高效液相色譜法測定美洛昔康注射液中美洛昔康的含量

張浩然 張亦菲 徐 汀 田 愷 華賢輝 黃家鶯*

（上海市獸藥飼料檢測所，上海201103）

美洛昔康屬于烯醇酰胺類非甾體抗炎藥，最早由勃林格殷格翰公司研制[1]。研究表明，美洛昔康對環氧化酶-2（COX-2）有選擇性抑制作用，解熱鎮痛及抗炎性作用較高，對胃腸道、腎臟副作用較低[2]，主要用于風濕關節炎[3]、骨關節炎的治療[4]及術后止痛[5]。目前，對于美洛昔康的測定，主要有電化學法[6]和紫外分光光度法[7]，這兩種方法雖有一定的準確性，但難以適應大批量檢測。而液相色譜法較多報道于血清中美洛昔康的檢測[8-9]，且條件繁瑣。本文根據注射液的特點，建立了高效液相色譜法測定美洛昔康注射液中美洛昔康的含量，該方法簡單快速，具有良好的精密度和準確度，能夠滿足質量控制需求。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀：Agilent 1100，安捷倫科技有限公司，Waters e2695，沃特世公司；電子天平：感量0.01 mg，AB265-S，梅特勒- 托利多儀器（上海）有限公司；純水機：Molatom 1810A，中國重慶摩爾水處理設備有限公司。

1.2 試藥

美洛昔康對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為100679-201102，含量99.9%）；實驗用水（電阻率>18 MΩ·cm，符合GB/T6682 一級用水的規定）；醋酸銨（分析純）；氫氧化鈉（分析純）；甲醇（色譜純）；美洛昔康注射液（魯舍里樂藥業有限公司提供，批號1801001、1801002 及1805003）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用ODSC18色譜柱（柱長150 mm，內徑4.6 mm，粒徑5 μm），以甲醇-0.lmol/L 醋酸銨溶液（1:1）為流動相流動相；流速為1 mL/min；進樣量為20 μL；檢測波長為270 nm。典型色譜圖見圖1。

圖1 美洛昔康對照品的典型色譜圖

表1 準確度試驗結果（n=9）

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備。精密量取本品適量，于容量瓶中，加流動相定量稀釋制成每1ml 中約含美洛昔康0.1mg 的溶液，搖勻，經0.22 μm 濾膜濾過，濾液作為供試品溶液。

2.2.2 對照品儲備溶液的制備。取美洛昔康對照品50 mg，置50 mL 量瓶中，加1 mol/L 氫氧化鈉溶液4 mL，充分振搖3分鐘，加甲醇30 mL，渦旋3 分鐘，超聲處理10 分鐘，放冷。用50%甲醇溶液（V1∶V2）稀至刻度，搖勻，得到對照品儲備溶液。

2.2.3 對照品工作溶液。精密量取1 mL 對照品儲備溶液置10 mL 容量瓶中，加流動相定量稀釋制成每1ml 中約含美洛昔康0.1mg 的溶液，搖勻，經0.22 μm 濾膜濾過，濾液作為對照品工作溶液。

2.3 供試品的測定

按照2.1 的色譜條件及2.2 的溶液制備方法，將供試品溶液和對照品工作溶液注入高效液相色譜儀，按外標法以峰面積計算，即得美洛昔康的含量。

2.4 線性關系考察

美洛昔康對照品儲備液經精密稀釋，制備60、80、100、120、160 μg/mL 的美洛昔康對照品系列溶液，每個濃度點重復5 次進樣，按照2.1 的色譜條件進行測定。以美洛昔康對照品濃度為橫坐標（x），以相應濃度測得的峰面積為縱坐標（y），繪制標準曲線。得到方程為y=31361x+31140，相關系數為0.9999。說明美洛昔康濃度在60～160 μg/mL 范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.5 準確度試驗

隨機選取樣品，按照對照品添加量與待測成分量之比為0.8:1, 1:1, 1.2:1 進行低、中、高三種不同濃度的準確度試驗，每個濃度3 份平行，按照2.1 的色譜條件及2.2 的制備方法進行測定。平均回收率為97.4%，RSD 為0.9%，結果見表1。

2.6 重復性試驗

按照2.1 的色譜條件及2.2 的制備方法，對各批次樣品重復進樣6次，并記錄峰面積，進行重復性試驗。結果表明（表2），各批次樣品的RSD為0.23%～0.25%，重復性較好。

2.7 中間精密度試驗

在不同時間，由不同的實驗人員用不同的儀器對相同樣品進行中間精密度試驗。條件A：實驗員甲，使用Agilent 1100 高效液相色譜儀，配Shiseido MG 色譜柱（C18，柱長150 mm，內徑4.6 mm，粒徑5 μm）；條件B：實驗員乙，使用Waters e2695 高效液相色譜儀，配Waters Symmetry 色譜柱（C18，柱長150 mm，內徑4.6 mm，粒徑5 μm）。選擇各批次樣品，按照上述A、B 不同條件進行試驗。結果表明（表3），RSD 為0.19%～0.62%，中間精密度較好。

2.8 耐用性試驗

選取1801003 批次樣品，按照2.1的色譜條件及2.2 的制備方法配置3份平行樣品，進行耐用性試驗，考察流速及柱溫對含量測定的影響。結果表明（見表4），流速在0.8～1.2 范圍內對含量測定結果無影響；柱溫在35℃～45℃范圍內對含量測定結果無影響。

2.9 供試品測定

采用本法，對供試品的含量進行測定，并與生產企業提供的數據進行比較，結果見表5。結果表明，本方法測定美洛昔康注射液含量結果與生產企業提供的檢測結果基本一致。

3 討論與結論

3.1 檢測波長的確定

將美洛昔康對照品儲備液用流動相稀釋10 倍后，利用二極管陣列檢測器在190 nm～400 nm 范圍內對美洛昔康進行了紫外波長掃描，發現其在270 nm 處有最大吸收，故確定270 nm為美洛昔康含量測定的檢測波長。

3.2 對照品的預處理

據報道，二甲基甲酰胺可用于溶解美洛昔康對照品[10]。二甲基甲酰胺作為助溶劑，對改善色譜峰型，平穩基線有一定作用，但長期使用會引起許多問題。首先，二甲基甲酰胺可引起人體消化道紊亂，肝臟和腎臟損害，長期接觸，會損害試驗人員的身體健康[11]。其次，二甲基甲酰胺作為一種特殊的溶劑，會對色譜柱造成損傷[12]，進而降低色譜柱的柱效及理論塔板數，不利于檢測任務的長期重復進行。本文采用甲醇超聲助溶，并用50%甲醇定容稀釋，對美洛昔康的溶解效果好。在保證方法穩定可靠的同時，將試驗對人員健康和色譜柱的潛在危害降至最低。

表2 重復性試驗數據表（n=6）

表3 中間精密度試驗數據表（n=12）

表4 耐用性試驗數據表（n=3）

本方法簡便快捷，具有較好的準確度及精密度，能夠滿足對美洛昔康注射液質量控制的需求。

表5 含量測定試驗數據表（n=3）

% % 1801001 1801002 1801003 106.30.18100.60.15106.00.27106.60.16100.40.19105.70.23-0.30.20.3

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