過表達OsPGIP基因對甘藍型油菜生長發育影響

李 師， 李國林， 王 睿， 趙 云

(四川大學生命科學學院 生物資源與環境教育部重點實驗室， 四川 成都 610065)

1 引 言

PGIP基因編碼多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(Poly galacturonase Inhibiting Protein, PGIP)，蛋白序列中含多個富含亮氨酸重復(Leucine-rich repeat, LRR),屬于LRR型蛋白[1]，能夠特異性結合并抑制病原真菌分泌的內切多聚半乳糖醛酸酶(endo-Polygalacturonase, endo-PGs)[2]，降低多聚半乳糖醛酸酶對植物細胞壁的降解作用，阻斷病原菌對植物的侵染，是作物抗病育種研究中的重要基因資源[3].隨著研究的進一步深入，曾有研究指出，過表達PGIP基因不僅能夠減弱病原真菌對植物細胞壁的降解作用[4]，同時PGIP基因過表達后還能通過調控體內ABA、SA等激素水平[5]、改變植物細胞壁中的糖類組成、調整細胞壁結構[6-7]，進而增強植株對生物及非生物脅迫的抵抗能力.

1971年Aibersheim和Anderson在蠶豆和西紅柿的細胞壁中發現PGIP蛋白[8]，至1994年，Favaronetal.從大豆發芽的種子中分離和純化PGIP蛋自，并設計特異性引物成功克隆了首個大豆PGIP基因，經克隆測序后發現該基因含有1個942bp的開放閱讀框，編碼313個氨基酸[9].作為重要的抗性基因資源PGIP基因在模式植物抗病方面的研究較多，早在2003年就有研究指出,擬南芥中的PGIP基因表達受到多種真菌病害誘導[10]，之后Ferrarietal.[11]在擬南芥中反義表達AtPGIP1基因增強了擬南芥對葡萄孢菌的抗性.PGIP基因在經濟作物中的研究報道較少，研究發現將水稻PGIP2基因在甘藍型油菜菌核病抗性株系7-5和易感株系T45中過表達后均能顯著提高油菜菌核病抗性，且不影響種子千粒重、含油量[12].截止到目前為止，沒有研究系統報道過PGIP基因過表達后對油菜生長發育、結實產生的影響，該方面研究的滯后限制了其在作物育種方面的廣泛應用.

本研究著重比較三個PGIP基因過表達油菜株系與野生型油菜在整個生長周期內的各項生理指標的差異，探究PGIP基因過表達后對油菜的生長發育過程、特別是對油菜的經濟性狀產生的有利、有害影響，為PGIP基因在油菜分子育種方面的應用提供一定的依據.

2 材料與方法

2.1 實驗材料

甘藍型油菜(BrassicanapusL.)wester品種及各OsPGIP基因過表達系T1代.

2.2實驗方法

2.2.1 種子常規指標考量 任選新收獲未完全烘干的種子在Nikon SMZ18熒光體式顯微鏡下觀察、拍照，并對種子的直徑(mm)進行測量統計.鮮種子千粒重用萬分之一電子天平測量.近紅外光譜分析儀Foss NIRS DS2500分析種子品質.

2.2.2 種子萌發率測定 野生型及各過表達株系任選37顆顆粒飽滿種子進行種子萌發試驗，于超凈工作臺臺中，將種子完全浸泡于0.1%(體積分數)的次氯酸鈉溶液中5 min，之后用ddH2O充分洗滌消過毒的種子5次，以完全去除種子表面殘留的次氯酸鈉溶液.待消毒完成后，將種子均勻點在用ddH2O完全浸濕的濾紙上于培養皿中進行種子萌發，每隔一天觀察種子萌發情況，以芽長達到種子長度一半時為發芽標準，記錄發芽種子數，計算每種油菜種子的發芽率.

2.2.3 幼苗生長特性測定 種子表面消毒方法參照2.2.2，三個轉基因株系種子先在潮霉素抗性篩選培養基上萌發一天(轉基因種子中攜帶潮霉素抗性標記基因能夠順利萌發，非轉基因種子不能萌發)，野生型種子在正常無抗性平板上萌發，將順利萌發的各種油菜種子移至MS平板中于光照培養箱子中生長3 d，記錄各種油菜的根長及下胚軸長度，每種油菜設置三個生物學重復.

