響應面法優(yōu)化黃精葉多糖水提工藝

楊朝君， 嚴 培， 羅 禹， 穆怡含， 劉明坤， 高 平

(1.四川大學生命科學學院生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室， 成都 610065; 2.西南醫(yī)科大學藥學院， 瀘州 646000； 3.瀘州市森奧中藥材有限公司， 瀘州 646000)

1 引 言

中藥黃精(PolygonatumRhizoma)為百合科植物滇黃精(Polygonatumkingianum)、黃精(Polygonatumsibiricum)或多花黃精(Polygonatumcyrtonema)的干燥根莖[1-3]. 主要分布于四川、云南、貴州和陜西等地[4]. 研究表明，黃精中含有多種生物活性成分，如多糖、甾體皂苷、黃酮、植物甾醇、揮發(fā)油等[5]. 其中，多糖為黃精中主要藥效成分之一，具有降血脂血糖、增強免疫力、抗氧化、抗腫瘤、耐疲勞、耐缺氧等多種藥理作用[6-7]，具有較高醫(yī)療保健價值. 目前，大多數(shù)的研究主要圍繞黃精根部開展，而黃精葉等地上部分卻未得到充分開發(fā)利用，相關研究也未見報道. 生產(chǎn)實踐表明，采集一噸黃精根部藥材會產(chǎn)生約400 kg莖葉的副產(chǎn)物，一般做丟棄處理，既浪費資源又污染環(huán)境. 因此，為有效提高黃精藥材的綜合利用價值，獲取更大的經(jīng)濟收益，對黃精葉化學成分的相關研究極有必要[8].

目前提取植物多糖的研究中多采用溶劑提法、超聲波輔助溶劑提取法、微波輔助溶劑提取法、超聲-微波協(xié)同提取法、酶解法、超臨界流體萃取法等[9-12]. 而溶劑提取法是從植物中提取多糖的常用方法，在所有溶劑中，水是典型的強極性溶劑，對植物組織的穿透力強，提取效率高，在生產(chǎn)上使用安全被廣泛應用[12]. 此外，響應面法[13](Response Surface Methodology，RSM)是一種綜合試驗設計和數(shù)學建模的優(yōu)化方法,可有效減少試驗次數(shù)，通過分析響應面圖的陡峭程度和等高線圖的疏密度，可判別在最優(yōu)條件下不同變量的取值和所產(chǎn)生交互作用. 在提取試驗中RSM應用廣泛且高效，Shen等[10]通過RSM法設計優(yōu)化了云南重樓葉多糖的提取條件，實驗收率54.18%；張麗等[14]通過RSM法優(yōu)化黃精莖稈中總多糖、總皂苷、總黃酮的超聲提取工藝；Han等[15]通過RSM法優(yōu)化了構(gòu)樹多糖最佳提取條件，多糖得率為8.61%.

本實驗以黃精葉為研究對象，建立Box-Behnken[16]中心組合設計，首先通過單因素實驗得到溫度等影響因子的最佳實驗值，然后通過模擬二次回歸模型，分析提取時間、提取次數(shù)、料液比之間的交換作用以及對黃精葉出膏率和多糖得率的影響，從而高效的確定最優(yōu)提取工藝條件. 本實驗對黃精葉多糖進行研究，為研究黃精葉多糖藥用價值，提高黃精綜合利用率及后續(xù)產(chǎn)品的開發(fā)提供理論基礎.

2 材料與方法

2.1 材 料

2.1.1 實驗材料 黃精葉(瀘州森奧中藥材有限公司)，產(chǎn)地四川瀘州市敘永縣，為多花黃精. 對照品D-無水葡萄糖(成都植標化純生物技術(shù)有限公司).

2.1.2 試 劑 濃硫酸、乙醇(成都市科隆化學品有限公司)和蒽酮(上?？曝S實業(yè)有限公司). 所有的化學試劑都是分析級.

2.1.3 儀 器 精密電子天平(BSA124S，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；機械超聲波清洗機(北京科璽世紀科技有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(DK-S22，上海精宏實驗設備有限公司)；紫外分光光度計721型(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)；電熱鼓風干燥箱(101-O，上海陽光實驗儀器有限公司)；手提式高速萬能粉碎機(DFT-200，溫嶺市林大機械有限公司).

