開菲爾發酵過程中風味物質動態變化

古麗加馬力·艾薩，邢軍，馬龍，李安，張瑞*

1(新疆特殊環境物種保護與調控生物學實驗室，新疆師范大學 生命科學學院，新疆 烏魯木齊，830054) 2(新疆大學 生命科學與技術學院，新疆 烏魯木齊，830046)

開菲爾是以新鮮牛乳為原料，經過接種傳統開菲爾粒發酵劑形成的乳制品。由于其獨特的風味，純正的口味和潛在的益生功能，受到越來越多人的歡迎[1-5]。從化學角度來看，發酵乳是一種復雜的凝膠系統，含有蛋白質，多糖和脂質，其主要品質特征是質地、味道和風味[6-9]，風味是開菲爾制品中重要的品質之一，其中風味物質的種類及其含量決定了產品的品質。隨著人們生活水平的提高，人們對發酵乳制品風味的要求越來越高，其中發酵乳的風味已成為食品生產者和消費者關注的問題[10-14]。發酵乳的風味物質有3個主要來源：由原料奶形成的揮發性化合物、經過殺菌發酵等加工形成的化合物、發酵乳中各種微生物的代謝物質[15-16]。近年來，國內外學者利用現代生物化學與色譜學技術對發酵乳風味進行了研究[2-6]，但目前國內外學者大多對開菲爾及發酵乳風味進行了研究，對于不同發酵階段風味物質動態變化的相關研究工作未能展開。

在本文中，項目組采集了新疆阿勒泰地區牧民家里的手工開菲爾制品，在實驗室中制備分離了開菲爾粒并采集了發酵時間從0～120 h的開菲爾樣品，使用GC-MS技術來分析在發酵過程中開菲爾的風味組分及相應峰面積變化，分析了風味物質種類的差異和含量的動態變化，為傳統開菲爾的品質控制和風味改良提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

取自新疆阿勒泰地區牧民家中傳統手工制作的傳統開菲爾粒(編號為ALT)，試劑盒冷凍保藏運至實驗室-80 ℃冰箱保存備用。

Agilent 190 91 N-136 HP-INNOWax氣相色譜-質譜儀，色譜柱為HP-5毛細管柱(60 m×250 μm×0.25 μm)，美國安捷倫公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 傳統開菲爾活化

傳統開菲爾活化流程如下：

開菲爾粒→粉碎→過40目篩→溫水30 ℃泡洗3次→按質量比1∶5加入30 ℃水打漿→均質→按1∶10質量比接種在25 ℃已滅菌牛乳中→25 ℃培養24 h→過濾獲得開菲爾粒→重復上述活化培養次數3～5次→過濾獲得發酵用開菲爾粒

1.2.2 發酵開菲爾樣品

將活化完成的開菲爾粒加入到裝有已殺菌牛乳的發酵瓶中25 ℃發酵，取剛接種開菲爾粒的牛乳為發酵0 h樣品，-80 ℃冰箱冷凍備用。依次取發酵24、48、72、96、120 h時間點發酵樣品至-80 ℃冰箱冷凍備用，每一個時間點取3個平行樣，共18個樣品進行后續實驗。

1.2.3 發酵開菲爾樣品

樣品的前處理用無菌注射器分別吸取0、24、48、72、96、120 h發酵乳各5 mL轉入20 mL的頂空瓶內，同時加入2 g NaCl，加蓋密封。樣品預孵化10 min，然后用萃取頭吸附30 min，即可進樣解吸。揮發性風味物質定性方法采用與NIST譜庫進行比較，同時使用保留指數進行定性分析；定量方法采用峰面積歸一化法。

GC條件:HP-INNOWax毛細管色譜柱(60 m×250 μm×0.25 μm)0～260 ℃(270 ℃)；氣化室溫度250 ℃；輔助加熱器溫度280 ℃；升溫程序為起始溫度50 ℃以10 ℃/min升溫到90 ℃，最后以4 ℃/min升至240 ℃，保持20 min；載氣為高純 He；流速0.8 mL/min；分流比100 ∶1。

MS條件:電離方式為EI；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四級桿溫度150 ℃；傳輸線溫度280 ℃；質量掃描范圍50～500m/z；全掃描；溶質延遲0 min；調諧文件為標準調諧。

