寧夏赤霞珠葡萄酒中氨基甲酸乙酯和生物胺形成因素分析

張一晟，張惠玲*，薛逸軒，郭曉夢

1(寧夏食品微生物應用技術與安全控制重點實驗室，寧夏 銀川，750021) 2(寧夏大學 農學院，寧夏 銀川，750021)

寧夏賀蘭山東麓是我國生態最佳、釀酒葡萄質量最優產區之一，具備了生產高端葡萄酒的地理優勢[1]。葡萄酒含有多種氨基酸、礦物質、維生素和多酚物質，具有增強免疫力及預防多種癌癥和生理保健功效[2]。隨著人們生活水平的提高和健康意識的增強，飲酒習慣逐漸發展成為保健型、營養型和享受型，這種消費觀念的轉變促進了葡萄酒產業的快速發展。對于葡萄酒而言，安全與健康同樣重要。但是，除了已知酒精的副作用，酒精飲料也可能是一些毒物和污染物的來源[3]。特別是不良代謝物氨基甲酸乙酯被國際癌癥研究機構劃分為2A類致癌物質[4]，且具有遺傳毒性[4]。氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，EC)是酒精發酵飲料中最常見的有毒污染物[5]，主要來自于尿素以及酒精發酵過程中的酒精反應和細菌污染[6]。

近年來，國內外研究者對葡萄酒的安全也開始重視，對葡萄酒中氨基甲酸乙酯進行了限量控制，研究者也在不斷探索葡萄酒中氨基甲酸乙酯的控制[7]。1976年，MAYER通過對葡萄酒的研究，發現釀酒片球菌屬的乳酸菌會產生組胺。并在蘋果酸-乳酸發酵時，還會產生酪胺、腐胺和苯乙胺等其他幾種胺[8]，王慧娟等[9]利用固相萃取結合氣相色譜-質譜聯用技術對甘肅市售的部分葡萄酒的氨基甲酸乙酯含量進行檢測。張凱婷等[10]通過將葡萄汁中加入不同濃度前體氨基酸進行酒精和蘋果酸-乳酸發酵，發現不同濃度不同種類的前體氨基酸對生物胺影響都各不相同。國內外研究發現，氨基甲酸乙酯和生物胺的形成受多種條件的影響，還需進一步去研究探索。

本研究通過高效液相色譜技術分析不同溫度、接種量、pH以及高糖酒精發酵和蘋果酸-乳酸發酵過程中寧夏賀蘭山東麓葡萄酒中氨基甲酸乙酯和生物胺含量，對今后通過優化釀造工藝盡可能減少有害物質的產生具有指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄為賀蘭山東麓葡萄酒產區2017年赤霞珠。

酵母菌：ADT，安琪酵母有限公司；BO213、F33、AC、FX10、71B、F15、X16，法國Laffort公司；EC1118、D254、2323、71B，法國LALVIN公司；KD，法國Vitilevure公司；XR，法國Lamothe-Abiet公司。

乳酸菌為法國諾盟公司OENO 1型，菌種活性≥1 011 CFU/g。

氨基甲酸乙酯、苯丙氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、組氨酸、酪氨酸、精氨酸、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、精胺、2, 4-二硝基氟苯1-二甲氨基萘-5-磺酰氯(分析純)，西格瑪奧德里奇貿易有限公司；氨基硫尿素、尿素、甲醇、乙腈、正己烷(色譜純)，天津市大茂化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

1100 Series高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；NBS-I氮吹儀，合肥艾本森科學儀器有限公司；HHS-21-6電熱恒溫水浴鍋，上海博訊實業有限公司醫療設備廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 對照組設置

