沙棘總黃酮抑制肺癌A549增殖和遷移作用及機理

賈 叢，杜亞蓉,2*，孫 坤*

1西北師范大學 生命科學學院；2中國科學院 近代物理研究所，蘭州 730000

沙棘隸屬于胡頹子科(Elaeagnaceae)沙棘屬(Hippophae)，為小喬木或灌木。沙棘黃酮類化合物是沙棘最重要的活性成分之一，其單一黃酮類化合物以槲皮素、異鼠李素、山奈酚為主。具有抗腫瘤[1]、抗炎[2]、保護心腦血管[3]、提高機體免疫力[4]等方面的功效。肺癌是目前世界上最常見的癌癥之一，具有發病率高、死亡率高等特點，其死亡率較高的主要原因是肺癌患者在首次診斷后經常發生轉移和產生放化療抗性[5]。近年來，沙棘在抗腫瘤方面的研究工作逐漸得到認可，且沙棘總黃酮的腸吸收特性明顯優于單一黃酮類化合物異鼠李素[6]。已有研究證明，沙棘中黃酮類化合物對結腸癌HT29細胞[7]，前列腺癌PC-3細胞[1]，乳腺癌Bcap-37細胞[8]等多種腫瘤細胞都具有抑制作用。在非小細胞肺癌中，黃酮類化合物對順鉑等一些化療藥物有增敏作用[9]。本研究以沙棘屬的3種沙棘植物為材料，檢測其總黃酮對A549增殖的抑制作用，進一步分析西藏沙棘總黃酮對肺癌細胞侵襲和遷移能力的影響，并初步探討了相關分子機制，以期為高效開發利用沙棘資源提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

中國沙棘葉采自甘南藏族自治州阿萬倉，西藏沙棘葉、肋果沙棘葉均采自青海省祁連縣，經西北師范大學孫坤教授鑒定為西藏沙棘(H.tibetanaSchlecht.)、中國沙棘(H.rhamnoidesL.subsp.sinensisRousi)、肋果沙棘(H.neurocarpassp.neurocarpa)。

1.1.2 實驗試劑

甲醇及乙醇(國藥集團)；蘆丁標準品(北京Solarbio公司804D0218)；槲皮素、異鼠李素、山奈酚標準品(上海源葉公司)；RPMI-1640培養基(美國Hyclone公司)；胎牛血清(蘭州榮曄公司)；MTT(美國Spectrum Chemical公司)；jetPRIME?轉染試劑(法國PolyPlus-transfection公司)；DMSO(美國Sigma公司)；RIPA細胞裂解液(Biosharp公司)；AnnexinV-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒(Becton Dickinson公司)；MMP9、MMP2、TGF-β、E-cadherin、N-cadherin等5種抗體(Proteintech公司)，山羊抗兔IgG(中杉金橋公司)。

1.1.3 實驗儀器

流式細胞儀(Backman moflo XDP，美國)；倒置顯微鏡(Moticam 2306，中國)；二氧化碳培養箱(Thermo Scientific 311，美國)；凝膠成像系統(Tanon 4200，中國)；酶標儀(Tecan Infinite M200Pro，瑞士)；色譜柱(SunFire C18，美國)；色譜儀(QuiksepP0050d-11，北京)。

1.2 實驗方法

1.2.1 總黃酮提取

準確稱取干燥粉碎后的三種沙棘葉片各30 g，采用溶劑提取法，以固液比為1∶10的比例加入無水甲醇，40 ℃冷凝回流提取1 h，過濾，重復以上操作3次，并收集總和3次提取液。

1.2.2 總黃酮純化

用石油醚萃取葉綠素及脂溶性雜質后采用聚酰胺進行分離純化。將萃取后的沙棘提取液置于旋轉蒸發儀中進行濃縮至無醇后用蒸餾水溶解。過粒徑為100目聚酰胺層析柱，先用蒸餾水洗去雜質，后用70%～100%乙醇進行梯度洗脫，收集洗脫液。減壓濃縮至干燥。

1.2.3 總黃酮含量測定

1.2.3.1 蘆丁標準曲線繪制

用25 mL 30%乙醇定容溶解5 mg蘆丁標準品，配置為0.2 mg/mL的標準母液備用。準確吸取標準液0、1、2、3、4、5、6 mL于25 mL容量瓶中，加30%乙醇至10 mL，混合均勻后加5% NaNO2溶液1 mL，充分搖勻后靜置，吸取10% Al(NO3)31 mL混勻，6 min后再加入10 mL 1 mol/L的NaOH溶液，30%乙醇的定容至標準線，置室溫15 min。510 nm處測定三種沙棘醇提總黃酮吸光值。標準曲線以吸光度作為縱坐標y，濃度為橫坐標x進行分析繪制。

