化濕敗毒方治療新型冠狀病毒肺炎的藥理學機制探討和網絡藥理學研究

賴慶來，梁愛武，何妙儀，黃小玉，吳偉泳

廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院，南寧 530011

2019年底湖北省武漢市出現新型冠狀病毒肺炎(簡稱新冠肺炎)的疫情，此次疫情比較嚴重，傳染性極強，傳染源主要為新型冠狀病毒感染患者和無癥狀感染者。2020年1月31日，世界衛生組織正式將其命名為COVID-19[1]。國家衛生管理部門采取重要措施，發布了COVID-19相關方診療方案，要求發揮中醫中藥治療和預防作用，并且加強中醫和西醫相互聯合治療作用，共同發揮各自優勢，使此次醫療救治取得最好效果。從中醫學角度分析，此次COVID-19病位主要在肺脾，病機特點主要以“濕、熱、毒”相關，根據病情特點提出分期辨證論治[2]。而中醫臨床具有辨證論治的特色優勢，能夠因人制宜采取不同的治療措施。

化濕敗毒方是國家衛生健康委員會和國家中醫藥管理局聯合發布的《新冠肺炎診療方案(試行第七版)》治療推薦方，用于COVID-19辨證為疫毒閉肺證的治療。該證臨床主要表現為發熱、咳嗽、痰黃或痰中帶血、氣喘、乏力、口干苦、惡食欲差、大便不暢，小便短赤，舌紅、苔黃膩、脈滑數。化濕敗毒方在臨床中運用效果明顯，目前此方已由黃璐琦院士為領隊的第一批國家援鄂抗疫中醫醫療隊(中國中醫科學院)研制成化濕敗毒顆粒。2020年3月18日，化濕敗毒顆粒獲臨床試驗批件。化濕敗毒方傳承了中醫理論的精華，由麻杏石甘湯、藿香正氣散、宣白承氣湯、葶藶大棗瀉肺湯多個經典名方加減而來。但化濕敗毒方對COVID-19的作用機制尚未能明確闡明，對化濕敗毒方的有效應用帶來了局限。本研究對化濕敗毒方治療COVID-19的現代藥理學機制進行探討，然后運用網絡藥理學方法預測化濕敗毒方治療COVID-19的作用機制研究，并借助分子對接技術進行驗證，旨在為中醫藥治療COVID-19的研究提供進一步科學依據。

1 材料與方法

1.1 化濕敗毒方現代藥理學機制研究

查閱文獻以及臨床報道，總結化濕敗毒方治療COVID-19藥理學研究。

1.2 有效成分的收集及潛在靶點的預測

以化濕敗毒方中單味中藥標準名稱為檢索詞，在TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.Php)數據庫檢索化濕敗毒方的全部化學成分，根據藥代動力學(ADME)：口服生物利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18進行篩選[3]，得到化濕敗毒方有效成分和相應的靶標蛋白。COVID-19靶點的預測，以“Novel Coronavirus Pneumonia”為關鍵詞，檢索GeneCards(https://www.genecards.org/)數據庫，選擇物種為“Homo sapiens”，檢索出與COVID-19相關的基因。

1.3 化濕敗毒方治療COVID-19潛在作用靶點預測

通過R語言3.6.2程序取交集將藥物預測的靶點與疾病的靶點進行映射，獲得“化濕敗毒方”治療COVID-19的潛在作用靶點，并繪制韋恩圖。

1.4 交集靶標的蛋白網絡互作(PPI)構建

為明確潛在作用靶點之間的相互作用關系，將得到的共同靶點導入STRING(https://string-db.org/)網絡平臺數據庫，物種僅限于“智人”，置信度>0.9為條件進行篩選，獲得蛋白互作關系。通過Cytoscape3.7.0軟件構建并可視化PPI交互網絡，根據PPI中節點的平均“degree”值為最低標準篩選核心蛋白。