以葡萄汁氨基甲酸乙酯、生物胺、尿素作對照組。

1.3.2 實驗要點

干紅葡萄酒工藝流程如下：

原料→分選→除梗→破碎→果膠酶、亞硫酸→25 ℃發酵→10 ℃皮渣浸漬→接種酵母→皮渣分離→生葡萄酒

(1)預處理

將葡萄破碎除梗后按60和40 mg/L的添加量加入亞硫酸和果膠酶，調整pH值為3.3，靜置8 h。

(2)14種不同酵母菌的發酵實驗

將處理的后葡萄汁加入10倍的超純水，接入酵母菌，25 ℃發酵，發酵期間每24 h取1次樣進行測定。

(3)安琪酵母菌(ADT)發酵實驗

不同發酵條件實驗：實驗選用ADT酵母按不同溫度(0.2 g/L接種量)、不同接種量(25 ℃溫度)進行發酵實驗、不同pH(0.2 g/L、25 ℃溫度)的條件發酵，按1.3.2方法釀造并測定。

高糖發酵葡萄酒實驗：將葡萄進行陰晾，使糖度達到30%進行釀制，釀制方法相同，并測定相關指標。

1.3.3 蘋果酸-乳酸發酵

以經接種安琪酵母菌(ADT)(接種量0.2 g/L)，發酵溫度(25 ℃)釀造所得葡萄酒為實驗對象，接種乳酸菌，分別在不同接種量(0.005、0.01、0.02、0.03、0.04 g/L)、不同溫度(15、18、21、24 ℃)下進行2次發酵，發酵結束后，測定相關指標。

1.4 測定方法

1.4.1 酒精度測定

酒精度的測定參考GB/T15038—2006蒸餾法[11]。

1.4.2 氨基酸測定

采用高效液相色譜法，參照馮玲玲等[12]和王小琴[13]的方法進行溶液配制與測定。

1.4.3 氨基甲酸乙酯測定

采用高效液相色譜法，參考付方圓等[14]的方法進行樣品處理與測定。

1.4.4 生物胺測定

采用高效液相色譜法，參考王振等[15]和陸永梅等[16]的方法進行測定。

1.4.5 尿素測定

采用分光光度法，參考梁新紅等[17]的方法進行測定。

2 結果與分析

2.1 14種不同酵母菌發酵對葡萄酒氨基甲酸乙酯、生物胺的影響

2.1.1 不同酵母菌發酵對葡萄酒氨基甲酸乙酯的影響

隨著發酵的進行與發酵結束，由圖1可知在相同的發酵條件下，接種不同酵母菌的發酵過程中氨基甲酸乙酯的曲線變化規律大致相同，但不同酵母菌對葡萄酒發酵過程中氨基甲酸乙酯含量差異極顯著(P<0.01)。氨基甲酸乙酯作為酵母菌的氮代謝產物，是由酵母在精氨酸代謝過程中產生并逐漸積累的中間產物尿素在發酵液中與乙醇反應形成的[18]。但是由于不同酵母菌尿素循環氮代謝能力不同或代謝途徑不同，釋放到發酵液中的尿素會有所不同，因此對氨基甲酸乙酯形成的影響不同，這與于英等[19]、王根杰等[20]研究結果相吻合。

a-第一組酵母菌；b-第二組酵母菌
圖1 不同酵母菌發酵葡萄酒對氨基甲酸乙酯的影響
Fig.1 Effect of wine fermentation by different yeasts on ethyl carbamate

2.1.2 不同酵母菌發酵葡萄酒生物胺的影響

如圖2所示生物胺初始濃度來自于葡萄汁。由方差分析可知，不同酵母菌發酵葡萄酒中生物胺含量變化差異極顯著(P<0.01)。由圖2可知，生物胺在發酵過程中并無明顯的變化，這與大部分酵母菌在發酵過程不生成生物胺有關[21]；但當到達發酵后期特別是接近結束時，產生了部分生物胺，因此含量有所上升，這是由于酵母細胞在自身產生的蛋白酶的酶解作用下開始自溶解體，許多活性物質包括生物胺被釋放出來[22]，使最后的生物胺測定值升高，但是由于不同的酵母菌自溶能力有差異，所以最后的測定值不同[23]。

a-第1組酵母菌；b-第2組酵母菌
圖2 不同酵母菌發酵葡萄酒對生物胺的影響
Fig.2 Effect of wine fermentation by different yeasts on biogenic amines

