不同干燥方法對珠蘭花揮發油成分及其生物活性的影響

趙昌恒，吳永祥，萬志兵*，武夢雪，王雅莉，曹田中，蘇 興

1黃山學院生命與環境科學學院，黃山 245041；2黃山霧云間生態農業開發有限公司，黃山 245200

珠蘭Chloranthusspicatus(Tunb.)Makino屬金粟蘭科常綠蔓性亞灌木植物[1]。珠蘭花具有優雅香氣，珠蘭花是窨制珠蘭花茶的重要原材料，珠蘭花與茉莉花、白蘭花和玳玳花一起被稱為“中國四大著名茶花”[2]。珠蘭鮮花和茶葉窖制的珠蘭花茶是我國傳統的花茶之一，黃山市歙縣珠蘭花茶歷史悠久，是黃山茶葉的重要組成部分。在故宮博物院收藏的清代《內務府奏銷檔》中，歙縣珠蘭花茶被乾隆皇帝列為貢茶。因而關于珠蘭花的研究也一直在持續進行中，但是前人研究一直關注于珠蘭花的栽培繁育等方面。關于珠蘭花的研究也有一些集中香氣成分研究中[3]，珠蘭花的干燥后的成分分析，以及成分的抗氧化、抑菌性能、對酪氨酸酶抑制作用等方面的研究都未見報道。

植物材料的干燥是植物樣品加工利用的最初步驟，是進一步進行樣品保存和其功能成分提取的預處理階段，不同干燥方法的選擇能顯著影響樣品功能性成分的保存。樣品在干燥過程過程中可能會發生不同程度的熱敏性成分的降解和揮發散失，也可能導致全新化合物的形成[4]，植物材料不同干燥會導致植物材料抗氧化、抗菌、對酪氨酸酶抑制作用以及感官特征呈明顯差異。Ozdemir等[5]研究表明不同干燥方式影響牛至OriganumvulgareL.揮發油成分的抗氧化活性；Zhang等[6]研究發現不同干燥方式檸檬Citruslimon(L.)Burm.f.皮揮發油的抗菌活性有較大差異。Farag等[7]揭示了大蒜AlliumsativumL.揮發油在冷凍干燥干燥條件下生物活性優于陰干。Liu等[8]研究表明不同干燥方法對杭白芷中的揮發油成分有一定的影響。因此，在植物資源加工利用過程中干燥方式的選擇至關重要，探索合適的干燥方式方法具有極為重要的應用價值和生產實踐意義。

本研究以珠蘭花鮮花為材料，采用自然干燥和鼓風加熱干燥，采用水蒸氣蒸餾法提取干燥后珠蘭花的揮發油，使用GC-MS對揮發油成分進行化學成分的定性和定量分析，探究干燥后的珠蘭花揮發油的還原能力、對DPPH和ABTS自由基的清楚能力及抑菌效果、對酪氨酸酶抑制作用，為珠蘭花的綜合利用于進一步開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

珠蘭花鮮花2019年5月采自于黃山霧云間生態農業開發有限公司生產基地。新鮮珠蘭花除去枝梗后分別采用陰干和熱風干燥2種方法干燥至恒重，熱風干燥，具體方法是：38 ℃，2 h；40 ℃，12 h；50 ℃，3 h，干燥后粉碎過20～40目篩子，干燥的珠蘭花粉末保存于干燥器中存放。大腸桿菌Escherichiacoli、金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus、枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis、綠膿桿菌Pseudomonasaeruginosa等購于無錫賽維科技有限公司。DPPH、ABTS、酪氨酸酶(tyrosinase，50 000 units)、左旋多巴等購于Sigma公司。白胨、牛肉膏、瓊脂：生物試劑，北京陸橋技術有限責任公司。SQ510C型高壓滅菌器(重慶雅馬拓科技有限公司)；AR124CN型電子天平，奧豪斯儀器(常州)有限公司；SpectraMax-190型全波長酶標儀(美國Molecular Devices公司)。