2.2 實驗方法

2.2.1 標準曲線繪制 取葡萄糖標準品適量，105 ℃烘干至恒重，精密稱定，置于100 mL容量瓶中, 用蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得. 精密量取對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，分別置于10 mL具塞刻度試管中，各加蒸餾水水至2.0 mL，搖勻, 在冰水浴中緩慢滴加0.2%蒽酮-硫酸溶液至刻度，混勻，放冷后置水浴中保溫10 min，取出，立即置冰水浴中冷卻10 min，取出. 以相應試劑為空白，采用紫外-可見分光光度法[17]，在最大吸收波長下測定吸光度.以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線得回歸方程為：Y=1.982 3x-0.003 8 (r2=0.9991).結(jié)果表明，在此濃度范圍內(nèi)葡萄糖溶液濃度與吸光值呈良好的線性關系，見圖1.

2.2.2 黃精多糖的測定 取黃精藥材的葉，在40～50℃恒溫干燥箱中干燥，粉碎，過40目篩. 精確稱重3 g黃精葉粉末，蒸餾水浸提，過濾，精密吸取濾液1 mL，用蒸餾水稀釋150倍后，精密吸取0.6 mL至10 mL刻度試管，加蒸餾水補足至2.0 mL，按《中華人民共和國藥典》2015版一部(306頁)，在582 nm測定吸光度[2]，根據(jù)以下公式計算黃精葉多糖含量.

式中：W為黃精葉多糖含量(%)；C為樣品溶液多糖質(zhì)量濃度 (mg/mL)；V為樣品定容體積 (mL)；M為原料質(zhì)量 (g).

2.2.3 單因素試驗 影響黃精葉多糖提取的因素很多，其中經(jīng)預實驗，選擇提取溫度(4、20、40、60、70、80、100 ℃)、提取時間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h)、液料比(5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、40∶1 mL/g).

2.2.4 響應面設計 應用Design-Expert11軟件進行 Box-Behnken實驗設計，研究分析了提取溫度(X1)、提取時間(X2)、液料比(X3)這3個參數(shù)之間的相互作用對藥材出膏率(Y)、黃精葉多糖得率(K)所產(chǎn)生的影響. 試驗因素與水平設計見表1.

表1 響應面因素與水平

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗結(jié)果與分析

3.1.1 提取溫度對黃精葉多糖提取率的影響 固定多糖的液料比15∶1，提取時間2.0 h，考察提取溫度對多糖提取率的影響，見圖2. 隨溫度升高，在40～70 ℃之間，多糖提取率增加，80 ℃之后，隨溫度上升提取率有下降趨勢. 可能與加溫不適影響多糖穩(wěn)定性有關. 從實驗結(jié)果及節(jié)能方面考慮，選取70 ℃為最佳提取溫度.

3.1.2 提取時間對黃精葉多糖提取率的影響 固定多糖的提取溫度為70 ℃，液料比15∶1，考察提取時間對多糖提取率的影響，見圖3. 在0.5～2.0 h內(nèi)，多糖提取率與時間的增加成正比，而2.0～3.5 h之間提取率沒有明顯變化，總體呈下降趨勢. 時間的增加可能會導致多糖受熱過高降解從而降低多糖提取率，為縮短提取時間節(jié)省能耗，提取時間選取1.5 h為宜.

圖2 提取溫度對黃精葉多糖提取率的影響

Fig.2 The temperature impacts on extracting polysaccharides from leaves of polygonatum

圖3 提取時間對黃精葉多糖提取率的影響

Fig.3 The time impacts on extracting polysaccharides from leaves of polygonatum

圖4 液料比對黃精葉多糖提取率的影響

Fig.4 The liquid-material ratio impacts on extracting polysaccharides from leaves of polygonatum

3.1.3 液料比對黃精葉多糖提取率的影響 固定多糖的提取溫度為70 ℃，提取時間為2.0 h，考察液料比對多糖提取率的影響，見圖4. 液料比在5∶1 ～15∶1之間，多糖提取率顯著增加，在15∶1～40∶1之間時提取率沒有明顯變化. 可能由于干燥的黃精葉需吸收較多的水分，待充分浸潤后才易于多糖溶出. 因此，從實驗結(jié)果及節(jié)能方面考慮，選擇15∶1為最佳液料比.

