丁酸鈉對腎草酸鈣結石大鼠腸道菌群及炎癥因子的影響

崔雅倩， 魏志濤， 曹 月， 張 慧， 李若琳， 王坤杰， 孫 群

(1.四川大學生命科學學院 生物資源與生態環境教育部重點實驗室， 成都 610064；2.四川大學華西醫院泌尿外科， 成都 610041)

1 引 言

腎結石是一種泌尿外科常見疾病，按照成分分為草酸鈣結石、磷酸鹽結石、尿酸結石、胱氨酸結石等，腎草酸鈣結石是最常見的結石類型，約占腎結石總量的60%-90%.目前其他類型的腎結石成因逐漸明晰，如磷酸銨鎂結石、碳酸磷灰石的發生主要與泌尿道菌群紊亂有關，但腎草酸鈣結石的成因尚不確定.Miller[1]通過觀察腎結石病人的腎臟發現腎乳頭下方有Randall斑塊，斑塊會為腎草酸鈣結石的生長提供支撐點，因此Randall斑在腎結石形成中起重要作用.腎臟髓袢局部的炎癥反應是Randall斑形成中最可能的使動因素，而腸道菌群及其代謝產物短鏈脂肪酸、氧化三甲胺、脂多糖等影響著軀體及器官的炎癥反應[2-5]，所以腎草酸鈣結石的形成可能是機體發生炎癥的最終反映之一.

研究表明，腸道菌群與2型糖尿病、肥胖、冠心病、高血壓等代謝性疾病的發生密切相關[6]，而2型糖尿病、肥胖、冠心病、高血壓等代謝性疾病患者更容易同時患有腎草酸鈣結石[7,8].廣西醫科大學團隊[9]發現，腎草酸鈣結石患者和健康人的腸道菌群結構存在明顯差異，如腎草酸鈣結石患者腸道中促炎性細菌(Megamonas、Phascolarctobacterium、Escherichiacoli、Sutterella)水平顯著升高；劉彧等[10]通過對160例中國腎草酸鈣結石患者的糞便樣本進行測序發現，患者的Blautia、Lachnospiraceae、Eubacteriumhallii、Faecalibacterium以及細菌代謝產物短鏈脂肪酸的豐度顯著降低.Tang R[11]也發現腎草酸鈣結石患者體內腸道菌群多樣性低于正常人.以上研究均提示著腸道菌群與腎草酸鈣結石的發生密切相關.李鐸等[12]通過對肥胖人群進行飲食干預，發現高脂飲食肥胖人群擬桿菌門/厚壁菌門比值、Blautia和Faecalibacterium豐度顯著低于低脂飲食肥胖人群，且高脂飲食肥胖人群血漿中促炎因子TXB2、LTB4、PGE2顯著高于低脂飲食肥胖人群；趙立平等[13]研究發現腸道菌群通過提高短鏈脂肪酸含量、強化競爭性抑制，減少病原菌的生長，改善了機體炎癥及2型糖尿病的發生；Pedret[14]發現腸道菌群雙歧桿菌和Akk菌可產生短鏈脂肪酸，與低度炎癥和2型糖尿病的發生呈負相關.以上研究表明腸道菌群可以通過改變其結構及代謝產物，改善軀體及器官的炎癥，進而緩解代謝性疾病的發生.所以我們推測腸道菌群可能會影響系統性炎癥及組織器官炎癥，如腎臟、尿道等泌尿系統的炎癥，影響泌尿系統的微生物菌群，進一步影響Randall斑的形成，進而影響腎草酸鈣結石的形成.與泌尿系統菌群相比，腸道菌群的調控相對容易，這樣可以發現影響腸道菌群的食物或藥品或益生元等，間接影響草酸鈣結石形成，從而可進一步開發相應的預防或治療的藥物和益生菌，故本研究重點探討大鼠腎草酸鈣結石的形成與腸道菌群的關系.丁酸鈉[15]作為腸道菌群的主要代謝產物短鏈脂肪酸的一種鈉鹽，目前作為一種制劑應用于養殖業飼料中，可以改善腸道菌群結構，改善腸上皮細胞緊密連接功能，修復腸屏障功能，對維持腸道內穩態有重要的作用.此外，丁酸鈉還可以通過激活GPR受體[16]、減少脂多糖受體TLR4[17]，以調節IL-1β、IL-6、NF-κB p50等炎癥因子的表達，從而抑制機體炎癥的發生，進而可能影響與炎癥發生相關的腎草酸鈣結石的形成.本實驗前期通過對腎草酸鈣結石大鼠灌胃植物乳桿菌(實驗室篩選出的菌株，產丁酸能力強)，發現大鼠腎草酸鈣結石成石率有所降低，且大鼠腸道內的丁酸含量顯著增加，大鼠腸道內產短鏈脂肪酸及與炎癥相關的細菌豐度有所變化，經換算后植物乳桿菌影響腸道菌群產生丁酸的含量為0.5 g/kg/d.丁酸在體內是一種半衰期短、代謝快的物質，本團隊中劉彧等人前期通過不同劑量的丁酸鈉灌胃腎草酸鈣結石大鼠的預實驗發現，大鼠在丁酸鈉灌胃量為0.5 g/kg/d時死亡率為0.