1.2.3.2 總黃酮含量測定

吸取10 mL已用30%乙醇溶解的沙棘總黃酮樣品，置于25 mL容量瓶中，采用蘆丁標曲方法測樣品510 nm處吸光值，代入標曲方程，計算三種沙棘總黃酮含量。

1.2.3.3 HPLC法測定三種沙棘總黃酮樣品中主要黃酮苷元含量比例關系

選用色譜柱(5 μm，4.6×250 mm)。流動相為甲醇、水(52∶48)，設置柱溫30 ℃，檢測波長370 nm，流速1 mL/min洗脫40 min。樣品進樣量為10 μL。

1.2.4 細胞培養

選取人非小細胞肺癌A549細胞系，用RPMI-1640培養基進行細胞培養。細胞需置于飽和濕度含5% CO2的37 ℃培養箱中進行培養。待細胞增長至對數期時，用胰酶對細胞進行消化傳代。

1.2.5 MTT檢測細胞相對活力

三種沙棘總黃酮用DMSO配成母液，實驗時用RPMI1640培養基稀釋至相應的濃度。消化對數生長期的細胞，稀釋細胞密度至5 000 個/孔接種于96孔培養板，置37 ℃、5% CO2的培養箱培養。待細胞貼壁12 h后，分別加入含有不同濃度(20、40、60、80、100 μg/mL)的沙棘總黃酮，對照組加入與實驗組同等質量濃度的DMSO。干預培養48 h后，加入20 μL MTT溶液，置于培養箱中繼續孵育4 h，移除培養基，150 μL DMSO加入各實驗孔，避光震蕩溶解。酶標儀570 nm處測定各孔吸光度值。

1.2.6 平板克隆形成實驗檢測克隆形成

將各組對數生長期的A549細胞消化，稀釋細胞密度為100 個/皿接種于60 mm培養皿中。實驗組選擇三種沙棘總黃酮的IC50值(西藏沙棘64.75 μg/mL、中國沙棘76.85 μg/mL、肋果沙棘95 μg/mL)處理A549細胞，陰性對照組加入含有與實驗組相同濃度的DMSO的完全培養基，培養48 h后，更換新鮮完全培養基繼續培養10～14天，定期更換培養基，待出現肉眼可見克隆時終止培養，固定，結晶紫染色后計數統計。

1.2.7 軟瓊脂克隆形成實驗檢測細胞克隆形成

配制1%及0.7%瓊脂糖，高壓滅菌后置于38 ℃水浴鍋中保持融化狀態。配制2倍濃度RPMI培養基并加入20%FBS，置于38 ℃水浴鍋中加熱。以1∶1的比例充分混合1%瓊脂糖及培養基，吸取3 mL均勻鋪于60 mm培養皿底部，冷卻凝固。準備細胞，實驗分組與“1.2.6”一致，培養48 h后，消化細胞，調整細胞密度5 000個/皿，等比例與0.7%瓊脂糖混合，吸取3 mL鋪于下層膠上。靜置冷卻凝固。加培養基繼續培養，并隔天更換一次新鮮培養基，30天后統計細胞克隆數。

1.2.8 流式檢測細胞凋亡

實驗分組與“1.2.6”一致，消化收集細胞。采用Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡，遵照BD凋亡檢測試劑盒使用說明，進行染色，利用流式細胞儀上機檢測A549細胞發生凋亡的比例。

1.2.9 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力

消化對數生長期的細胞，接種于細胞培養皿中，實驗組加入含有64.75 μg/mL西藏沙棘總黃酮的RPMI1640培養基，對照組加入同等質量濃度的DMSO。干預處理48 h。消化細胞，稀釋細胞數量為106個/孔接種于6孔板中。待細胞貼壁且鋪滿板底后，用200 μL移液器垂直板底劃線。用PBS清洗至無漂浮細胞，再加入無血清培養基。培養0、24、48 h后，光學顯微鏡下進行觀察拍照。