2.2 安琪酵母菌(ADT)發酵實驗結果

2.2.1 不同發酵條件對氨基甲酸乙酯和生物胺的影響

2.2.1.1 發酵溫度的影響

由圖3可知，不同溫度下氨基甲酸乙酯和生物胺含量組間均表現為差異極顯著(P<0.01)。溫度升高加快了酵母代謝精氨酸產生尿素的速度以及尿素和乙醇反應生成氨基甲酸乙酯的速度，曲線坡度變大，但當精氨酸被消耗完后，氨基甲酸乙酯變化很小。同時，生物胺在發酵前期變化不大，但是隨著溫度升高,酵母自溶程度加大，生物胺測定值也加大的現象。董興全等[24]研究發現發酵溫度是影響氨基甲酸乙酯的最重要因素。

a-氨基甲酸乙酯；b-生物胺
圖3 不同溫度下發酵葡萄酒對氨基甲酸乙酯和生物胺的影響
Fig.3 Effect of wine fermentation at different temperatures on ethyl carbamate and biogenic amines

2.2.1.2 不同接種量的影響

由圖4可知，接種量不同，氨基甲酸乙酯和生物胺含量也會不同。各組間具有極顯著差異(P<0.01)。接種量大，酵母代謝旺盛，產生的氨基甲酸乙酯也會增多，氨基甲酸乙酯形成受接種量的影響較小。接種量增大后，發酵后期酵母菌自溶解體量就會增大，生物胺含量隨之升高，與王瑞等[25]研究結果一致。

a-氨基甲酸乙酯；b-生物胺
圖4 不同接種量下發酵葡萄酒對氨基甲酸乙酯和生物胺的影響
Fig.4 Effect of fermented wine on ethyl carbamate and biogenic amines under different inoculums

2.2.1.3 不同pH值的影響

由圖5可知，pH在2.3～4.3，氨基甲酸乙酯與pH值呈正相關，各組間差異極顯著(P<0.01)。但是pH值比較低的葡萄酒中氨基甲酸乙酯形成速率稍高，這也證明了氨基甲酸乙酯形成了酸催化機制[26]。

a-氨基甲酸乙酯；b-生物胺
圖5 不同pH值下發酵葡萄酒對氨基甲酸乙酯和生物胺 的影響
Fig.5 Effect of fermented wine on ethyl carbamate and biogenic amines at different pH

氨基酸脫羧酶是影響生物胺含量的重要因素， pH值與生物胺含量呈正相關，各組差異極顯著(P<0.01)。pH值越低，氨基酸脫羧酶活性也隨之降低，從而影響生物胺含量。此結論與張無疾等[27]研究結果一致。

2.2.2 高糖發酵對氨基甲酸乙酯和生物胺的影響

由表1可知，高糖發酵導致酒精度升高，酒精度可達17.60 %vol，而由新鮮葡萄釀造的葡萄酒酒精度只在12.8 %vol。經過方差分析，差異極顯著(P<0.01)，酒精度對氨基甲酸乙酯的形成影響較大，因為酒精是氨基甲酸乙酯的前體物質，外源性尿素及代謝產生的尿素與乙醇相互作用，可以生成氨基甲酸乙酯[28]。說明不同糖度葡萄酒發酵對氨基甲酸乙酯含量影響較大。

表1 不同糖度下發酵葡萄酒對氨基甲酸乙酯的影響Table 1 Effect of wine fermentation on ethyl carbamate under different sugar degrees

注：表中不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)

由表2可知，高糖發酵后的葡萄酒生物胺含量大于新鮮葡萄發酵的葡萄酒。通過方差分析，組間差異極顯著(P<0.01)，在釀造過程中，陰晾干化過的葡萄果實氨基酸濃度要高于新鮮果實，導致生物胺含量增多。說明不同酒精度對葡萄酒蘋果酸-乳酸發酵后生物胺含量影響較大。