為了探索作為乳桿菌產物的丁酸單獨是否對腎草酸鈣結石的形成有影響，結合前期預實驗及參考文獻[18]，本研究通過乙二醇誘導大鼠腎草酸鈣結石模型，同時給予丁酸鈉干預(0.5 g/kg/d，每天一次)，觀察大鼠腎草酸鈣結石數量、腸道菌群特定菌屬數量及炎癥相關因子的表達量的變化，初步探索丁酸鈉干預大鼠腎草酸鈣結石形成的可能機制.

2 材料與方法

2.1 材 料

2.1.1 主要材料與試劑 丁酸鈉，乙二醇，4%中性甲醛固定液，乙醇，蘇木精，伊紅，OMEGA糞便DNA提取試劑盒，天漠RNA提取試劑盒，Prime Script RT reagent Kit With gDNA(Takara).

2.1.2 儀器與設備 Bio-rad CFX connect 熒光定量PCR儀，美國Bio-Rad公司；BA400Digital數碼三目攝像顯微鏡，麥克奧迪實業集團有限公司.

2.2 實驗方法

2.2.1 動物實驗 8周齡SPF級SD雄性大鼠24只，購于四川省成都達碩生物科技有限公司，許可證號SCXK(川)2015-030，養于SPF級動物房，溫度保持在25 ℃左右，濕度保持在60%，光照時間10～12 h.待大鼠適應環境后，將其隨機分為對照組、腎草酸鈣結石組、丁酸鈉組，每組8只.所有大鼠均繼續飼養無菌基礎飼料，對照組自由飲水30 mL/d；腎草酸鈣結石組自由飲水20 mL/d，每天上午固定時間灌胃1%乙二醇10 mL/d；丁酸鈉組自由飲水19 mL/d，每天上午固定時間灌胃1%乙二醇10 mL/d及丁酸鈉0.5 g/kg/d(0.5 g丁酸鈉溶于0.95 mL生理鹽水中)[18]，每天灌胃一次，4 w后將大鼠處死，解剖取雙腎、脾臟、肝臟、胸腺、結腸及盲腸內容物，稱重，用液氮迅速冷卻后保存于-80 ℃；并及時用4%中性甲醛固定液固定腎組織，以便及時觀察.

2.2.2 腎組織切片制作及觀察 固定組織經脫水、修剪、包埋、切片、染色、封片等，最后鏡檢，進行圖像采集.每張切片先于40倍下觀察全部腎臟組織，觀察大體病變，選擇要觀察的區域采集100倍圖片，觀察具體病變.