1.2 方法

1.2.1 揮發油的提取

稱取經過干燥后的珠蘭花粉末100.0 g 置于燒杯中，加重蒸餾水350 mL，用揮發油提取器按水蒸氣蒸餾法提取6 h，收集無水乙醚層，揮發無水乙醚溶劑，加入無水硫酸鈉進行干燥，得到具有濃郁香味淡黃色透明油狀物。取適量揮發油用正己烷稀釋，用于GC-MS檢測，其余的揮發油密封保存于4 ℃條件下，用于抗氧化、抑菌活性以及酪氨酸酶抑制作用的實驗。

1.2.2 揮發油成分分析

色譜條件：選用HP-5 MS 彈性石英毛細光柱(0.25 μm，30 m×0.25 mm)；載氣為高純氦氣，載氣流速為1.0 mL/min；分流比為40∶1，進樣量為1.0 μL；進樣口溫度為60 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升至280 ℃，保持10 min。

質譜條件：離子源溫度230 ℃，電離方式為EI，電子能量為70 eV，四級桿溫度為150 ℃；質量掃描范圍為35～450 u；溶劑延遲時間3 min；采用NIST08標準普庫進行檢索。

1.2.3 揮發油的抗氧化活性測定

1.2.3.1 清除DPPH自由基活性的測定

參考文獻Cherrat等[9]的方法略作改進：取1 mL不同濃度梯度珠蘭花揮發油(0.0、0.9、1.8、3.6 mg/mL)，加入3 mL DPPH-乙醇溶液，黑暗且室溫條件下震蕩30 min，測定波長為517 nm處樣品的吸光度，并計算自由基清除率I：I=(AO-AS)/AO×100%，計算公式中：AO為空白樣品吸光度；AS為珠蘭花揮發油和抗壞血酸樣品溶液吸光度。

1.2.3.2 清除ABTS自由基活性的測定

參照Hu等[10]的方法并略作修改，分別配置濃度為7 mmol/L的ABTS水溶液和濃度為2.45 mmol/L的過硫酸鉀水溶液，兩者按照等比例混合，混合液置于黑暗條件下反應16 h。以無水乙醇稀釋調整至在波長734 nm處吸光度為0.70±0.000 5，制備得到ABTS+溶液。取0.3 mL不同濃度梯度揮發油-乙醇樣液，加入2.7 mL ABTS+溶液，30 ℃水浴加熱6 min，于波長734 nm處測定吸光度，并計算自由基清除率I。

1.2.4 揮發油的抑菌活性測定

參考Abdelli等[11]的方法并進行改進。將活化后的大腸桿菌Escherichiacoli、金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus、枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis和綠膿桿菌Pseudomonasaeruginosa，以平板菌落計數法調整至106～107CFU/mL。MH(Mueller Hinton)平板中加入調整后的4種菌懸浮液100 μL，用涂布棒均勻涂布，并干燥。在中央加入10 μL揮發油，以丙酮為空白對照，以5%吐溫80溶液為陰性對照，以對羥基甲酸丙酯(propylparaben，PP)為陽性對照，37 ℃培養箱中倒置培養24 h，設置3次重復，測量記錄抑菌圈(diameters of inhibition zones，DIZ)直徑的大小，以mm為單位，取其平均值。

1.2.5 揮發油酪氨酸酶抑制作用的測定

根據Tang等[12]的測定方法稍加改進，具體如下：向96孔板中依次加入50 μL磷酸緩沖液(pH=6.8)、80 μL 10 mM的左旋多巴與50 μL不同濃度(0.9、1.8、3.6 mg/mL)的 HAD-VO和SD-VO，混勻后反應5 min，加入20 μL 125 unit/mL的酪氨酸酶溶液，37 ℃恒溫反應15 min，于475 nm波長處測定吸光度值。以Arbutin為陽性對照，并按照下列公式計算酪氨酸酶抑制率：

式中，I：表示酪氨酸酶抑制率；AS：表示樣品組吸光度值；ASB：表示樣品對照組吸光值；AC：表示空白組吸光值；ACB：表示空白對照組吸光值。

1.3 數據處理

利用Excel對數據進行輸入和初步處理，使用SPSS18.0軟件對實驗結果進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 不同干燥方法對珠蘭花揮發油成分及含量的影響