表2 不同酒精度下葡萄酒蘋果酸-乳酸發酵對生物胺的影響Table 2 Effect of malolactic fermentation on biogenic amines in wine with different alcohol degrees

注：-表示未檢出

2.3 蘋果酸-乳酸發酵對葡萄酒中氨基甲酸乙酯和生物胺的影響

2.3.1 不同發酵條件對葡萄酒中氨基甲酸乙酯的影響

2.3.1.1 發酵溫度的影響

由表3可知，在蘋果酸-乳酸發酵過程中，氨基甲酸乙酯有所增加。經過方差分析發現，精氨酸、瓜氨酸、尿素、氨基甲酸乙酯各組間呈現顯著差異性(P<0.01)。一方面，乳酸菌的精氨酸脫亞胺反應，產生較多的瓜氨酸釋放到葡萄醪中[29]。另一方面，是氨基甲酸乙酯形成的延續，而且溫度高反應速度加快。

表3 不同發酵溫度對氨基甲酸乙酯的影響Table 3 Effect of different fermentation temperature on ethyl carbamate

2.3.1.2 接種量的影響

經過方差分析發現，精氨酸、瓜氨酸、尿素、氨基甲酸乙酯各組間呈現顯著差異性(P<0.01)。由表4可知，接種量大，乳酸菌生物量增多，發酵速度加快，精氨酸消耗加快，氨基甲酸乙酯的量有所增加。

表4 不同接種量對氨基甲酸乙酯的的影響Table 4 Effect of different inoculation amount on ethyl carbamate

2.3.2 不同發酵條件對葡萄酒中生物胺的影響

2.3.2.1 不同發酵溫度的影響

葡萄酒中的生物胺除了少量來自于葡萄果實外，主要來自蘋果酸-乳酸發酵過程。由表5可知，發酵溫度為18～21 ℃時，乳酸菌生長最適宜，產生不同的脫羧酶作用于相對應的氨基酸，氨基酸開始脫去羧基生成相應的生物胺[30]。溫度較高時，脫羧酶的活性增強，脫羧反應增強產生較多的生物胺，另外還有可能在接近發酵結束時乳酸菌部分解體產生。各組間差異極顯著(P<0.01)，不同溫度發酵對葡萄酒中生物胺的影響較大。

表5 不同溫度發酵對葡萄酒中生物胺的影響 單位：mg/L

2.3.2.2 接種量的影響

由表6可知，生物胺含量受接種量的影響。根據方差分析結果得出，不同接種量間差異極顯著(P<0.01)。接種量大，乳酸菌生物量大，繁殖速度加快，所產生的脫羧酶相應增多，生物胺的形成的量也愈大，但是接種量過大，使乳酸菌呼吸過快生長受抑制，生物胺不會大幅度增大[31]。

表6 不同接種量發酵對葡萄酒中生物胺的影響 單位：mg/L

3 結論

伴隨著我國經濟的蓬勃發展，葡萄酒已經成為大眾葡萄消費品。但是，近年來研究者發現葡萄酒中含有氨基甲酸乙酯和生物胺，這些物質如果超過一定量會對人體有毒害作用。氨基甲酸乙酯是由精氨酸代謝中間產物尿素進一步代謝與乙醇自發反應生成。生物胺是在氨基酸脫羧酶作用下，氨基酸脫羧而形成。

本研究發現，不同酵母菌對葡萄酒中氨基甲酸乙酯的影響不同，大部分酵母菌酒精發酵時不產生生物胺。高溫、高糖、高接種量進行酒精發酵都會增加氨基甲酸乙酯的含量。在蘋果酸-乳酸發酵時，高接種量和高溫發酵直接導致生物胺含量增高，也會間接使氨基甲酸乙酯增加。