2.2.3 特定菌屬的qPCR檢測 培養E.coli、Bacteroidesfragilis、Bifidobacterium、Faecalibacteriumprausnitzii、Lactobacillus、Roseburiaspp.、Enterococcusfaecalis，10倍梯度稀釋，獲得系列菌落數，提取細菌DNA，以此為模板進行qPCR.以qPCR反應的Ct值為縱坐標，菌落數的對數作為橫坐標，構建標準曲線.依照糞便DNA提取試劑盒方法提取盲腸內容物總DNA，-20 ℃保存，以便進行實時熒光定量檢測.各菌屬的擴增引物如表1所示.根據各菌屬的標準曲線計算菌落數.

表1 特定菌屬qPCR擴增引物

2.2.4 炎癥相關因子表達 提取結腸組織總RNA，反轉錄成cDNA，進行實時熒光定量檢測，確定炎癥相關因子TLR4、IL-1β、NF-κB p50的mRNA相對表達量.炎癥相關因子的擴增引物如表2所示[19,20].用2-△△Ct法計算每個炎癥因子相對于內參基因β-actin的mRNA相對表達量.

表2 炎癥相關因子qPCR引物序列

2.2.5 統計分析 采用SPSS 22.0進行數據平均值、標準誤差的計算和統計分析，P< 0.05為具統計學意義.

3 結果與分析

3.1 大鼠體重及臟器指數變化情況

大鼠適應環境后開始進行分組喂養，每周進行體重稱量記錄.大鼠解剖后取雙腎、脾臟、肝臟和胸腺，稱重，各組大鼠體重及臟器重量指數如表3所示.

表3 灌胃4周各組大鼠體重及臟器指數(x±SD)

注：不同字母上標代表顯著性差異(P< 0.05)

灌胃前3 w各組大鼠體重無明顯差異，總體呈上升趨勢；第4 w對照組大鼠體重依然保持上升趨勢，相較于對照組，腎草酸鈣結石組與丁酸鈉組大鼠體重顯著降低(P< 0.05)，丁酸鈉組的體重略高于腎草酸鈣結石組，但無顯著性差異(P> 0.05).結合已有研究表明，乙二醇成石劑的加入對腸粘膜有損傷，可能會使大鼠造成腸炎，進而影響大鼠食欲，使體重降低；加入丁酸鈉對大鼠腸道粘膜炎癥有所改善，進而影響大鼠體重.各組之間的脾臟、肝臟、胸腺重量無顯著差異，加入乙二醇成石劑造模后，大鼠腎臟有腎草酸鈣結晶沉淀，增加大鼠腎臟重量，表明造模成功.

3.2 腎組織草酸鈣結晶沉積情況的觀察和評估

3.2.1 HE染色切片觀察 腎組織HE染色切片在光學顯微鏡下觀察，對照組皮質區、髓質區、腎乳頭區均未見草酸鈣結晶沉積；腎草酸鈣結石組皮質區和髓質區可見結晶沉積，部分腎乳頭區可見結晶沉積；丁酸鈉組部分皮質區和髓質區可見結晶沉積，乳頭區幾乎未見結晶沉積.

圖1 各組腎組織切片HE染色(×100)A：對照組；B：腎草酸鈣結石組；C：丁酸鈉組 (結晶沉積(↑)腎小管擴張伴上皮扁平(◇)纖維增生(△))Fig.1 HE staining of kidney tissue sections in each group (×100) A: Control group; B: Renal calcium oxalate stone group; C: Sodium butyrate group