1.2.10 Transwell實驗檢測細胞遷移能力

實驗分組與“1.2.9”一致，干預培養48 h后消化細胞，置于離心管中離心，吸掉培養基，加無血清培養基將細胞稀釋成7 000/200 μL。取200 μL加入Transwell小室內，小室外加入含血清培養基650 μL。放入培養箱培養24 h。無水甲醇固定40 min，吸除甲醇，結晶紫染色60 min，用脫脂棉擦除小室內側細胞。在光學顯微鏡下進行拍照，計數遷移細胞數，4倍物鏡下整體拍照小室內所有的細胞。

1.2.11 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力

將基質膠用無血清培養基按1∶8的比例進行稀釋。Transwell小室中加100 μL稀釋膠，培養箱放置至凝固。64.75 μg/mL西藏沙棘總黃酮干預培養48 h消化細胞，吸取1 mL于15 mL離心管中離心，吸掉培養基，加無血清培養基將細胞稀釋成2萬/100 μL，吸取100 μL加入到小室中，放入培養箱培養48 h。固定、染色、計數方法與“1.2.10”一致。

1.2.12 Western blot檢測蛋白表達

實驗組加入含有64.75 μg/mL西藏沙棘總黃酮，對照組加入同等質量濃度的DMSO，培養48 h后，培養皿中加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA細胞裂解液收集各實驗組蛋白，超聲離心后收集上清為蛋白樣品。采用Bradford法測定蛋白濃度。按照一定比例混勻收集的蛋白樣品及SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸10 min。制備分離膠與濃縮膠，蛋白上樣30 mA恒流電泳，130 mA恒流轉膜180 min，用5%的牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉1 h后，置于一抗中4 ℃過夜孵育，TBS洗液漂洗3次，置于二抗中孵育1 h，再次漂洗3次，顯影后，拍照記錄相關條帶。

1.2.13 RNA干擾抑制E-cadherin基因的表達

采用RNA干擾手段抑制A549細胞系中E-cadherin的表達，將A549細胞消化計數，以10萬/皿接種于35 mm培養皿中，待細胞達到轉染密度，加入配置好SiRNA轉染試劑復合物，培養6 h后換正常培養基，繼續培養48 h，Western blot檢測干擾抑制效率。

1.3 數據統計分析

2 實驗結果

2.1 三種沙棘總黃酮對A549細胞相對活力影響

MTT檢測結果如圖1所示，將20～100 μg/mL的三種沙棘總黃酮(TFH)作用于A549細胞48 h后，其細胞存活率較對照組都有顯著性降低(P<0.001)。將三種沙棘總黃酮對A549細胞相對活力影響進行統計，發現其細胞活力抑制效果依次為：西藏沙棘>中國沙棘>肋果沙棘。經分析計算西藏沙棘、中國沙棘、肋果沙棘總黃酮其半數抑制濃度IC50值分別為64.75、76.85、95 μg/mL。上述結果表明，西藏沙棘總黃酮對A549細胞活力抑制作用明顯優于中國沙棘及肋果沙棘。

圖1 三種沙棘總黃酮對A549細胞存活率的影響

2.2 三種沙棘總黃酮對A549細胞平板克隆形成的影響

由圖2可知，與對照組相比較，三種沙棘總黃酮均可顯著性減少單個A549細胞克隆形成數(P<0.05)。將三種沙棘總黃酮作用后的克隆形成數與對照組進行統計，西藏沙棘總黃酮可減少62%，顯著優于中國沙棘的40%及肋果沙棘的16%(P<0.05)。

圖2 三種沙棘總黃酮對A549細胞平板克隆形成的影響

2.3 三種沙棘總黃酮對A549細胞軟瓊脂克隆形成的影響

軟瓊脂克隆形成結果如圖3可知，經沙棘總黃酮處理的A549細胞克隆形成數顯著減少(P<0.001)。西藏沙棘、中國沙棘、肋果沙棘的克隆形成數依次減少81%、56%、31%?；谝陨戏治觯覀儼l現西藏沙棘提取的總黃酮抑制肺癌A549細胞腫瘤形成能力效果最顯著。

2.4 三種沙棘總黃酮對A549細胞凋亡的影響

三種沙棘總黃酮對A549細胞凋亡作用結果見表1，與對照組凋亡率4.21%相比，中國及肋果沙棘對A549細胞凋亡無顯著差異，細胞凋亡率分別為4.99%、4.94%。西藏沙棘總黃酮作用后，A549細胞凋亡顯著升高，凋亡率可達18.46%。但三種沙棘均顯著促進細胞壞死率，其促壞死率依次為：西藏沙棘(12.63%)>肋果沙棘(9.78%)>中國沙棘(8.04%)。

圖3 三種沙棘總黃酮對A549細胞軟瓊脂克隆形成的影響

表1 三種沙棘對三種沙棘總黃酮對A549細胞軟瓊脂細胞凋亡的影響

注：與空白對照組比較，***P<0.001。Note:Compared with control,***P<0.001.