2.2.4 花器官形態觀察 待各種油菜生長至花期，利用Nikon SMZ18熒光體式顯微鏡觀察各種油菜的花器官發育狀況.

2.2.5 RT-PCR鑒定表達量 待油菜兩片子葉完全展開時，剪取一片子葉利用天根公司的植物總RNA提取試劑盒(DP432)對各種油菜的總RNA進行提取，之后對提取的總RNA進行純度和完整地的檢測，檢測完成后進行反轉錄獲得cDNA.

PCR引物見表1.

表1 RT-PCR引物

程序PCR程序設定：95 ℃ 3 min, 95 ℃ 30 s, 58 ℃ 20 s, 72 ℃ 30 s, 72 ℃ 5 min,循環數30.

2.2.6 抗氧化系統功能測定 分別在苗期、抽薹期及初花期取樣測定各種油菜抗氧化系統功能.稱取新鮮葉片0.06 g，加600 μL酶提取液，冰浴勻漿后8 000 g 4 ℃離心10 min，取上清置于冰上待測.SOD、POD、CAT、MDA含量及羥自由基清除率測定所需試劑及操作步驟參考購買于蘇州科銘生物技術有限公司相應的試劑盒.

SOD酶活力單位定義：在試劑盒既定的黃嘌呤氧化酶藕聯反應體系中抑制百分率為50%時，反應體系中的 SOD 酶活力定義為一個酶活力單位(U/mL).

POD酶活力單位定義：每克組織在每毫升反應體系中每分鐘 A470變化 0.005為一個酶活力單位.

CAT酶活力單位定義：每克組織每分鐘催化 1 μmol H2O2降解定義為一個酶活力單位.

2.2.7 重要農藝性狀考察 在組培室種植環境下，待各種油菜生長至種子成熟期，對各種油菜的株高、角果數、角果粒數、有效分枝數以及初花天數等重要農藝性狀進行統計分析.

2.2.8 數據處理及分析 基礎數據用Excel 2016進行處理，顯著性分析采用SPSS25軟件，相關繪圖用GraphPad Prism7.0繪制.

3 結果與分析

3.1 T1代轉基因油菜種子常規指標考量

由圖1的結果可知，在0sPGIP2,3,4三個過表達株系中，OE-OsPGIP2株系在種子直徑和鮮種子千粒重方面均略低于野生型，分別降低了約10.2%和14.1%，而另外兩個過表達株系相比野生型，種子直徑還是千粒重均略有增加，千粒重分別增加了16.3%和20.5%，達到顯著水平.

圖1 T1代轉基因種子直徑及千粒重Fig.1 Diameter and 1 000 grain weight of T1 generation transgenic seedsThe asterisk represents the significant level relative to the wild type (P<0.05), Bar=1.5 mm

表2結果為測得的種子油酸含量、芥酸含量等指標，從表中的數據我們可以清楚的看出，三個過表達株系與野生型相比，油酸含量分別增加了11.2%、0.2%和11.4%、含油量變化分別為1.98%、-3.73%和0.26%，芥酸含量均發生降低，降低幅度分別達到9.8%、5.7%以及OE-OsPGIP4的46.7%.

表2 T1代種子品質性狀

3.2 種子萌發率測定

圖2為野生型及三個過表達株系種子的平板萌發實驗，從圖中可以清楚的看出，在相同的萌發條件下萌發兩天，OE-OsPGIP2的萌發率最高，達到94.59%；其次為OE-OsPGIP3,81.08%；接下來是OE-OsPGIP4和野生型，均為78.38%.從種子的萌發實驗結果可以看出，PGIP基因過表達不會顯著抑制種子的萌發率，轉基因油菜種子能夠正常萌發.

圖2 T1代轉基因種子萌發率Fig.2 Germination rate of T1 transgenic seeds

3.3 幼苗生長特性測定

圖3為野生型及三個過表達株系幼苗生長情況測定結果，在無任何抗性的MS平板上垂直生長3 d后，統計各種油菜根長及下胚軸長度.轉基因油菜的根長分別達到26.88、30.43、32.86 mm，相比野生型29.83 mm,分別增加了-9%、 2%和10%，均未達到顯著水平.各種油菜下胚軸的長勢相當.