由圖1可知，對照組(1A)腎臟組織被膜較為完整，皮質和髓質分界較為清晰，未見結締組織增生及炎性滲出；皮質區腎小球未見毛細血管基底膜或基質增生，無變性、壞死及纖維化；腎曲小管、髓袢及髓質內集合小管偶見上皮細胞空泡變性，管腔內無細胞管型或蛋白管型，間質內無充血及炎細胞浸潤；髓質區集合管未見細胞明顯變性壞死.腎草酸鈣結石組(1B)腎臟組織被膜較為完整，皮質和髓質分界較為清晰；其中2例標本有少量腎小球輕度變性壞死，部分基底膜增厚；7例標本存在腎小管不同程度擴張，部分伴隨上皮細胞扁平化，腎小管變性壞死區域間質內見少量纖維組織增生，呈纖維細胞核呈梭形，部分伴有少量炎細胞浸潤，主要為淋巴細胞；6例標本的腎皮質和髓質腎小管管腔內少量或散在不著色、帶折光性的透明結晶沉積.表明乙二醇成石劑對腎臟造成損傷，且有成石出現，提示造模成功.丁酸鈉組(1C)腎臟組織被膜完整，皮質和髓質分界清晰，腎小球結構完整清晰，未見毛細血管基底增厚及炎性滲出，部分切片有帶折光性的透明結晶沉積，部分上皮細胞壞死，少量管腔內見細胞殘片和炎細胞混合，少量可見細胞管型；間質內少量炎細胞浸潤和纖維組織增生.

3.2.2 腎臟損傷評分統計結果 在100倍光鏡下觀察，至少5個視野(腎皮質區域3個視野，腎髓質和腎乳頭2個視野)，結晶數量判定方法：0pt，無任何結晶亮點；1pt，有一定散在結晶亮點；2pts，廣泛散在結晶亮點，不成堆；3pts，廣泛結晶亮點成堆或連接成片.記錄每個區域的結晶數量得分，計算腎臟損傷程度.由表4可知，與腎草酸鈣結石組相比，丁酸鈉組腎臟損傷評分顯著降低(P< 0.01)，表明丁酸鈉加入可減弱乙二醇對腎組織造成的損傷.

表4 腎臟損傷評分統計結果(x±SD)

注：丁酸鈉組與腎草酸鈣結石組相比，*P< 0.05**P< 0.01.

綜上，腎損傷評分統計結果和病理描述可知，腎草酸鈣結石組病變，造模成功，丁酸鈉組病變減輕，表明丁酸鈉的加入可減少腎草酸鈣結晶數量，減緩腎損傷.

3.3 腸道菌群特定菌屬qPCR檢測

通過qPCR分別檢測對照組、腎草酸鈣結石組及丁酸鈉組大鼠盲腸內的總菌、Enterococcus、E.coli、Bacteroidesfragilis、Bifidobacterium、Faecalibacteriumprausnitzii、Lactobacillus、Roseburiaspp .、Bacteroidetes、Firmicutes數量，以各個菌屬數量/總菌數表示各個菌屬相對豐度.結果表明，三組大鼠盲腸內總菌數無顯著差異(P>0.05).如圖2所示，三組大鼠盲腸內容物中Bifidobacterium、Faecalibacteriumprausnitzii、Roseburiaspp.相對豐度無顯著差異(P> 0.05).與腎草酸鈣結石組相比，丁酸鈉組的Enterococcus相對豐度顯著減少(P< 0.05)，革蘭氏陰性細菌Bacteroidesfragilis、E.coli相對豐度顯著減少(P< 0.05)，表明N-1可改善腸道菌群結構，調節腸道菌群紊亂，減少革蘭氏陰性細菌的豐度，進而可能會減少其代謝產物脂多糖的產生，減少機體炎癥的發生.

圖2 各組大鼠盲腸內容物中不同菌屬的相對豐度Fig.2 Relative abundance of different bacterial species in the cecum contents of rats

圖3 各組大鼠TLR4、IL-1β、NF-κB p50的mRNA表達水平Fig.3 The expression levels of mRNA of TLR4, IL-1β, and NF-κB p50 in rats

3.4 結腸炎癥相關因子qPCR檢測

TLR4可以識別革蘭氏陰性菌代謝產物脂多糖(LPS)，并通過TLR4-MyD88-NF-κB或TLR4-MyD88-MAPK等通路激活下游的炎癥因子.如圖3所示，腎草酸鈣結石組TLR4、IL-1β、NF-κB p50的mRNA表達量顯著高于對照組(P< 0.05)，表明腎草酸鈣結石大鼠的結腸有炎癥發生；與腎草酸鈣結石組相比，丁酸鈉組的IL-1β、NF-κB p50的mRNA表達量顯著降低(P< 0.05)，TLR4的mRNA表達量降低但無顯著差異(P> 0.05).提示丁酸鈉的加入可能會減少脂多糖的含量，使脂多糖受體TLR4有減少趨勢，進而抑制下游促炎因子IL-1β、NF-κB p50的表達，抑制結腸組織炎癥的發生，減少結腸炎癥因子透過腸屏障循環入血，緩解機體及腎臟等器官炎癥的發生.