不同干燥方法珠蘭花揮發油化學成分GC-MS分析的總離子流圖見圖1。由圖1可知，兩種方法干燥后珠蘭花揮發油總離子流圖基本相似。用NIST08質譜圖庫對各組分峰進行檢索，兩種干燥處理所得的揮發油共鑒定出62種化合物，鼓風加熱干燥法(HAD-VO)鑒定出58種，被鑒定化合物相對含量占揮發油總量的94.12%，陰干法(SD-VO)鑒定出56種，被鑒定化合物相對含量占揮發油總量的92.43%，兩種方法共有物質52種。珠蘭花揮發油化合物種類較多，以烯、酮、醇為主。鼓風加熱干燥法中烯類物質占47.95%，陰干法中稀類物質占38.84%。酮類物質分別為11.82%和15.5%，醇類物質分別為24.29%和31.22%。珠蘭花揮發油中含量較高成分有1-(1，4-二甲基-3-環己烯-1-基)乙酮(HAD-VO:11.33%，SD-VO:15.55%)，別香橙烯(HAD-VO:6.12%，SD-VO:11.25%)，匙桉醇(HAD-VO:5.75%，SD-VO:5.94%)，3-甲氧基苯甲醇(HAD-VO:5.08%，SD-VO:11.04%)。

圖1 珠蘭花熱風干燥(a)、陰干(b)揮發油GC-MS總離子流圖

表1 不同干燥處理珠蘭花揮發油的化學成分及其相對含量

續表1(Continued Tab.1)

序號No.保留時間tR(min)化合物Compound分子式Formula相對含量Relativecontent(%)HAD-VOSD-VO3831.40肉豆蔻醚MyristicinC11H12O32.071.683931.50表水菖蒲酮EpishyobunoneC15H24O0.49-4031.97異丁香酚甲醚MethylisoeugenolC11H14O20.16-4132.32橙花叔醇NerolidolC15H26O0.840.604232.61γ-芹子烯γ-SelineneC15H240.380.214333.16雅欖藍烯Eremophilene C15H24-0.174433.31匙桉醇EspatulenolC15H24O5.755.944533.584-丁基茴香醚4-ButylanisoleC11H16O0.29-4633.692,5-二叔丁基-1,4-苯醌2,5-Di-tert-butyl-1,4-benzoquinoneC14H20O21.701.504733.901-(1,4-二甲基-3-環己烯-1-基)乙酮1-(1,4-Dimethyl-3-cyclohexen-1-yl)-EthanoneC10H16O11.3315.554834.02去羥基異水菖蒲二醇Dehydroxy-isocalamendiolC15H24O0.480.294934.12苯并[b]噻吩-3-乙酸Benzo[b]thiophene-3-aceticacidC10H8O2S1.080.515034.26τ-杜松醇τ-CadinolC15H26O3.445.275134.47SpirojatamolC15H26O1.010.975234.61(-)-桉油烯醇(-)-SpathulenolC15H24O0.530.545334.66異斯巴醇Isospathulenol C15H24O0.650.605434.92α-杜松醇α-CadinolC15H26O3.873.335535.05β-桉葉醇β-EudesmolC15H26O0.380.465635.18NeointermedeolC15H26O0.540.645735.24α-紅沒藥醇α-BisabololC15H26O0.640.455835.37β-桉葉烯β-EudesmeneC15H240.160.195935.53α-愈創木烯α-GuaieneC15H240.280.246036.09異喇叭烯IsoledeneC15H240.430.506136.20茉莉酮酸甲酯MethyljasmonateC13H20O30.390.416237.503-甲氧基苯甲醇3-MethoxybenzylalcoholC8H10O25.0811.04

2.2 揮發油的抗氧化活性測定

珠蘭花揮發油和陽性對照清除ABTS自由基能力如表2所示。珠蘭花揮發油有一定的ABTS自由基清除能力，在0.9～3.6mg/mL內，熱風干燥珠蘭花揮發油對ABTS自由基清除率分別為10.08%、23.20%、50.91%，而陰干珠蘭花揮發油對ABTS自由基清除率分別為6.13%、11.98%、21.90%。不同種干燥方式的珠蘭花揮發油對ABTS自由基清除率隨著揮發油質量濃度的增加，清除能力隨之增強。在珠蘭花揮發油相同濃度下，熱風干燥的珠蘭花揮發油對ABTS自由基清除率顯著高于陰干的珠蘭花。最高濃度的熱風干燥的珠蘭花揮發油對ABTS自由基清除率也顯著低于陽性對照。