3.2 黃精葉出膏率Box-Behnken響應面實驗設計及實驗結(jié)果

響應值指標為黃精葉出膏率(Y)，預測值為(Y′)，見表2.

表2 黃精葉出膏率的響應面設計及結(jié)果

Tab.2 The design and results of RSM test for extract yield of leaves of polygonatum

序號X1X2X3Y(出膏率,%)Y'(預測值,%)1-1-1042.7542.892-10144.1844.283-10-143.1943.104-11045.6745.5150-1-144.0043.9460-1145.3345.08700047.5047.57800047.2747.57900047.7347.571000047.3747.571100048.0047.571201-145.9746.221301145.5745.63141-1045.8345.991510145.1745.261610-146.0045.901711046.3346.19

表3 黃精葉出膏率的回歸模型的方差分析

Tab.3 The variance analysis results of regression mode for extract yield of leaves of polygonatum

來源平方和自由度均方F值P值模型38.4694.2749.62<0.000 1**X17.1117.1182.51<0.000 1**X23.9613.9646.000.000 3**X30.148 510.148 51.720.230 5X1X21.4611.4617.000.004 4**X1X30.828 110.828 19.610.001 73**X2X30.748 210.748 28.690.021 5*X129.5519.55110.84<0.000 1**X223.5913.5941.670.000 3**X328.6518.65100.42<0.00 01**殘差0.602 970.086 1--失擬項0.257 630.085 90.994 50.480 8純誤差0.345 340.086 3--總變異39.0716---R20.984 6----Adj R20.964 7----Pred R20.880 7----精密度20.793 2----C.V.%0.645 1----

注：**表示極顯著P<0.01;*表示顯著P<0.05；R2為判定系數(shù)校正值；AdjR2為判定系數(shù)預測值； C.V.為變異系數(shù)

擬合全變量二次回歸方程Y=45.57+0.9425×X1+0.7038×X2+0.1363×X3-0.6050×X1X2-0.4550×X1X3-0.4325×X2X3-1.51×X12-0.9233X22-1.43×X32. 本模型的F值為49.62，P值<0.01，極顯著，說明本模型具有顯著性；失擬項的P值為0.4808，不顯著，說明所建立模型擬合程度好. 相關系數(shù)R2=0.9846，AdjR2=0.9647，證明模型的實際值與預測值之間相關性好. 結(jié)果表明X1、X2對Y的影響極顯著，X3對Y影響不顯著. 三因素之間兩兩的交互作用對Y影響顯著，二次項X12、X22、X32對Y極顯著. 根據(jù)數(shù)據(jù)方差分析結(jié)果，三因素對Y的影響大小排序為X1>X2>X3，見表3.

圖5 各因素交互作用對黃精葉多糖出膏率影響

Fig.5 The interaction of various factors impacts on extract yield from leaves of polygonatum

由圖5(a)(b)可以看出X1的響應面相對陡峭，等高線較密集，X2和X3的響應面相對平緩，等高線稀疏，說明X1對Y的影響比X2和X3更顯著. 由圖5(c)可知，X2的響應面相對陡峭，等高線較密集，X3的響應面相對平緩，等高線稀疏，說明X2對Y的影響比X3更顯著. 上述結(jié)果與方差分析結(jié)果(表3)表現(xiàn)一致.

3.3 黃精葉多糖得率

響應值指標為黃精葉多糖得率(K)預測值為(K′)，見表4.