3.4 RT-PCR鑒定表達量

OsPGIP2,3,4基因在油菜中均得到高水平表達，結果如圖4所示.

圖4 RT-PCRFig.4 Reverse transcription PCR

3.5 花器官形態觀察

花苞發育時期，隨機選取各種油菜大中小三個花苞進行觀察，結果如圖所示，在花苞發育早期柱頭與花藥平齊，柱頭微微傾斜，等待授粉.六強花藥飽滿圓潤，發育正常，此時期花絲較短，無法分辨.花苞發育階段，過表達株系及野生型油菜的柱頭與花藥發育正常，未見明顯差異(圖5).

花開放期(花瓣裂開后1～2 d)，隨機選取其中的一些花進行了觀察發現，此階段花藥、花粉均已發育成熟，花藥大且飽滿，顏色鮮黃，花粉附著其上，動之即落，能夠順利完成傳粉.此階段的花絲得到充分發育，將花藥高高托起，使之更接近柱頭，提高傳粉、授粉效率.花苞時期的四強花藥，在這個階段也發生了顯著的變化，其中的四個花藥緊緊圍繞在花柱四周，花藥飽滿，花粉繁多；另外兩個花藥稍遠離花柱，花藥出現干癟現象，其上附著少量花粉，為電典型的四強兩弱型花藥.通過對四強花藥的花絲長度測量發現，相比野生型和OE-OsPGIP2及OE-OsPGIP3兩個過表達株系OE-OsPGIP4過表達株系的花絲更長，約增長2%(圖5).

圖5 花器官形態Fig.5 Flower organ morphology

3.6 抗氧化系統功能測定

圖6為對各種油菜抗氧化系統功能的測定結果，從圖中我們可以看出不管是油菜生長發育的早期(苗期)、中期(抽薹期)還是發育晚期(初花期)，整體上過表達株系抗氧化系統功能相比野生型均未出現明顯缺陷，并且在某些過表達株系中相應的酶活力還出現了略高于野生型酶活力的情況.特別是在發育晚期，過表達株系的抗氧化系統功能發揮更優于野生型的趨勢.

3.7 成熟期性狀統計

圖7A為成熟期各種油菜角果長度及每角果果粒數的表型，圖B是對圖A的統計結果，過表達OsPGIP基因略微降低了角果長度，降幅分別達到8.9%、6.1%和7.3%，但每角果果粒數基本維持不變，分別為23、24、23和25.C圖為單位長度角果果粒數，三個過表達株系的單位長度角果果粒數均高于野生型.

對成熟期各種轉基因油菜的株高、單株角果數、單株有效分枝數及開花時間的統計結果如圖7D-G所示，三個過表達株系與野生型比較，在單株角果數和有效分枝數方面均未出現顯著差異.值得注意的是，相比野生型，三個過表達株系的株高略有增加，OE-OsPGIP2株高增加13.6%，OE-OsPGIP3株高增加13.1%，OE-OsPGIP4株系最高，達到153cm,相比野生型增加了23.1%.首次開花天數，過表達株系均顯著低于野生型，野生型開第一朵花需要約70 d，OE-OsPGIP2株系需62.3 d，OE-OsPGIP3株系需63 d，而OE-OsPGIP4株系僅需60 d,均達到顯著水平.

圖6 抗氧化酶活性Fig.6 Antioxidant enzyme activity(A)POD (B)SOD (C)CAT (D)羥自由基清除率The asterisk represents the significant level relative to the wild type (P<0.05)

圖7 重要農藝性狀Fig.7 Important Agronomic traits(A)Pod phenotype (B) Pod length and number of seeds per pod (C) Number of pods per unit length (D) Plant height (E) Pod number (F) Effective branch number (G) Days of fist floweringThe asterisk represents the significant level relative to the wild type (P<0.05), Bar=1.5mm

4 討 論

PGIP基因作為重要的抗病基因資源，對其研究主要集中在模式植物、經濟作物抗病、抗逆領域[13]，該基因過表達后對植株生長發育的影響，還未見系統報道.本實驗側重探究PGIP過表達后對油菜生長發育、結實等方面產生的影響，進一步豐富PGIP基因的功能.