頂空參數：7 697 A(Agilent)；加熱箱溫度150 ℃；定量環溫度170 ℃；傳輸線溫度180 ℃；樣品平衡時間40 min；進樣持續時間1 min；GC循環時間65 min；樣品瓶體積20 mL；樣品量2 mL。

1.2.4 感官評定

本實驗邀請實驗室無經驗型感官評價人員8名，有經驗型感官評價人員2名組成評定小組，實驗前對評價人員進行培訓，明確感官評價指標體系及評價方法。每次評定由每個評定員單獨進行，相互不接觸，樣品隨機編號進行盲標，評定之間用純凈水漱口，選取色澤，氣味，組織狀態，口感4個主要影響因素，分別對發酵0、24、48、72、96、120 h時間點樣品進行感官簡單描述檢驗。

2 結果與分析

2.1 發酵初期(0 h)風味物質檢測結果

如圖1所示，發酵前期，GC-MS檢測的樣品中有26種揮發性風味物質，包括3種烴類、5種酸類、6種酯類、6種酮醛類、2種呋喃類和3種其他類物質，其中酯類物質種類最多。峰面積最多的物質是8.000 min出峰的4-(羥甲基)咪唑(18.583%)、8.371 min出峰的斯皮羅[2,4]七氯-4,6-二烯烴(2.108%)、18.477 min出峰的十八碳-6,9-二烯酸乙酯(1.880%)和(Z,Z)-9,12-十八烷二烯酸乙酯(1.880%)、18.367 min出峰的棕櫚酸(1.390%)。發酵前期酯類物質累計峰面積為(5.097%)、酸類物質累計峰面積為(2.397%)、烴類物質累計峰面積為(2.522%)、酮醛類物質累計峰面積為(2.187%)，其中酯類物質優勢明顯。

感官評價結果為樣品為乳白色均勻液體，黏度較小，在透明玻璃杯內搖動，可以肉眼看到微小開菲爾粒發酵劑顆粒，口感細膩，具有鮮乳特有滋氣味，可說明此階段樣品尚未發酵。

圖1 開菲爾發酵前期(0 h)GC-MS譜圖
Fig.1 GC-MS spectrum of the initial fermentation of Kefir fermented milk

2.2 發酵前期(24 h)風味物質檢測結果

如圖2所示，發酵24 h時，GC-MS檢測的樣品中有20種揮發性風味物質，包括6種酸類，2種醛類，1種酮類，4種酯類，3種烴類，4種其他類物質。最高峰面積為8.122 min出峰的4-(羥甲基)咪唑(55.304%)、8.483 min出峰的2-丁炔-二乙基-乙縮醛(36.033%)、7.040 min出峰的-二芐氧基-L-酒石酸酐(12.04%)和17.070 min出峰的糠酸(3.524%)。

感官評價結果為樣品質地較均勻，為乳白色溶膠，黏度增大，基本不分層，在透明玻璃杯內搖動，有少量上清乳清析出，品嘗后口感細膩，具有明顯酸味，具有乳的滋氣味但是風味不濃郁，可說明此階段樣品正在發酵，處于發酵初期階段。

圖2 開菲爾發酵初期(24 h)GC-MS譜圖
Fig.2 GC-MS spectrum of the initial fermentation of Kefir fermented milk

2.3 發酵中期(48 h)風味物質檢測結果

如圖3所示，在發酵進入第2天時，GC-MS檢測結果顯示共有33種揮發性物質，9種酯類，6種酸類，5種醇類，3種烴類，5種酮醛類和5種其他類物質。最高峰面積為18.522 min出峰的5-氧代四氫呋喃-2-羧酸(3.046%)、8.011 min出峰的3,3-二異丙基-N-甲基雜氮環丁烷-2,4-二酮(2.599%)、17.236 min出峰的苯并呋喃-6,7-二醇(2.541%)和19.471 min出峰的甲基3-O-苯甲基-α-D-呋喃葡糖苷5,6-碳酸鹽(1.532%)、18.480 min出峰的5-羥甲基糠醛(1.532%)、15.069 min出峰的乙酰氧基乙酸，2-萘基酯(1.579%)、18.148 min出峰的棕櫚油酸(1.041%)、9.869 min出峰的庚酸(1.002%)。

感官評價結果為樣品質地均勻，為乳白色溶膠，黏度增大有凝固感，無明顯分層，有部分乳清析出，品嘗后口感細膩，具有明顯酸味，具有發酵乳特有的滋氣味，風味不夠濃郁，說明此階段樣品持續發酵，按照品嘗風味判斷處于發酵中期階段。