由表2可知，珠蘭花揮發油對DPPH自由基清除能力表現出明顯的劑量效應，隨著珠蘭花揮發油濃度的增加，DPPH自由基清除能力也隨之增強，前差異達到顯著水平(P<0.05)。在揮發油相同濃度下，熱風干燥的珠蘭花揮發油對DPPH自由基清除率顯著高于陰干的珠蘭花。在珠蘭花揮發油濃度為3.6mg/mL時，熱風干燥的珠蘭花揮發油對DPPH自由基清除率為61.36%，顯著高于陰干的珠蘭花揮發油對DPPH自由基清除率32.57%，但是顯著低于陽性對照對DPPH自由基清除率81.42%。

表2 不同干燥處理對珠蘭花揮發油抗氧化活性的影響

注：同列不同字母表示在統計學上具有顯著差異(P<0.05)。

Note:Different letters in the same column show statistically significant differences(P<0.05).

通過以上分析表明，珠蘭花揮發油具有一定的抗氧化活性，但活性相對較弱。可能需要提高揮發油濃度才能達到陽性對照對ABTS自由基和DPPH自由基的清除率。

2.3 揮發油的抗菌活性測定

由圖2可知，珠蘭花揮發油對四種供試菌均有一定的抑制作用，但其抑菌活性要弱于對羥基苯甲酸丙酯。珠蘭花揮發油對金黃色葡萄球菌具有顯著的抑制效果，鼓風干燥的珠蘭花揮發油最大的抑菌圈直徑為13.50±0.61 mm，陰干的珠蘭花揮發油最大的抑菌圈直徑為12.83±1.18 mm，都低于陽性對照PP(1 mg/mL)濃度為1.0 mg/mL時，最大抑菌圈直徑14.53±1.00 mm，但是差異沒有達到顯著水平。

珠蘭花揮發油對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和綠膿桿菌具有一定的抑菌作用，鼓風干燥的珠蘭花揮發油最大的抑菌圈直徑分別為10.97±0.47、11.23±0.12、12.10±0.82 mm，陰干的珠蘭花揮發油最大的抑菌圈直徑分別為9.83±0.35、9.53±0.25、12.27±1.33 mm，但都顯著低于陽性對照。鼓風干燥的珠蘭花揮發油對大腸桿菌和綠膿桿菌的抑制顯著強于陰干的珠蘭花揮發油對兩者的抑制。也表明這兩種干燥方法對于珠蘭花成分的保存存在一定的差異。

圖2 不同干燥處理對珠蘭花揮發油抑菌作用的影響

2.4 揮發油酪氨酸酶抑制作用的測定

不同干燥處理對珠蘭花揮發油酪氨酸酶抑制作用見圖3。從圖3可以看出，鼓風干燥或者陰干處理中，同一種干燥方式中隨著濃度的增加抑制酪氨酸酶的活性增強，表現為呈濃度依賴的方式抑制酪氨酸酶活性。在揮發油濃度為3.6 mg/mL時，鼓風干燥的珠蘭花揮發油對酪氨酸酶抑制作用達到68.47%，略高于對照組的64.61%，但是沒有達到顯著水平，顯著高于陰干的珠蘭花揮發油對酪氨酸酶抑制作用(51.63%)。

圖3 不同干燥處理對珠蘭花揮發油酪氨酸酶抑制作用的影響

3 討論與結論

野生植物資源是人類擁有的無比巨大的財富，開發利用野生植物資源有利于保護生態系統中各個物種的平衡，也是實施天然林資源保護的需要，并符合經濟開發中的物盡其用、綜合開發、產生最大經濟效益的原則，因此，合理開發利用我國豐富的野生植物資源對其經濟發展起著巨大作用。野生植物資源含有的各種對人類生產、生活有用的化合物，對植物資源的成分的研究，有助于進一步開發利用植物資源。

許多植物中蘊藏著迄今人們仍未得知的許多有用成分。本研究中采用水蒸氣蒸餾法提取珠蘭花的揮發油，通過GC-MS對揮發油化學成分進行分離鑒定出62種化合物，鼓風加熱干燥法鑒定出58種，被鑒定化合物相對含量占揮發油總量的94.12%，陰干法鑒定出56種，被鑒定化合物相對含量占揮發油總量的92.43%，兩種方法共有物質52種，表明這兩種干燥方法導致成分及含量存在一定的差異，這與Liu等[8]研究不同干燥方法對杭白芷中揮發油類化學成分的影響結果類似，以及Cheng等[13]研究不同干燥方法對紅花玉蘭揮發油成分的結果都相似，也說明干燥方式的研究對于開發利用植物資源具有重要意義。