1.5 基因富集分析

為了深入了解化濕敗毒方治療COVID-19的生物過程及通路信息，利用R語言3.6.2程序基于“bioconductor”數據包提取信息，對靶點進行GO(geneontology)生物學過程富集分析和KEGG(KEGG pathway analysis)通路富集分析，篩選條件設定閾值P<0.05，得到靶點蛋白在基因功能和信號通路中的作用。

1.6 構建化合物-靶點網絡圖

將收集的藥物，活性成分及收集的交叉靶點，利用Cytoscape3.7.0軟件繪制“構建化合物-靶點網絡圖。

1.7 成分-靶點分子對接

從PDB數據庫(https://www.rcsb.org/)下載SARS-CoV-2 3CL水解酶(PDB ID：6LU7)和血管緊張素轉化酶II(ACE2)(PDB ID：1R42)的3D結構PDB格式文件，利用PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數據庫下載化濕敗毒方排名前三活性成分的3D結構，使用Autodock-4.2軟件進行。將蛋白導入，并對其加氫、加電荷等處理，然后將受體和配體進行分子對接，最后利用PyMOL對結果進行分析及可視化。

2 結果

2.1 化濕敗毒方現代藥理學研究

雖然新冠肺炎的發生機制尚不明確，但病毒感染及感染后的炎癥過程是明確的，因此,抗炎與抗病毒是治療的關鍵，化濕敗毒方由麻杏石甘湯、藿樸夏苓湯、宣白承氣湯、葶藶大棗瀉肺湯多個經典名方加減而來，這些方劑大部分均有抗炎及抗病毒作用。

2.1.1 抗炎作用

相關研究研究表明，麻杏石甘湯可以減輕肺部炎癥，主要通過提高機體的免疫能力，調節細胞因子的表達和分泌相關方面，可以明顯改善流感病毒性肺炎小鼠的一般狀況[4]。化濕敗毒方中藿樸夏苓湯，在抗炎、調節免疫具有重要作用，研究表明，藿樸夏苓湯具有抑制炎癥作用，能降低TNF-α、IL-6等炎癥細胞因子的含量，抑制NF-κB炎癥通路的表達[5]。化濕敗毒方中宣白承氣湯有抗炎作用，可以改善重癥肺炎患者的白細胞介素-6、腫瘤壞死因子-α水平，從而提高免疫功能，增強抗病能力[6]。葶藶大棗瀉肺湯可通過提高機體的免疫功能，減輕血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-8(IL-8)水平的影響，從而減輕從而減輕肺部炎癥[7]。這些研究為化濕敗毒方抗病毒作用提供了依據。

2.1.2 抗病毒作用

化濕敗毒方中麻杏石甘湯具有抗炎，抗病毒和調節免疫功能等方面作用，麻杏石甘湯發揮抗病毒作用主要表現在能夠下調流感病毒感染的巨噬細胞IFN-α、IFN-β分泌水平和蛋白表達水平[8]。網絡藥理學研究表明，麻杏石甘湯里面不同的化學成分，作用在靶標蛋白上，形成一個分子網絡，對病毒入侵、病毒復制及繼發炎癥因子造成多器官損傷起作用，同時對侵襲過程進行截斷，以調控宿主免疫進行抗感染[9]。現代藥理研究發現，藿樸夏苓湯中藿香，其主要活性成分有廣藿香醇、廣藿香酮，均具有顯著的抗炎、抗病毒作用，能很好抑制病毒的活性[10]。網絡藥理學研究表明，藿樸夏苓湯通過菲酮、黃芩苷、酸棗仁皂苷等主要活性化合物，具有潛在的抗SARS-CoV-2作用，可能通過阻斷SARS-CoV-2病毒蛋白合成，起到抗病毒治療作用[11]。

現代藥理學研究也證實了該方中的多個構成方劑具有抗炎、抗病毒、調節免疫的功能，是目前公認的治療新冠肺炎療效確切的中藥方劑，這些研究為化濕敗毒方抗病毒作用提供了依據。