表4 黃精葉多糖得率的響應面分析及結(jié)果

Tab.4 RSM analysis and results for polysaccharide yield of leaves of polygonatum

序號X1X2X3K(多糖得率,%)K'(預測值,%)1-1-105.7575.692-1016.2806.373-10-16.2996.344-1106.7256.6650-1-16.2986.3360-115.5505.5370007.1107.1780007.2007.1790007.1807.17100007.2337.17110007.1427.171201-16.4006.42130116.9106.88141-106.1606.22151016.4806.441610-16.9156.82171106.6196.69

對結(jié)果進行數(shù)據(jù)擬合分析，得到擬合全變量二次回歸方程K=7.173+0.139 125×X1+0.361 125×X2-0.086 5×X3-0.127 25×X1X2-0.104×X1X3+0.314 5×X2X3-0.326 875×X12-0.530 875X22-0.352 625×X32. 本模型的F值為66.06，P值<0.01，極顯著，說明本模型具有顯著性；失擬項的P值為0.063 3，不顯著，說明所建立模型擬合程度好.R2=0.988 4，AdjR2=0.973 4，證明模型實際值與預測值之間相關性好. 結(jié)果表明X1、X3對K的影響極顯著，X2對K影響顯著. 兩兩因素的交互作用對K影響顯著，二次項X12、X22、X32對K影響極顯著. 以上結(jié)果表明X1、X2、X3是黃精葉多糖提取過程中的重要影響因素，三個因素對K的影響大小排序為X2>X1>X3，見表5.

由圖6(a)可以看出X2的響應面相對陡峭，等高線較密集，X1的響應面相對平緩，等高線稀疏，說明X2對K影響比X1更顯著. 同理，由圖6(b)可以看出X1的響應面相對陡峭，等高線較密集，X3的響應面相對平緩，等高線稀疏，說明X1對K影響比X3更顯著. 由圖6(c)可知，響應面最陡峭，表明X2X3交互作用對黃精葉多糖的提取率影響最大. 上述結(jié)果與方差分析結(jié)果(表5)表現(xiàn)一致.

表5 黃精葉多糖得率參數(shù)數(shù)學回歸分析結(jié)果

Tab.5 Results of mathematical regression analysis for polysaccharide yield of leaves of polygonatum

來源平方和自由度均方F值P值模型4.1690.462166.06<0.0001**X10.154 810.154 822.140.002 2**X21.0411.04149.15<0.000 1**X30.059 910.059 98.560.022 2*X1X20.064 810.064 89.260.018 8*X1X30.043 310.043 36.190.041 8*X2X30.395 610.039 5656.560.000 1**X120.449 910.449 964.32<0.000 1**X221.1911.19169.65<0.000 1**X320.523 610.523 674.85<0.000 1**殘差0.049 070.007 0--失擬項0.039 730.013 23.760.063 3純誤差0.009 340.002 3--總變異4.2116---R20.988 4----Adj R20.973 4----Pred R20.845 7----精密度25.654 8----C.V.%1.27----

圖6 各因素交互作用對黃精葉多糖得率影響的響應面圖Fig.6 The interaction of various factors impacts on polysaccharide yield from leaves of polygonatum

4 討 論

通過以上回歸模型的分析, 以黃精葉出膏率以及黃精葉多糖得率為評價指標, 表明在提取過程中，X2是影響多糖提取的關鍵因素，X1次之，而兩個實驗指標都同時證明了X3是影響多糖得率最不顯著的因素. 在兩兩交互作用中，X2X3、X1X2的影響是最為顯著的，而X1X3的影響是不顯著的，推測，時間過長或加熱溫度不適，會造成多糖結(jié)構(gòu)的破壞，影響多糖提出效果[18-19]. 多糖提取最優(yōu)工藝參數(shù)為：提取溫度75.4 ℃、提取時間2.45 h、液料比14.8∶1(mL/g) . 考慮到實際應用過程中操作簡便, 將工藝條件修正為：提取溫度75℃、提取時間2.5 h、液料比15∶1(mL/g); 在此基礎上進行3次平行驗證實驗，實測藥材出膏率為(47.65±0.16)%，與模型預測值47.79%相差不大；實測多糖得率為(7.21±0.073)%，與模型預測黃精葉多糖得率7.24%相差不大. 說明該模型能較好地預測各因素與黃精葉出膏率、多糖得率之間的關系，本實驗研究黃精葉多糖提取工藝，為其綜合利用開發(fā)提供了理論基礎，具有應用價值.