4 討 論

腎結石是泌尿外科常見疾病，目前常用的治療方法是手術療法，但面對腎結石的高發生率和高復發率，僅僅依靠腎結石形成后進行手術治療并不是長久之計，更關鍵的是找到干預腎結石形成的有效方法.二十世紀三四十年代，Randall發現以他名字命名的Randall斑的存在，之后人們開始在腎結石患者中廣泛的觀察到Randall斑，而Randall斑的形成很大程度受炎癥的影響，人體內的腸道菌群又與軀體器官組織的炎癥狀態緊密相連，其通過影響腸道菌群結構和腸道菌群代謝物影響腸屏障功能及局部、系統性炎癥發生.所以推測，腎草酸鈣結石的形成是腸道菌群結構紊亂，系統性炎癥的最終體現.丁酸鈉是短鏈脂肪酸的一種鈉鹽，已有研究證明其可調節腸道菌群，緩解機體炎癥.Xu等[15]通過對糖尿病小鼠進行丁酸鈉干預，調節了小鼠的腸道菌群結構，改善腸屏障功能，改善糖尿病小鼠的炎癥.Xu J等[21]發現丁酸鈉可增加初生仔豬腸道菌群多樣性，調節IL-6、IL-8、IFN-γ、IL-10、TGF-β、HDAC等炎癥因子，提示口服丁酸鈉有益于初生仔豬的健康.目前腎草酸鈣結石無有效的臨床干預手段，鮮少有人研究丁酸鈉對腎草酸鈣結石形成的影響，故本實驗應用乙二醇造腎草酸鈣結石大鼠模型，通過觀察丁酸鈉對大鼠腎草酸鈣結石數量、腸道菌群及炎癥相關因子的影響，探索其干預腎草酸鈣結石形成的可能機制.

人體的健康與腸道菌群結構息息相關，正常情況下有益菌、有害菌和中性菌結構穩定，與宿主、環境保持動態平衡[4].機體發生病變如腎草酸鈣結石時，腸道菌群結構紊亂，如革蘭氏陰性細菌E.coli、Bacteroidesfragilis數量增多，產生的內毒素增多，使腸屏障功能下降，刺激細胞炎癥因子，誘發局部或全身炎癥，這一結果與Soares的研究相似[22].本實驗中丁酸鈉的加入可以減少E.coli、Bacteroidesfragilis含量，同時減少機會感染菌Enterococcus的含量，可能會抑制炎癥的發生.

TLR4是脂多糖受體，是常見的激活炎癥信號通路的蛋白質分子.IL-1β、IL-6、NF-κB等是脂多糖刺激TLR4后作出應答的主要促炎因子，本實驗中IL-1β、NF-κB p50的mRNA表達水平在腎草酸鈣結石組顯著增加(P< 0.05)，在丁酸鈉組顯著下降(P< 0.05).Chen等[16]通過丁酸鈉改善了LPS引起的炎癥反應和腸上皮屏障功能障礙，具體是通過減少TLR4的表達，抑制AKT和NF-κB p65信號通路產生影響，本研究結果與之相似.

綜上所述，丁酸鈉可減少腎草酸鈣結石大鼠腸道菌群E.coli、Enterococcus、Bacteroidesfragilis相對豐度，改善腸道菌群失衡；影響結腸炎癥相關因子IL-1β、NF-κB p50的mRNA表達，抑制炎癥的發生，從而減少腎草酸鈣結晶數量.關于丁酸鈉如何通過大鼠腸道菌群代謝產物影響炎癥發生，推測與脂多糖、短鏈脂肪酸有關，有待進一步研究.