2.2 化濕敗毒方在治療COVID-19有效成分及其靶點篩選結果

通過檢索TCMSP數據庫最終篩選收集到化濕敗毒方藥物中13味藥(石膏未收集在數據庫內)，共有269個有效活性成分納入本次研究，其中麻黃23個、苦杏仁19個、廣藿香11個、厚樸2個、蒼術9個、草果8個、半夏13個、茯苓15個、大黃16個、黃芪20個、葶藶子12個、赤芍29個、甘草92個，部分關鍵活性化合物見表1。對這些藥物靶點預測，去重后提取到靶點基因261個。

表1 化濕敗毒方部分活性化合物基本信息

續表1(Continued Tab.1)

材料Herb分子號MOLID活性成分Moleculename口服生物利用度OB(%)類藥性DLMOL005190Eriodictyol71.790.24MOL004328Naringenin59.290.21杏仁AlmondMOL010921Estrone53.560.32MOL010922Diisooctylsuccinate31.620.23MOL00221111,14-Eicosadienoicacid39.990.20MOL002311Glycyrol90.780.67MOL004841LicochalconeB76.760.19MOL005017Phaseol78.770.58MOL007207Machiline79.640.24MOL012922l-SPD87.350.54藿香AgastacherugosaMOL002879Diop43.590.39MOL005890Pachypodol75.060.40MOL0059115-Hydroxy-7,4′-dimethoxyflavanon51.540.27MOL005916Irisolidone37.780.30MOL005918Phenanthrone38.700.33MOL005921Quercetin7-O-β-D-glucoside49.570.27厚樸MagnoliaMOL005970Eucalyptol60.620.32MOL005980Neohesperidin57.440.27蒼術AtractylodeslanceaMOL000173Wogonin30.680.23MOL000184Nsc6355139.250.76MOL000186Stigmasterol3-O-beta-D-glucopyranoside_qt43.830.76MOL0001883β-acetoxyatractylone40.570.22MOL000085Beta-daucosterol_qt36.910.75MOL000088Beta-sitosterol3-O-glucoside_qt36.910.75MOL000092Daucosterin_qt36.910.76MOL000094Daucosterol_qt36.910.76草果TsaokoMOL000073Ent-Epicatechin48.960.24MOL000074(4E,6E)-1,7-bis(4-hydroxyphenyl)hepta-4,6-dien-3-one67.920.24MOL000085Beta-daucosterol_qt36.910.75MOL000088Beta-sitosterol3-O-glucoside_qt36.910.75MOL000096(-)-Catechin49.680.24MOL000098Quercetin46.430.28半夏PinelliaMOL00175524-Ethylcholest-4-en-3-one36.080.76MOL002670Cavidine35.640.81MOL000449Stigmasterol43.830.76MOL00693610,13-Eicosadienoic39.990.20MOL00693712,13-Epoxy-9-hydroxynonadeca-7,10-dienoic42.150.24茯苓PoriacocosMOL000275Trametenolicacid38.710.80MOL0002767,9(11)-Dehydropachymicacid35.110.81

續表1(Continued Tab.1)

