卟啉半遙爪聚合物的制備及其在光動力療法中的應用探討

陳 帥， 龐瑞淇， 劉思奕， 洪晨雨， 馬紹花， 杲 云， 田 佳

（華東理工大學材料科學與工程學院，上海 200237）

光動力療法是一種具有廣闊應用前景的癌癥治療的新型方法，由于其創傷性小、毒副作用低、選擇性高等優點受到日益廣泛的關注和研究[1-4]。該療法主要利用一定波長的光對富集于腫瘤部位的光敏劑（Ps）進行輻照，產生高度活性且細胞毒性的活性氧簇（ROS）如單線態氧（1O2）、羥基自由基(·OH)等, 這樣對細胞內的脂質、蛋白質、核酸等物質造成不可逆的損傷，從而達到殺死腫瘤細胞的目的[4-7]。光動力療法需具備Ps、光源和分子氧3 個基本要素，其中Ps是光動力過程中的核心要素[8-9]。卟啉及其衍生物是一類典型的Ps，因其在可見光區域有較強吸收、光穩定性好、1O2產率高等特點在光動力治療方面受到越來越多科學家的青睞[10-13]。但由于卟啉中四吡咯環的大π 結構，疏水性較強，在水溶液中很容易π-π 聚集產生自淬滅效應，嚴重降低了量子產率，限制了在光動力療法中的應用[14-18]。

為了解決卟啉類光敏劑親水性差的問題，國內外許多課題組已經做了大量研究，例如提出通過接枝親水性高分子或將Ps 包載于納米載體中的策略。Sun 等[19]通過開環聚合（ROP）合成了一系列以卟啉為核的星狀聚（ε-己內酯）-b-聚（環氧乙烷）（SPPCL-b-PEO）兩親性嵌段共聚物，可以自組裝成一定結構的納米組裝體，不僅可以改善卟啉的光動力效果，還可以用于包載疏水性藥物。Na 等[20]將乙酰化硫酸軟骨素（Ac-CS）和二氫卟吩（Ce6）通過酯鍵連接起來得到乙酰化硫酸軟骨素/二氫卟吩軛合物（Ac-CS/Ce6），在水相中可以組裝形成以Ce6 為內核，以CS 為親水性殼層的納米組裝體。由于Ce6 分子間距離很短發生自淬滅效應，熒光發射和1O2均受到抑制，在腫瘤細胞中CS 骨架被胞外基質和胞內組分如溶酶體切斷，其熒光可以恢復，產生大量1O2。Duan等[21]通過可逆加成-斷裂鏈轉移（RAFT）聚合合成了一種新穎的梳型卟啉端基功能化聚（N-異丙基丙烯酰胺）-b-聚（低聚甲基丙烯酸乙二醇甲醚）（Por-PNIPAM-b-POEGMA），由于引入了親水性的POEGMA，該共聚物的低臨界溶液溫度（LCST）比PNIPAM 均聚物的高，相變范圍為37～41.8 ℃。在650 nm 光照下該共聚物可以產生較多的1O2，可以有效地用于光動力治療。此外細胞實驗表明該共聚物暗毒性很低，在650 nm 紅光照射下對HeLa 細胞具有很顯著的光毒性。以上通過接枝親水性高分子合成高分子卟啉軛合物的方法，雖然能夠部分解決卟啉親水性不足的問題，但合成比較繁瑣，并且高分子鏈長對1O2產率和光動力療法的影響研究也較少。

本文通過“點擊化學”偶聯反應將不同分子量的親水性高分子聚乙二醇（PEG）與卟啉光敏劑（TPP）鍵合在一起，成功合成了一系列水溶性好的卟啉半遙爪聚合物（TPP-PEG），并研究了PEG 鏈長對1O2產率和細胞光毒性的影響，用以評價TPP-PEG 作為潛在的大分子光敏劑在光動力療法中的應用；同時本文進一步利用紫外-可見光譜檢測1O2產率和體外細胞實驗評價此類卟啉半遙爪聚合物的在光動力療法中的潛在應用。

1 實驗部分

1.1 原料和試劑

吡咯、苯甲醛、三氯乙酸、三氟乙酸、乙酸、3-溴丙炔、濃鹽酸（HCl）、無水碳酸鉀（K2CO3）、聚乙二醇（PEG，Mn=1 000，2 000，5 000）、抗壞血酸鈉、1,3-二苯基異苯并呋喃（DPBF）均購于阿拉丁試劑有限公司；亞硝酸鈉（NaNO2）購于上海凌峰試劑有限公司；氯化亞錫二水合物（SnCl2·2H2O）、醋酸鋅二水合物（ZnAc2·2H2O）購于上海笛柏生物科技有限公司；對甲基苯甲酰氯（TsCl）購于薩恩化學技術有限公司；疊氮化鈉（NaN3），五水合硫酸銅（CuSO4·5H2O），氯化鈉（NaCl）、氫氧化鈉（NaOH）、無水硫酸鈉（Na2SO4）、碳酸氫鈉（NaHCO3）、三乙胺（TEA）、丙酸、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基亞砜（DMSO）、二氯甲烷、四氫呋喃（THF）、石油醚、甲醇均購于國藥化學試劑有限公司；牛血清蛋白（FBS）、（Dulbecco’s modified eagle medium）、青霉素和鏈霉素均購于上海鈺康生物科技有限公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）購自碧云天生物技術有限公司，200～300 目（75～48 μm）硅膠購于江友硅膠開發有限公司；所有試劑均為分析純試劑。吡咯、二氯甲烷、DMF 在使用前均加入氫化鈣進行干燥處理，減壓蒸餾后方可使用。