珠蘭花揮發油化合物種類較多，以烯、酮、醇為主。Wang[3](2003)采用同時-蒸餾萃取法制備珠蘭花香精油，利用氣相色譜和氣質聯用分析從珠蘭中鑒定出78種香氣化合物，其中醇類15種，酯類4種、碳氫化合物44種，酮類6種，醛類2種，含氮化合物2種，其它5種。可見珠蘭花中化學成分種類非常豐富。珠蘭花揮發油中含有多種具有應用價值的化學成分，如1-(1，4-二甲基-3-環己烯-1-基)乙酮是珠蘭花揮發油成分中含量最高的物質，鼓風加熱干燥方式中含量為11.33%，陰干方式中含量為15.5%，而該物質也是毛細辛和銅錢細辛揮發油中含量最高的物質，含量分別為14.16%和14.24%[14]。這種物質的功能尚未明確，但是細辛具有歸心、肺、腎經，具有祛風散寒、通竅止痛、溫肺化飲的功效，臨床上常用于治療風寒頭疼、痰飲咳喘、關節疼痛、鼻塞、牙痛等[15]，細辛也是治療新型冠狀病毒肺炎通用方劑中的成分之一[16]。該物質在珠蘭花中含量也是最高的，表明珠蘭花有繼續開發利用的可能性。本研究的結果為進一步開發利用珠蘭花資源提供科學依據，促進對珠蘭花的綜合開發利用。

珠蘭花揮發油具有顯著的DPPH和ABTS自由基清除能力，鼓風加熱干燥珠蘭花揮發油較陰干珠蘭花揮發油具有更強的DPPH和ABTS自由基清除能力，抗氧化能力與揮發油質量濃度呈正相關，濃度越高珠蘭花揮發油抗氧化能力越強。珠蘭花揮發油抗氧化活性與其化學組成及含量有關系，烯烴、酮是重要的抗氧化活性成分[17,18]。珠蘭花揮發油成分種類多，各種成分之間也存在一定的協同作用，也在一定程度上加強抗氧化活性[19]。從抑菌結果可知，珠蘭花揮發油對金黃色葡萄球菌具有顯著的抑制效果，對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和綠膿桿菌具有一定的抑菌作用。鼓風加熱烘干珠蘭花揮發油抑制強度依次為：金黃色葡萄球菌>枯草芽孢菌>綠膿桿菌>大腸桿菌。陰干珠蘭花揮發油抑制強度依次為：金黃色葡萄球菌>枯草芽孢菌>大腸桿菌>綠膿桿菌。

珠蘭花揮發油對酪氨酸酶活性均具有一定的抑制能力，在一定范圍內隨著質量濃度增大，抑制率逐漸升高。在相同濃度揮發油的條件下，鼓風加熱干燥珠蘭花揮發油顯著強于陰干珠蘭花揮發油。酪氨酸酶是黑色素合成過程中的關鍵酶[20]，它可催化L-酪氨酸生成多巴，多巴逐步氧化生成多巴醌，進而形成色素顆粒，是引發黃褐斑、雀斑、老年斑及黑色素瘤等疾病的主要原因。酪氨酸酶抑制劑是現代美白化妝品和皮膚用藥的主要組成成分。植物資源中含有的天然活性成分毒副作用小、安全性高，比化學合成的抑制劑具有更大優勢，因此近年來逐漸成為酪氨酸酶抑制劑研究者的關注熱點。也表明珠蘭花可進一步開發成美白化妝品，甚至可以填加在皮膚用藥中。

綜上，鼓風干燥是珠蘭花最佳的干燥方法，珠蘭花揮發油成分中有抗氧化、抑菌、酪氨酸酶抑制作用，珠蘭花揮發油可進一步開發利用成美白化妝品或皮膚用藥中，本研究對珠蘭花揮發油提取工藝和產品的開發應用提供了重要的理論依據。