材料Herb分子號MOLID活性成分Moleculename口服生物利用度OB(%)類藥性DLMOL000282Ergosta-7,22E-dien-3beta-ol43.510.72MOL000283Ergosterolperoxide40.360.81MOL000290PoricoicacidA30.610.76MOL000296Hederagenin36.910.75MOL000300Dehydroeburicoicacid44.170.83大黃RhubarbMOL002235Eupatin50.800.41MOL002251Mutatochrome48.640.61MOL002259Physciondiglucoside41.650.63MOL002260ProcyanidinB-5,3′-O-gallate31.990.32MOL002281Toralactone46.460.24MOL002280Torachrysone-8-O-beta-D-(6′-oxayl)-glucoside43.020.74MOL002293SennosideD_qt61.060.61MOL002303PalmidinA32.450.65MOL000471Aloe-emodin83.380.24黃芪AstragalusMOL000211Mairin55.380.78MOL000239Jaranol50.830.29MOL000296Hederagenin36.910.75 MOL000354Isorhamnetin49.600.31MOL0003713,9-Di-O-methylnissolin53.740.48MOL0003787-O-Methylisomucronulatol74.690.30MOL000392Formononetin69.670.21MOL000398Isoflavanone109.990.30MOL000422Kaempferol41.880.24MOL000439Isomucronulatol-7,2′-di-O-glucosiole49.280.62MOL000098Quercetin46.430.28葶藶子LepidiaseedMOL00221111,14-Eicosadienoicacid39.990.20MOL000296Hederagenin36.910.75MOL000358Beta-sitosterol36.910.75MOL003908Cynotoxin99.940.78赤芍RedPeonyMOL001918Paeoniflorgenone87.590.37MOL001925Paeoniflorin_qt68.180.40MOL000358Beta-sitosterol36.910.75MOL004355Spinasterol42.980.76MOL000492(+)-Catechin54.830.24MOL006992(2R,3R)-4-methoxyl-distylin59.980.30MOL007003Benzoylpaeoniflorin31.140.54MOL007004Albiflorin30.250.77MOL0070148-Debenzoylpaeonidanin31.740.45MOL007022EvofolinB64.740.22

續表1(Continued Tab.1)

材料Herb分子號MOLID活性成分Moleculename口服生物利用度OB(%)類藥性DLMOL007025Isobenzoylpaeoniflorin31.140.54MOL002883Ethyloleate(NF)32.400.19MOL005043Campest-5-en-3beta-ol37.580.71甘草 LicoriceMOL005012Licoagroisoflavone57.280.49MOL004948Isoglycyrol72.670.59MOL000098Quercetin46.430.28

2.3 COVID-19潛在靶點的預測

通過檢索GeneCards數據庫，得到COVID-19相關靶標有251個。將化濕敗毒方和COVID-19潛在靶點進行映射取交集共得到49個交叉靶點，即化濕敗毒方治療COVID-19潛在作用靶點(見圖1)。

圖1 化濕敗毒方與COVID-19靶點的韋恩圖

2.4 PPI網絡與核心靶點

化濕敗毒方PPI網絡圖(圖2)。圖中共涉及個49節點、576條邊，其中節點越大度值越大，邊的粗細反應連接評分，邊越粗評分越高，關系越密切，顏色由藍變黃程度與度值和介值均呈正相關。靶蛋白平均節點度值為12.25，超過平均度值的靶蛋白有20個，對排名前30的靶點蛋白進行統計并繪制條形圖(圖3)。結果顯示IL6、MAPK8、MAPK1、IL1B、RELA、CASP3等靶蛋白可能是化濕敗毒方防治COVID-19疾病的潛在關鍵靶點。

2.5 GO生物功能注釋及KEGG通路富集

利用R語言3.6.2程序基于bioconductor等數據包提取信息，設定閾值P<0.05，GO富集分析包括1 547條生物過程(biological process，BP)、29條細胞組分(cellular component，CC)以及86項分子功能(molecular unction，MF)。對排名前20的GO富集分析，如圖4(A-C)所示。

