞硒酸鈉(Na2SeO3)，根據葡萄植株對硒的需求量和安全范圍，將噴施的質量濃度設定為5個水平，分別為0 mg/L(Se0)、10 mg/L(Se10)、25 mg/L(Se25)、50 mg/L(Se50)和75 mg/L(Se75)。試驗葡萄分區處理，每區有16株葡萄樹，每個處理完全隨機排列，重復3次。試驗期間葡萄的施肥、除蟲除草、修剪、施肥追肥等均按正常情況進行。7月28日噴施后每隔8～10 d采集1次果實樣品，直至成熟。樣品立即進行液氮速凍，隨后將果粒置于采樣袋中放置在-80 ℃冰箱冷凍儲藏，以備測定。

1.4 測定指標與實驗方法

1.4.1 葡萄果實基本理化指標

葡萄果實可溶性固形物用手持糖量計檢測，以°Brix表示；總糖和還原糖(以葡萄糖計)采用斐林試劑直接滴定法；可滴定酸(以酒石酸計)采用指示劑法；pH值采用酸度計法測定。每個葡萄樣品重復檢測3次，最后取平均值。

1.4.2 葡萄果實酚類物質

總酚采用福林-肖卡法，參考ARNOUS等[12]方法，以沒食子酸表示，其回歸方程為y=0.001 1x+0.005 9，R2=0.999 7；總黃烷醇采用二甲氨基肉桂醛法，參考張娟等[11]方法，以兒茶素表示，其回歸方程為y=0.004 5x+0.028 8，R2=0.993 9；花色苷采用pH示差法，參考張娟等[11]方法，以花青素-3-O-葡萄糖苷(cyanidin-3-O-glucoside，CGE)表示。

1.4.3 葡萄果實礦質元素分析

將采集的樣品洗凈塵沙，經冷凍干燥至恒重粉碎后，果實硝態氮采用雙波長紫外分光光度計法測定；銨態氮采用2 mol/L KCl 浸提-靛酚藍比色法測定；Se、P、K、S、Ca、Mg、Fe、Mn、Zn含量采用微波消解-電感耦合等離子體原子發射光譜儀測定。

1.4.4 葡萄果實抗氧化特性

DPPH自由基清除能力采用1，1-二苯基-2-三硝基苯法，以Trolox當量抗氧化能力表示，其回歸方程為y=3.45x-29.6，R2=0.993 9；ABTS自由基清除能力采用2，2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽方法，以Trolox當量抗氧化能力表示，其回歸方程為y=4.28x-143.9，R2=0.994 6；總還原力采用鐵氰化鉀還原法，以AAE當量抗氧化能力表示，其回歸方程為y=7.28x+0.03，R2=0.995 7。

1.5 數據統計分析

本試驗采用SAS 12.1統計分析軟件進行方差分析，不同處理間差異比較采用最小顯著差別(least significant difference，LSD)法進行多重比較，利用Microsoft Excel 2013軟件作圖。采用灰色系統關聯度理論，選取不同處理間具有差異顯著性的理化指標進行灰色關聯度分析，綜合評價硒對赤霞珠釀酒葡萄果實質量的影響。

2 結果與分析

2.1 硒對赤霞珠釀酒葡萄果實硒含量的影響

由圖1可知，葉面噴施硒元素能夠提高葡萄漿果中硒含量，并隨著噴硒濃度的增加而增加，其中Se75處理組漿果硒含量最高，達到89.1 μg/kg，極顯著(P<0.01)高于其他處理，Se25和Se50極顯著高于(P<0.01)Se10和Se0，但Se25與Se50、Se10與Se0間無顯著性差異。與對照(Se0)相比，Se10、Se25、Se50和Se75處理組漿果硒含量增加72.9%、350.5%、387.9%和734.9%。

圖1 不同硒濃度對釀酒葡萄果實硒含量的影響
Fig.1 Influence of selenium on selenium content of grape berry
注：圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2 硒對赤霞珠釀酒葡萄果實礦質元素含量的影響

葡萄酒釀造過程中，原料漿果中營養元素供釀酒酵母和乳酸菌的生長繁殖，且葡萄酒中的礦質元素組成、含量與葡萄原料密切相關。由表1可知，葉面噴施硒對釀酒葡萄果實 K、Zn、Fe、Ca、N-NH4、N-NO3和S元素含量均無顯著性影響，但可以促進果實對P、Cu、Mn和Mg元素的吸收和積累，其中Se10處理組Mn元素含量最高，Se75處理組P、Cu和Mg元素含量最高。ZHU等[13]研究表明，噴施硒肥能夠提高鮮食葡萄果實 K 和 Ca 元素含量，但本研究結果與其不相符，可能因品種和硒源不同。與對照(Se0)相比，Se10、Se25、Se50和Se75處理的漿果 P 元素分別提高7.57%、11.84%、20.06%和20.68%；Cu元素分別提高35.17%、32.26%、31.18%和36.01%；Mn 元素分別提高37.92%、-6.15%、10.10%和-8.54%；Mg 元素分別提高4.76%、6.42%、1.29%和11.84%。