圖4 三種沙棘總黃酮對A549細胞凋亡的影響

2.5 三種沙棘總黃酮樣品中主要黃酮苷元含量比例關系

經HPLC檢測分析結果見表2，提取的三種沙棘總黃酮樣品中，異鼠李素在三種苷元總量中占比均大于山奈酚及槲皮素。西藏沙棘中山奈酚∶槲皮素、異鼠李素∶槲皮素的比值均高于中國沙棘和肋果沙棘。肋果沙棘中山奈酚∶槲皮素比值偏低。

2.6 西藏沙棘總黃酮對A549細胞侵襲遷移能力影響

2.6.1 西藏沙棘總黃酮對A549細胞遷移能力影響

首先，我們選用劃痕實驗檢測西藏沙棘總黃酮處理后A549細胞遷移能力。劃痕實驗結果如圖5A所示，與對照組相比，經西藏沙棘總黃酮處理24 h的A549細胞，劃痕愈合度顯著降低了39%。處理48 h后，較對照組劃痕愈合度降低40.5%。上述結果表明，西藏沙棘總黃酮可顯著性抑制肺癌A549細胞遷移能力。隨后，Transwell實驗對劃痕實驗結果進行驗證，由圖5B可看出，經西藏沙棘總黃酮處理后，穿膜細胞明顯減少。

表2 三種沙棘總黃酮樣品中主要黃酮苷元含量比例關系(與槲皮素相比)

圖5 西藏沙棘總黃酮對A549細胞遷移能力影響

2.6.2 西藏沙棘總黃酮對A549細胞侵襲能力影響

同樣，通過Transwell實驗對西藏沙棘總黃酮對A549細胞侵襲能力影響進行評價。由圖6可知，西藏沙棘總黃酮可顯著性減少A549穿膜數，其侵襲抑制率可達81%。

圖6 西藏沙棘總黃酮對A549細胞侵襲能力影響

2.7 西藏沙棘總黃酮對侵襲遷移相關蛋白表達水平的影響

Western blot結果如圖7顯示，經西藏沙棘總黃酮處理的A549細胞，MMP9、MMP2、TGF-β及N-cadherin表達水平顯著性降低。而E-cadherin表達水平上調。

圖7 西藏沙棘總黃酮對MMP9、E-cadherin等蛋白表達水平的影響

2.8 西藏沙棘總黃酮對Si-E-cadherin細胞遷移能力影響

SiRNA敲低A549細胞系E-cadherin基因，如圖8所示，經Western blot實驗驗證A549 細胞系中E-cadherin蛋白顯著降低，可用于后續實驗。

選用Si-E-cadherin細胞再次進行劃痕實驗。結果如圖9A所示，與Si-NC組相比，Si-E-cadherin control組細胞劃痕愈合度顯著增加了16.3%(P<0.01)，而經西藏沙棘總黃酮處理的Si-E-cadherin細胞逆轉上述趨勢，劃痕愈合度較Si-E-cadherin control組顯著降低了17.5%。已經接近Si-NC組的細胞遷移能力。Transwell實驗結果如圖9B所示，經西藏沙棘總黃酮處理的Si-E-cadherin細胞，細胞穿膜數顯著減少(P<0.01)。我們得出結論，西藏沙棘總黃酮可逆轉因敲低E-cadherin而引起遷移能力的增強。

Western blot檢測西藏沙棘總黃酮對Si-E-cadherin A549細胞系中E-cadherin表達水平影響，結果如圖10，經西藏沙棘總黃酮處理的Si-E-cadherin A549細胞中，E-cadherin表達水平升高。