圖2 化濕敗毒方作用COVID-19交集靶點的PPI網絡

圖3 化濕敗毒方作用COVID-19關鍵核心靶蛋白

圖4 核心靶點的GO富集分析

BP分析(圖4A)可以看出，這些靶點主要涉及對脂多糖的反應、細胞對細菌來源分子的反應，細胞對生物刺激的反應，氧化應激反應等生物過程。

CC分析(圖4B)可以看出，靶點主要涉及膜筏、膜微結構域、膜區、粘著斑等細胞組分。

MF分析(圖4C)中可以看出，靶點主要涉及細胞因子受體結合、細胞因子活性、磷酸酶結合，BH結構域結合、死亡域、磷酸酶結合等分子功能。

根據設定閾值P<0.05為篩選條件，KEGG通路富集篩選得到156條信號通路，以富集基因數目進行排序，排名前20的通路(如圖5)所示，主要富集在卡波西氏肉瘤相關皰疹病毒感染、人巨細胞病毒感染、甲型流感、IL-17通路、TNF通路、AGE-RAGE通路等，這些通路發揮抗病毒、抗炎、免疫調節等作用，說明化濕敗毒方主要活性成分的作用靶點分布在不同的代謝通路，多成分、多靶點相互調節是治療COVID-19的可能機制。

圖5 核心靶點的KEGG通路富集分析

2.6 化合物-靶點網絡圖

將收集的藥物的活性成分及收集的交叉靶點，利用Cytoscape3.7.0軟件繪制“化合物-靶點”網絡圖。如(圖7)所示，長方形代表化濕敗毒方預測靶點活性成分，橢圓形代表活性成分，節點之間的邊表示成分與靶點之間的相互作用關系。根據網絡拓撲分析結果，以節點度值的平均數作為篩選標準，同時參考其中心度值，對化學成分和靶點進行排序，其中排名較前主要核心化合物為：槲皮素、木犀草素、山奈酚、漢黃芩素、柚皮素、β-谷甾醇、黃芩素等，靶點排名較前主要有IL6、MAPK8、MAPK1、IL1B、RELA、CASP3等靶點。

圖6 化合物-靶點網絡圖

2.7 化濕敗毒方有效成分作用于COVID-19 3CL水解酶及ACE2的分子對接結果

一般配體與受體結合的構象穩定時能量越低，發生的作用可能性大，一般以結合能(binding energy)≤-5.0 kJ/mol為篩選標準，本文將網絡拓撲分析所得度值排名前三的核心化合物(因石膏未收集在TCMSP數據庫，此處將石膏有效成分碳酸鈣納入分子對接進行篩選)與SARS-CoV-2 3CL水解酶及ACE2受體進行分子對接，對接結果顯示(表2)，提示排名前三核心化合物與受體結合活性較高，對接情況(圖8)所示。并與目前臨床使用的抗病毒藥物洛匹那韋、瑞德西韋比較，其結合能未見顯著差異。由此可見這些核心化合物與受體蛋白形成構象能量低，結構穩定，結合活性較高。

表2 化濕敗毒方活性成分與3CL水解酶和ACE2的對接結果

圖7 化濕敗毒方核心活性化合物與3CL水解酶、ACE2的分子對接模式

3 討論

COVID-19為感受“疫癘”之邪而發生的一種急性傳染病，目前根據全國疫情流行情況，結合臨床癥狀分析可將COVID-19歸屬于中醫“疫病”范疇[2]。目前臨床COVID-19可分為輕型、普通型、重型、危重型四個分型，其中重型COVID-19的治療非常關鍵，是疾病好轉或者加重的分嶺點，如果不能及時有效治療可能發展為危重型，甚至出現死亡。重型COVID-19推薦使用化濕敗毒方治療，此方具有攻補兼施，扶正祛邪作用，發揮中醫扶正與祛邪治療的特點，有效緩解病情,最終達到治愈疾病的目標[19]。中醫藥在治療傳染病中有較好的預防和治療作用，中醫藥以其獨特的療效起到重要作用，引起關注和肯定。在此次疫情防治工作中，中醫藥顯示了獨特的優勢。