表1 硒對釀酒葡萄果實營養元素的影響Table 1 Influence of selenium on nutritional elements of grape berry

注：同一行不同字母表示差異顯著性(P<0.05)(下同)

2.3 硒對赤霞珠釀酒葡萄果實基本理化指標的影響

糖和酸是釀酒葡萄果實生長發育過程中的基礎物質，是色素和風味物質的基礎原料，其組成和含量是決定漿果品質和商品價值的最重要指標[14-15]。由圖2可知，硒顯著增加赤霞珠漿果糖類物質含量，而對有機酸含量的影響因濃度不同而異，但對pH值無顯著性影響。Se75和Se50處理的漿果糖類物質含量最高，其總糖、還原糖和可溶性固形物含量均顯著高于其他處理；Se25處理的總糖、還原糖含量顯著高于Se10處理，但可溶性固形物含量無顯著性差異；Se10與Se0處理間糖類物質含量均無顯著性差異。葡萄果實糖分主要來源于碳水化合物的同化，而噴施硒能夠促使果實對 P、Cu和Mg元素吸收和積累，其中 P 參與光合磷酸化作用，Cu 和 Mg 元素是葉綠體的結構部分，是維持葉綠體結構所必須的微量元素，也是許多酶的組成成分，從而增強了光合作用，使得光合產物增加，增強了源的供給能力，并且硒可以提高果實酸性轉化酶的活性[11]，最終增加果實中糖類物質的含量。相對于糖分，葡萄果實中的有機酸含量很低，但酸有助于抑制微生物繁殖，穩定葡萄與葡萄酒的適口性[14]。Se50處理的有機酸含量最高，其可滴定酸含量顯著高于其他處理，Se10處理的可滴定酸含量顯著高于Se25、Se75和Se0處理，但Se25、Se75和Se0處理間無顯著性差異。有機酸是通過果實組織自身固定CO2在果實內部合成[16]，而Mn是許多酶的組成成分，對許多酶活性起重要的調節作用，Se50和Se10處理提高了漿果Mn含量，則有助于有機酸的合成。與對照(Se0)相比，Se10、Se25、Se50 和Se75處理的總糖含量分別提高2.1%、7.3%、16.0%和16.3%，還原糖含量分別提高1.2%、9.6%、14.7%和13.7%，可溶性固形物含量提高 0.44%、2.6%、15.9%和 16.3%，可滴定酸含量分別提高10.5%、-2.6%、18.4%和-5.3%。故從糖類物質來看，最佳處理是Se75和Se50；從有機酸來看，最佳處理是Se50。

a-總糖;b-還原糖;c-可溶性固形物;d-可滴定酸;e-pH值
圖2 硒對釀酒葡萄果實基本理化指標的影響
Fig.2 Influences of selenium on basic physical and chemical indicators in wine grapes
注：圖中不同小寫字母表示相同采樣期中不同處理間差異顯著(P<0.05)(下同)

2.4 硒對赤霞珠釀酒葡萄果實酚類物質的影響

2.4.1 硒對赤霞珠釀酒葡萄果實總酚含量的影響

酚類物質是葡萄酒中最重要的風味物質之一，不僅影響葡萄酒顏色、香氣和口感等感官質量，還決定葡萄酒的諸多生理活性功能，也是葡萄酒保健價值所在[17]。然而，葡萄酒中的酚類物質主要來源葡萄果皮、籽和肉中酚類物質的溶出，則提高果實中酚類物質含量才有可能增加葡萄酒酚類物質的含量[11]。由圖3可知，硒對果籽、果皮和果肉總酚含量具有一定促進作用。Se10處理組果籽、果皮和果肉總酚含量最高，且果皮和果肉總酚含量顯著高于Se0處理。盡管Se10與Se0處理間果籽總酚含量無顯著性差異，但Se10處理組果籽總酚含量比Se0處理高24.44%。Se10、Se25、Se75處理與Se0處理間果籽、果皮和果肉總酚含量均無顯著性差異。與對照(Se0)相比，Se10、Se25、Se50 和Se75處理組果實總酚含量分別提高27.9%、-9.9%、12.2%和-3.7%，故從果實總酚含量來看，Se10為最佳處理。

a-果籽；b-果皮;c-果肉
圖3 硒對釀酒葡萄果實總酚含量的影響
Fig.3 Influences of selenium on total phenolic content of wine grapes

2.4.2 硒對赤霞珠釀酒葡萄果實總黃烷醇含量的影響

黃烷醇是類黃酮合成途徑的產物，與黃酮醇、花青素的前體物質相同[18]，是形成葡萄酒澀味、苦味的結構物質，同時還起到穩定葡萄酒色度的作用[19]。葡萄果肉中總黃烷醇含量微小，用常規測定方法未檢測出。由圖4可知，硒對果籽和果皮總黃烷醇含量具有一定促進作用。噴硒處理組葡萄果籽總黃烷醇含量均顯著高于對照(Se0)，但噴硒處理間果籽總黃烷醇含量無顯著性差異。Se10和Se25處理組果皮總黃烷醇含量均顯著高于對照(Se0)，但Se10和Se25處理間無顯著性差異；Se50和Se75處理組果皮總黃烷醇含量與Se0處理間均無顯著性差異，但Se75處理組果皮總黃烷醇含量顯著低于Se50處理組。與對照(Se0)相比，Se10、Se25、Se50 和Se75處理組果實總黃烷醇含量分別提高34.0%、41.8%、34.2%和31.6%，故從果實總黃烷醇含量來看，Se25為最佳處理。

a-果籽；b-果皮
圖4 硒對釀酒葡萄果籽和果皮總黃烷醇含量的影響
Fig.4 Influences of selenium on total flavanols content of seeds and skins in wine grapes