圖3 開菲爾發酵中期(48 h)GC-MS譜圖
Fig.3 Mid-term GC-MS spectrum of Kefir fermented milk fermentation

2.4 發酵后期(72 h)風味物質檢測結果

如圖4所示，發酵進入第3天時，檢測樣品中的揮發性風味物質，共檢測出51種風味物質，包括16種酯類，12種酸類，4種烴類，3種醛類，3種酮類，2種醇類，11種其他類物質。最高峰面積為4.971 min出峰的7，9-十八二酸甲酯(40.008%)、18.403 min出峰的棕櫚酸(29.204%)、8.012 min出峰的3，3-二異丙基-5-甲基沸石-2，4-二酮(23.508%)、11.663 min出峰的乙酰氧基-2-甲基-吡喃-4-酮(23.508%)、7.761 min出峰的正戊酸(22.898%)、17.235 min出峰的苯甲酸甲酯(20.465%)、4.706 min出峰的1-戊烯-3-醇(13.739%)、5.515 min出峰的9，11-十八二酸甲酯(8.675%)、7.570 min出峰的1，3-丙二醇，2-甲基-二丙酸酯(8.222%)、5.461 min出峰的8，10-十八二酸甲酯(6.431%)、7.358 min出峰的苯甲酸，3，5-二氟苯基酯(6.147%)、12.123 min出峰的油酸(5.393%)，10.209 min出峰的肉豆蔻酸(5.219%)。

感官評價結果為樣品質地均勻，為乳白色凝膠，黏度適中具有發酵酸乳應有的黏度，無明顯分層，無明顯凝塊，有少量乳清析出，在透明玻璃杯內搖動，有部分乳清析出，品嘗后口感細膩，具有發酵酸乳特有的滋氣味及芳香氣味，風味濃郁，可說明此階段樣品持續發酵，按照品嘗風味判斷處于發酵后期階段。

圖4 開菲爾發酵中期(72 h)GC-MS譜圖
Fig.4 Mid-term GC-MS spectrum of Kefir fermented milk fermentation

2.5 發酵末期(96 h)風味物質檢測結果

如圖5所示，發酵進入96 h時，檢測樣品中的揮發性風味物質共檢測出18種揮發性風味物質，包括9種其他類物質、5種酯類、4種酸類。最高峰面積為硬脂酸在18.965 min出峰(2.684%)、正十五酸在13.270 min出峰(0.949%)、己酸在9.868 min出峰(0.835%)、β-桉葉油醇在5.557 min出峰(0.831%)。

感官評價結果為樣品出現分層現象，伴有顆粒狀凝膠懸浮，大量乳清析出，在透明玻璃杯內搖動，有少量氣泡產生，品嘗后酸感較重，具有發酵酸乳特有的濃郁氣味，綜合口感風味品質變劣，可說明此階段樣品持續發酵，按照品嘗風味判斷處于發酵末期階段。

圖5 開菲爾發酵后期(96 h)GC-MS譜圖
Fig.5 Later period GC-MS spectrum of Kefir fermented milk fermentation

2.6 發酵末期(120 h)風味物質檢測結果

由圖6可知，在120 h風味物質種類和峰面積又增加了。一共有38種揮發性風味物質在樣品中被檢測到，包括11種酸、11種酯、5種烴類、5種酮醛類、3種醇類和3種其他類物質。最高峰面積為7.805 min出峰的戊酸(41.291%)，在18.281 min出峰的棕櫚酸(16.699%)，在5.545 min出峰的1,3-雙(肉桂酰氧基甲基)金剛烷(2.554%)。

感官評價結果為樣品出現明顯分層，伴有固體顆粒析出，顆粒黏連在發酵管壁上，大量乳清析出，在透明玻璃杯內搖動，有少量氣泡產生，品嘗后酸感較重，具有酸乳發酵過度特有的刺鼻酸味及濃郁氣味，部分氣味具有不良發酵感受，不易令人接受，綜合口感風味品質變劣，可說明此階段樣品持續發酵，按照品嘗風味判斷處于發酵末期階段。

圖6 開菲爾發酵末期(120 h)GC-MS譜圖
Fig.6 GC-MS spectrum of Kefir fermented milk during fermentation