外源基因在35S啟動子的驅動下，持續進行過量表達，對植株的正常生長發育、結實會產生一定的影響.研究發現SIBR1基因在番茄中過表達后，能夠增強體內BR信號調控網絡作用，對番茄的株高、產量等農藝性狀具有一定的改良作用[14]；此外在甘菊中過表達細胞周期基因CIE2F1，能夠顯著增強甘菊的株高、花序直徑等性狀[15];以及在擬南芥中過表達E3泛素連接酶ABRv1能夠提高擬南芥干旱耐受能力.但也有研究指出，外源基因的持續、過量表達，會造成生物體內能源物質往某一特定方向大量聚集，對植株的正常生長、發育及結實過程產生不利影響，甚至造成植物不育或死亡[16-17].我們研究結果發現，除了OE-OsPGIP2株系顯著降低，另外兩個過表達株系油菜的T1代轉基因植株種子大小及千粒重相比野生型油菜均有所增加；此外，對三個過表達株系菜籽的品質及發芽率的考察也未見明顯劣勢.

植物根系是植物與土壤環境進行物質交換的主要通道，植物生發育過程中所需的水分、礦物元素等均通過根部進行吸收[18].同時根系在植物固地、抗逆、信號傳導等方面也具有重要作用[19]；下胚軸的正常生長對植物新芽鉆出土壤、接受光照意義重大[20]. 在種子生長初期，植物根部生長較下胚軸提前，以保證后期幼苗生長充足的物質獲取,植物幼苗的根長及下胚軸的這種動態協調生長過程，對植物后期的正常生長發育具有重要意義[21].本實驗通過對無菌條件下生長3 d的各種油菜的根長及下胚軸長度測定發現，各種油菜的根長及下胚軸長度間無顯著差異.

花器官形態及功能的正常是保證植物順利繁殖下一代的前提，對經濟作物油菜來說更是如此，花器官發育缺陷將會直接造成菜籽產量降低.通過對各種油菜成熟花器官的觀察發現，OsPGIP基因過表達對柱頭、花藥的發育過程幾乎無明顯影響，值得注意的是OsPGIP4基因在野生型油菜中過表達后能明顯增加花絲的長度(圖4d),使得柱頭能夠有更多的時間“埋藏”于花藥及花絲中，一方面能夠保證傳粉、授粉的效率；另一方面對剛受過粉的柱頭也是一種保護機制.圖5 單位角果長度果粒數與之相互佐證，這種形態上的改變具有重要的意義，具體機制層面原因有待進一步研究.

植物在自身有氧代謝過程中以及外界逆境脅迫下，體內會產生大量活性氧，這類物質在植物體內如不能及時清除，將會對植物的生長發育產生嚴重的毒害作用.植物為了維持正常的生長，通過抗氧化酶系統和抗氧化劑對活性氧進行清除[22]，抗氧化酶系統功能正常對植物的生長發育至關重要.通過對苗期、抽薹期及初花期各種油菜SOD、POD、CAT酶活力及羥自由基清除能力的測定，證實PGIP基因過表達后，不會對油菜抗氧化酶系統的功能造成危害，三個過表達株系油菜的抗氧化酶系統中的各種關鍵酶均保持正常酶活力.

作物的開花天數決定了其收獲周期，在生產上具有重要意義，也是重要的育種目標[23].研究發現(圖6d),三個過表達株系的開花天數較野生型均有減少，減少天數從7～10 d不等，OE-OsPGIP4株系開花天數最短，僅為60 d，有重要的育種價值. 有研究表明，植物開花時間受到多種因素的影響，如光照周期、溫度、營養等環境因素，同時還受到植物體內激素水平及開花調節基因的影響[24]，以及某些化學物質調控[25]，但本實驗材料開花時間縮短的具體調控機制有待進一步研究.總結，本研究全面評估了OsPGIP2、3、4基因過表達后對野生型油菜生長發育、結實等全過程產生的影響，為OsPGIP基因在油菜分子育種領域的應用打下了一定的理論基礎.