本研究采用網絡藥理學的方法篩選出化濕敗毒方核心化合物主要有槲皮素、木犀草素、山奈酚、漢黃芩素、柚皮素、β-谷甾醇、黃芩素等。其中槲皮素度值最大，靶點數最多，說明其作用可能最顯著。槲皮素主要作用有消炎、抗病毒和免疫調節等藥理學作用，其作用機理主要阻止病毒受體復合物不能進入細胞，從而導致病毒死亡[12]。木犀草素具有抗病毒、消炎、抗氧化等相關方面作用，相關動物研究實驗表明，木犀草素可減少腫瘤壞死因子α的釋放，同時還有抑制肺組織間的炎癥作用[13]。研究發現，山奈酚能通過降低MAKP、NF-κB等通路的活性來抑制TNF-α、IL-1β、IL-6等的相關炎癥因子表達水平，起到抗炎作用[14]。漢黃芩素可抑制體內補體系統的過度激活，改善病毒導致急性肺部損傷的作用[15]。柚皮素作用功能多，具有抗炎、抗病毒、抗氧化、抗纖維化、免疫調節等多種藥理活性[16]。β-谷甾醇和黃芩素均具有抗炎、抗病毒、抗氧化、免疫等藥理作用[17,18]。綜上化濕敗毒方的主要化合物基本都具有抗病毒、抗炎、調節免疫力的作用。

為了進一步進行分子對接以尋求化濕敗毒方治療COVID-19的物質基礎，將排名前三的核心化合物與SARS-CoV-2 3CL水解酶及ACE2受體進行分子對接。而研究發現，SARS-CoV-2是一種RNA冠狀病毒，其通過3CL水解酶，將病毒復制酶多聚蛋白轉化成功能蛋白[19]，而SARS-CoV-2進入宿主細胞主要依靠血管緊張素轉換酶2(ACE2)受體[20]，因此，通過抑制SARS-CoV-2 3CL水解酶及ACE2受體有著重要的意義。從對接結合能和對接模式來看篩選的槲皮素、木犀草素、山奈酚化合物與SARS-CoV-2 3CL水解酶和ACE2均有較好的結合，可能是化濕敗毒方防治COVID-19主要物質基礎。此外，槲皮素、木犀草素、山奈酚結合能與陽性對照藥洛匹那韋、瑞德西韋、利托那韋均較接近，進一步證明化濕敗毒方活性成分與3CL水解酶及ACE2受體具有良好結合活性。

為了探討化濕敗毒方治療COVID-19分子機制，預測出的關鍵靶點有IL6、MAPK8、MAPK1、IL1B、RELA等。研究表明，IL6、IL1B在RT-PCR和Western blotting法檢測中，H1N1感染組中IL6I、L1B表現上調[21]。MAPK8和MAPK1是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族成員之一，它們在包括氧化應激、病毒感染等相關內環境應激下被激活[22]。RELA是NF-κB的家族成員之一，RELA在中性粒細胞的凋亡中發揮著重要的作用[23]。所以化濕敗毒方可能調控這些細胞炎性因子以及相關趨化因子的活性，進而影響炎性反應。

從GO生物過程富集結果顯示化濕敗毒方治療COVID-19，主要涉及炎癥應答、氧化還原過程、免疫應答等生物過程，這些生物過程在化濕敗毒方治療COVID-19中起到了關鍵作用。KEGG通路富集主要涉及富集在卡波西氏肉瘤相關皰疹病毒感染、人巨細胞病毒感染、甲型流感、IL-17通路、TNF通路、AGE-RAGE通路等，其中卡波西氏肉瘤相關皰疹病毒感染、人巨細胞病毒感染、甲型流感等通路與COVID-19感染源相似，即病毒感染。而腫瘤壞死因子信號通路、白介素-17信號通路均是炎癥反應中其重要作用的通路[24]。以上結果提示化濕敗毒方可能通過抗病毒、抗炎、免疫調節等途徑起到治療COVID-19的作用。

綜上所述，本研究基于現代藥理學機制進行探討，然后運用網絡藥理學方法預測化濕敗毒方治療COVID-19的作用機制研究，并借助分子對接技術進行靶點驗證，揭示了化濕敗毒方治療COVID-19“多成分、多靶點、多通路”的特點，但是由于網絡分析具有一定的局限性，對現階段對本病發生、進展等機制機理的尚不清楚，仍然需要通過進一步的實驗驗證。