2.7 開菲爾發酵過程中風味物質變化

如圖7所示，酸類風味物質在開菲爾發酵過程中逐漸增加，72 h達到高峰，發酵制品酸味穩步增加。在發酵前期、中期檢測到的酸類物質分子量較大，難于揮發，發酵后期、末期開始出現低分子量有機酸類如戊酸、糠酸與己酸等，因此發酵制品在發酵72 h后具有明顯酸味。發酵120 h后隨著丙酸等低級有機酸的大量產生，發酵制品開始出現不良刺激性酸味。結合感官評價，發酵終點已至。

酯類風味物質在開菲爾中穩定增加，72 h達到高峰，在發酵前期、中期檢測到多為16個碳原子以上的的酯類物質，在常溫中易揮發，發酵中后期小于7個碳原子的酯類物質開始出現，并逐漸增加。如48 h檢測到的丙烯酸乙酯、呋喃-乙酯類物質等。72 h小于7個碳原子的酯類物質種類開始增多，此時感官評價開菲爾發酵乳制品風味較好。96 h檢測的酯類物質種類急劇減少，主要為大于16個碳原子的酯。120 h小于7個碳原子的酯類物質開始出現，并急劇增加，風味濃郁[17]。

在開菲爾中，發酵前期檢測到6種酮醛類物質，主要為乳制品特有風味物質。如糠醛、呋喃醛等。隨著發酵的進行主要酮醛類物質持續增加，72 h達到高峰，糠醛、二酮類化合物含量較高，發酵制品開始呈現良好風味[18]。

烴類物質在開菲爾發酵過程中穩定存在，變化不大但其對發酵制品風味具有一定影響。例如發酵前期至后期檢測到的3-氨基苯乙炔是重要的有機合成中間體[19]。

在開菲爾中，醇類物質在發酵中期開始出現，因而一般含酒精的發酵乳制品可以控制此時為發酵終點。主要醇類物質包括1-己烯-3-醇、苯乙醇和麥芽醇等都是重要的香味中間體，可以呈現較為獨特的芳香氣味，對開菲爾發酵乳制品風味具有一定作用[20-21]。

開菲爾發酵過程中還產生除上述幾類風味物質外的其他類化合物，如呋喃類，半乳糖糖苷類物質等，還有少量未定物質，在發酵初期、前期有吡嗪、2-乙酰基呋喃、4-(羥甲基)咪唑等物質，它們是香料中間體參與風味物質的反應。在發酵末期120 h時檢測含有丙酸酐、吲哚等物質，它們有惡臭、糞臭味，與發酵末期感官評價味道相吻合。

圖7 開菲爾發酵過程中主要風味物質變化
Fig.7 Change of main flavor substances during Kefir fermentation

3 討論與結論

酯類化合物是發酵乳中的一類重要揮發性化合物，主要是通過脂肪酸水解和微生物代謝產生。發酵乳中的酯類化合物的風味閾值較低，低濃度的酯類化合物對發酵乳風味的貢獻較大。一般來說，對發酵乳的風味影響較大的酯類化合物主要是一些分子質量較低的酯，如乙酸甲酯、乙酸乙酯等。在新鮮的發酵乳中發現微量的乙酸乙酯，在發酵乳貯藏30 d后才檢測到乙酸乙酯，且隨著貯藏時間的延長，乙酸乙酯的濃度呈上升的趨勢[9-11]。大多數酯類化合物具有水果和花香味，能降低脂肪酸和胺帶來的苦味和其他異味[22-24]。開菲爾發酵過程中，棕櫚酸乙酯、油酸乙酯、7，9-十八二酸甲酯含量變化如圖8-a所示。

醛是牛奶中重要的香味物質，過量的乙醛會帶來青草氣味。醛化合物是發酵乳風味物質中比例較低屬于跟蹤香氣成分，但對發酵乳的風味組合物有重要的影響。本研究中3-糠醛多次出現在發酵過程中，提供苦杏仁味香氣，是重要的風味物質中間體[22]。酮類化合物多是由不飽和脂肪酸的氧化、熱降解，氨基酸降解或微生物代謝產生[23]。開菲爾發酵過程中，3-糠醛，2-丁炔-二乙基-乙縮醛和3，3-二異丙基-N-甲基沸石-2，4-二酮含量變化如圖8-b所示。