3 討論

肺癌是我國近年來發病率和病死率均較高的惡性腫瘤之一[5]，其死亡率較高的主要原因有容易復發轉移。眾所周知，腫瘤細胞的侵襲遷移能力是衡量腫瘤復發轉移的關鍵。腫瘤的轉移也是癌癥治療的難點之一。因此迫切需要尋找一種合適的輔助放化療藥物，以期降低轉移的風險，顯著提高肺癌患者的生存率。近年來，植物衍生化合物成為當今藥物研究的熱點，因此從藥食同源植物或草藥中尋找一種低毒副、高抗癌作用的化合物對癌癥輔助治療具有重要的意義。

圖8 Western blot檢測Si-E-cadherin細胞系中E-cadherin表達水平

圖9 西藏沙棘總黃酮對Si-E-cadherin A549遷移能力影響

圖10 西藏沙棘總黃酮對Si-E-cadherin A549細胞系中E-cadherin表達水平影響

本研究以沙棘屬的3種沙棘植物葉為材料，發現三種沙棘總黃酮均對肺癌A549細胞具有增殖抑制以及促凋亡作用。三種沙棘總黃酮抑制作用依次為：西藏沙棘>中國沙棘>肋果沙棘。有文獻報道，沙棘葉總黃酮的黃酮苷元成分以異鼠李素、槲皮素及山柰酚為主[10]。已有研究證實，三種苷元在肺癌A549中均可發揮細胞增殖抑制作用及促凋亡作用，三者可誘導由Bcl-2/Bax介導的線粒體依賴途徑的細胞凋亡過程[11-13]。進一步研究發現，在該細胞凋亡過程中，異鼠李素作用機制是通過促進CytoC釋放，致使ATP合成停止，從而引發膜電位異常[14]。且發現異鼠李素與槲皮素具有協同增效的作用，按比例混合兩者的增殖抑制效果顯著優于單一化合物[15]。

HPLC分析檢測三種沙棘總黃酮中均含有槲皮素、異鼠李素、山奈酚等黃酮類化合物，但其各黃酮苷元含量比例有明顯差異。其中西藏沙棘中山奈酚∶槲皮素、異鼠李素∶槲皮素的比值均遠高于中國沙棘和肋果沙棘。三種苷元的抗癌效果不盡相同，就肺癌A549而言，經10 μmol/L異鼠李素處理，其細胞的增殖率即可降至50%左右[16]。山奈酚半數致死濃度為47 μmol/L[12]，而槲皮素為74 μmol/L[13]。本研究中發現西藏沙棘中山奈酚∶槲皮素，異鼠李素∶槲皮素的比值均高于中國沙棘和肋果沙棘，也更好的解釋了西藏沙棘總黃酮在抑制增殖作用和侵襲遷移能力具有明顯的優勢。這一研究結果可為高效開發利用沙棘資源提供實驗依據。

進一步的研究中，我們選擇西藏沙棘總黃酮研究沙棘總黃酮對A549細胞侵襲遷移作用。本研究表明西藏沙棘總黃酮可顯著性抑制肺癌A549細胞遷移侵襲能力。本研究結果提示，沙棘總黃酮具有抑制肺癌細胞轉移的潛力，可為晚期肺癌的治療提供幫助。

腫瘤細胞的侵襲遷移是腫瘤細胞與宿主細胞及細胞外基質的多重作用的結果。E-cadherin的缺失是上皮細胞間質轉化的一個主要特征。其表達降低，致使細胞間的粘附能力減弱及細胞極性發生改變，從而導致腫瘤細胞的遷移[17]。在該研究中，沙棘總黃酮可上調E-cadherin表達，且可逆轉E-cadherin缺失所導致的遷移增加。由此可證明，沙棘總黃酮通過抑制肺癌EMT，從而抑制侵襲遷移。除此之外，該研究發現經沙棘總黃酮處理的A549細胞，其細胞中的TGF-β、MMP9表達量降低。MMP9是降解細胞外基質的關鍵成分，通過對基膜中IV型膠原與層粘連蛋白等細胞外基質的降解，從而促進腫瘤對周圍組織的浸潤侵襲[18]。且已有研究表明，金屬蛋白酶MMPs能切割位于細胞表面E-cadherin并將可溶性E-cadherin釋放到培養基中，從而影響細胞的侵襲遷移[19]。MMP9表達受不同細胞因子影響，其中包括TGF-β等。作為腫瘤微環境中的重要成分之一的TGF-β，可通過介導MMP9/MMP2，從而影響細胞侵襲遷移[20]。綜上所述，本研究認為沙棘總黃酮通過降低細胞中的TGF-β抑制MMP9表達并阻止肺癌EMT來抑制A549侵襲遷移。