2.4.3 硒對赤霞珠釀酒葡萄果實花色苷含量的影響

花色苷是存在于葡萄果皮中的水溶性天然色素，屬于類黃酮化合物，影響著葡萄酒的色澤、口感及營養價值，且直接決定紅葡萄酒和新葡萄酒的顏色。同時，花色苷與單寧結合可使葡萄酒中的單寧軟化，降低其苦澀味和粗糙感，使口感變得更加圓潤[20]。由圖5可知，隨著生育期的推進，果皮花色苷含量大幅度提高，且噴硒處理后2周，硒對其有顯著性影響。采收期，Se50處理組果皮花色苷顯著高于Se0處理，而Se75處理組果皮花色苷顯著低于其他處理。糖是花色苷合成的原料之一，在果實發育過程中，花色苷的合成伴隨糖的積累[21]，噴施硒有利于葡萄果實糖類物質的積累，從而促進花色苷的合成與積累；然而，不同種類糖對花色苷合成的影響有所不同，其中蔗糖對花色苷的生物合成有明顯正向調控作用，而葡萄糖和果糖等的促進作用較小[22-23]。本研究中Se50處理可能更有利于蔗糖的合成與積累，故其漿果果皮花色苷含量最高。與對照(Se0)相比較， Se10、Se25、Se50 和Se75處理組花色苷含量分別提高19.3%、24.3%、49.2%和-51.1%，故從果實花色苷含量來看，Se50為最佳處理。

圖5 硒對釀酒葡萄果皮花色苷含量的影響
Fig.5 Influences of selenium on anthocyanins of skins in wine grapes

2.5 硒對赤霞珠釀酒葡萄果實抗氧化特性的影響

硒是谷光甘肽過氧化物酶的必須組分，能夠降低膜受過氧化損害，維持植物抗氧化系統，減輕氧化損傷[24]；同時，酚類物質和糖酸等營養物質也參與抗氧化的過程[25]。由表2可知，噴硒處理顯著提高葡萄漿果抗氧化能力，其中Se50處理漿果的總還原力和ABTS自由基清除活性最高，Se75處理漿果的DPPH自由基清除活性最高。與對照(Se0)相比，Se10、Se25、Se50和Se75分別提高總還原力80.17%、102.87%、206.63%和86.90%；分別提高DPPH自由基清除活性40.08%、46.79%、56.58%和93.82%；分別提高ABTS自由基陽離子清除活性8.35%、17.94%、32.54%和20.16%。故從抗氧化能力來看，Se50和Se75為最佳處理。

表2 不同濃度硒對赤霞珠釀酒葡萄果實抗氧化特性的影響Table 2 Influence of selenium on antioxidant properties of grape berry

2.6 不同硒濃度下釀酒葡萄果實化學成分的灰度關聯分析

采用灰色系統關聯度理論，選取不同處理間具有顯著差異的理化指標進行灰色關聯度分析，其包括總糖、還原糖、可滴定酸、可溶性固形物、總酚、總黃烷醇、花色苷、Se、P、Cu、Mn、Mg、總還原力、ABTS、DDPH 15項指標。由表3可知，噴硒處理的釀酒葡萄果實理化特性加權關聯度高于未噴硒處理的釀酒葡萄果實理化特性加權關聯度，表明噴硒能夠改善釀酒葡萄果實質量；噴硒處理中，釀酒葡萄果實理化特性加權關聯度隨噴硒濃度的增加先增后降，其中Se50處理的釀酒葡萄果實理化特性加權關聯度最高，則表明Se50處理組釀酒葡萄果實質量最佳。

表3 不同硒濃度下釀酒葡萄果實化學成分的灰度關聯分析Table 3 The relational grade of physicochemical property in grape berry of Cabernet Sauvignon under different selenium dose

3 結論

釀酒葡萄果實發育期噴施適宜濃度的硒可顯著提高赤霞珠果實可溶性固形物、總糖、還原糖、可滴定酸和Se、P、Cu、Mg含量及其總還原力、DPPH自由基清除活性和ABTS自由基清除活性，而對果實pH值和K、Zn、Fe、Ca、N-NH4、N-NO3及S元素含量均無顯著性影響。硒對果實酚類物質如總酚、總黃烷醇、花色苷等含量和營養元素Mg的效應因噴施濃度不同而異，通過灰色系統關聯度分析，Se50處理的釀酒葡萄果實質量指標加權關聯度最高，故果實發育期噴施50 mg/L的亞硒酸鈉有助于改善果實質量。