發酵初期優勢酸類物質主要是棕櫚酸，發酵前期開始出現癸酸、糠酸等飽和脂肪酸，開菲爾制品風味開始產生，發酵中期時，苯甲酸，棕櫚油酸和庚酸所占比重逐漸增大，開菲爾制品特有風味開始出現，發酵后期，棕櫚酸，正戊酸，月桂酸，肉豆蔻酸，油酸成為優勢酸類物質，其中棕櫚酸含量達到最高，開菲爾制品風味濃郁，口感細膩具有發酵酸乳特有的滋氣味及芳香氣味，發酵96 h達到末期時，酸類物質減少，主要是硬脂酸和己酸，開菲爾制品風味濃郁，酸感較重，但是總體口感風味品質劣變，發酵120 h時戊酸、棕櫚酸、丙酸是最主要的酸類物質，酸感較重，具有酸乳發酵過度特有的刺鼻酸味及濃郁氣味，部分氣味具有不良發酵感受，不易令人接受，綜合口感風味品質劣變。開菲爾發酵過程中，代表性酸類物質，棕櫚酸、糠酸、癸酸含量變化如圖8-c所示。

麥芽醇具有焦糖香，在稀溶液中有草莓香。發酵乳中重要的醇類化合物是乙醇，乙醇是葡萄糖和氨基酸代謝的最終產物。一般發酵乳中乙醇的含量較高，在0.2～9.9 mg/kg，而酸羊奶中乙醇的含量普遍低于酸牛奶中乙醇的含量[22， 25]。開菲爾中醇類物質在發酵中期開始出現，因而一般含酒精的發酵乳制品可以控制此時為發酵終點。主要醇類物質包括1-己烯-3-醇、苯乙醇和麥芽醇等，都是重要的香味中間體，可以呈現較為獨特的芳香氣味，對開菲爾發酵乳制品風味具有一定作用[20-21,25]。開菲爾發酵過程中，麥芽醇、苯丙醇含量變化如圖8-d所示。

本研究中，開菲爾發酵乳全發酵過程中中共檢測得到18種烴類化合物,開菲爾發酵乳發酵期間3-氨基苯乙炔，1-乙氧基-1-甲基環丁烷，乙基三甲基硅烷和1，3-雙(肉桂酰氧基甲基)金剛烷等含量較大，烴類物質在開菲爾發酵過程中穩定存在，變化不大但其對發酵制品風味具有一定影響。例如發酵前期至后期檢測到的3-氨基苯乙炔是重要的有機合成中間體[19]。開菲爾發酵乳全發酵過程中共檢測得到34種其他類化合物，發酵過程中優勢物質為4-(羥甲基)咪唑，發酵后期時，呋喃，吲哚等物質開始增多。

開菲爾中風味物質的來源主要有3種途徑，原料乳中的成分、加工過程中產生的風味物質及開菲爾中微生物代謝產生的風味物質。因此，研究開菲爾發酵過程中風味物質動態變化規律，使我們對開菲爾生產的工藝技術進行了規范，不同的風味物質產生意味著生產處于不同的階段，能夠更好地指導生產實踐，同時也揭示了新疆地區開菲爾的獨特風味產生的緣由，對于今后產品風味改善以及風味的調配組合提供了理論依據，還能夠對開菲爾制品的部分營養功能性進行分析，使今后可能的應用型生產實踐根植于理論研究之上。本文應用頂空-氣相色譜-質譜聯用技術對新疆地方特色發酵乳制品開菲爾發酵過程中的揮發性風味物質動態變化規律進行了分析，結果表明此方法快速便捷，可以對新疆地方特色發酵乳制品開菲爾中的揮發性風味物質的成分含量進行有效的分析。

a-開菲爾發酵過程中優勢酯類物質含量變化;b-開菲爾發酵過程中優勢醛酮類物質含量變化;c-開菲爾發酵過程中優勢酸類物質含量變化; d-開菲爾發酵過程中優勢醇類物質含量變化
圖8 開菲爾發酵過程中優勢風味物質含量變化
Fig.8 Changes in the content of dominant flavor substances during Kefir fermentation

通過GC-MS鑒定結果分析，新疆特色發酵乳制品開菲爾風味物質鑒定結果中揮發性風味物質主要有6類，包括醇類、酮醛類、有機酸類、呋喃類、酯類和烷烴類，其中棕櫚酸、糠酸、癸酸、糠醇、3-糠醛、麥芽醇等為優勢風味物質，可以為今后研究新疆地方特色發酵乳制品開菲爾中的揮發性風味物質指紋圖譜提供參考依據。