1.2 測試與表征

核磁共振氫譜（1H-NMR）：采用德國Brucker 的AVANCE Ⅲ500 型核磁共振儀（400 MHz），以氘代氯仿（CDCl3）為溶劑，四甲基硅烷（TMS）為內標。

紫外-可見光吸收光譜（UV-Vis）：采用日本SHIMADZU 公司生產的型號為UV-2550 的紫外可見光光度計，將樣品配成溶液裝在光程為1 cm 的石英比色皿中檢測，掃描范圍300～700 nm。

動態光散射（DLS）：采用美國Beckman Coulter公司生產的Delasa Nano C particle Analyzer 型動態光散射儀，將組裝溶液裝在光程為1 cm 的石英比色皿中進行檢測。

分光光度計酶標儀：采用美國Thermo Fisher 公司生產的Multiskan MK3 型的分光光度計酶標儀，檢測492 nm 處的吸光度。

1.3 合成方法

半遙爪（Semitelechelic）聚合物是指分子末端帶有一個功能性基團的線型聚合物。首先通過取代反應、氧化還原反應等合成了炔基修飾的鋅卟啉（ZnTPP-alkyne）和末端含疊氮基的PEG（PEG-N3），在Cu+離子的催化作用下發生“點擊化學”反應得到鋅卟啉半遙爪聚合物（ZnTPP-PEG），之后加入鹽酸除去Zn2+得到最終的產物卟啉半遙爪聚合物（TPPPEG），合成過程見圖1。這類親水性的卟啉半遙爪聚合物能夠顯著提高光敏劑的親水性，解決光敏劑易聚集淬滅、1O2產率低、生物相容性差等問題。參考課題組之前的工作[13,22-23]，末端帶有卟啉的水溶性卟啉半遙爪聚合物TPP-PEG1000、TPP-PEG2000、TPPPEG5000的合成路線見圖2。

1.3.1 四苯基卟啉（TPP）的合成 在500 mL 三口燒瓶中加入苯甲醛（7.2 mL，70 mmol）和240 mL 丙酸攪拌均勻，抽真空、通氮氣3 次循環后，加熱至135 ℃回流，將恒壓滴液漏斗中干燥的吡咯（5.0 mL，70 mmol）逐滴滴加到反應瓶中，滴加完畢后繼續攪拌反應4 h。反應結束后冷卻至室溫并減壓蒸餾除去大部分丙酸，將反應液轉移至燒杯中并加入100 mL 甲醇，放于冰箱中冷藏過夜，次日抽濾得到紫色的粗產品，通過柱層析法以二氯甲烷為洗脫劑進一步純化，產物在真空烘箱中干燥，得到紫色固體化合物TPP（7.7 g，產率18%）。1H-NMR（400 MHz，CDCl3，δ）：8.84（m，8H，β?H），8.23（m，6H，Ar?H），7.80（m，12H，Ar?H），—2.75（s，2H，NH）。

1.3.2 單硝基苯基卟啉（TPP-NO2）的合成 將TPP（1.01 g，1.63 mmol）、冰乙酸（9.3 mL，162.9 mmol）、三氟乙酸（7.2 mL，92.9 mmol）和三氯乙酸（26.60 g，163.0 mmol）加入到100 mL 圓底燒瓶中，在冰水浴下攪拌15 min 使其混合均勻。將亞硝酸鈉（0.56 g，8.0 mmol）分為等量的3 份，每隔1 h 加一份到反應瓶中，加入完畢后冰水浴中繼續反應10 h。反應結束后將反應液倒入到50 mL 去離子水中淬滅反應，用50 mL二氯甲烷萃取3 次，合并有機相，并用碳酸氫鈉水溶液中和體系中過量的酸至溶液呈紫色，之后再用去離子水洗滌，無水硫酸鈉干燥，抽濾后濾液旋干放在真空干燥箱中干燥，得到粗產品化合物TPP-NO2（0.61 g，產率57 %）。1H-NMR（400 MHz，CDCl3，δ）：8.72～8.98（m，8H，β?H），8.65（m，2H，Ar?H），8.38（m，2H，Ar?H），8.20（m，6H，Ar?H），7.75（m，9H，Ar?H），—2.75（s，2H，NH）。

圖1 制備卟啉半遙爪聚合物TPP-PEG 納米膠束及其在腫瘤細胞中光動力過程的示意圖Fig. 1 Schematic diagram of the preparation of porphyrin semitelechelic polymers TPP-PEG nano-micelle and the process of PDT in tumor cells.

1.3.3 單氨基苯基卟啉（TPP-NH2）的合成 將上一步得到的TPP-NO2（0.61 g，0.92 mmol）加入到100 mL三口燒瓶中，加入30 mL 濃鹽酸后充分攪拌均勻，抽真空通氮氣循環3 次。將氯化亞錫二水合物（4.00 g，17.7 mmol）溶于10 mL 濃鹽酸中，在氮氣保護下緩慢滴加到反應瓶中，80 ℃ 下反應2 h。反應結束后，冷卻至室溫，抽濾棄去濾液，濾餅用飽和氫氧化鈉水溶液洗滌至紫色，之后再用去離子水洗滌，二氯甲烷復溶后通過柱層析法以二氯甲烷/石油醚（其體積比為1∶1）為洗脫劑進一步純化，產物在真空烘箱中干燥，得到紫色固體化合物TPP-NH2（0.52 g，產率89%）。1H-NMR（400 MHz，CDCl3，δ）：8.83（m，8H，β?H），8.20（m，6H，Ar?H），7.98（d，2H，Ar?H），7.75（m，9H，Ar?H） ， 7.04（ d， 2H， Ar?H） ， 4.00（ s， 2H， NH2） ，—2.75（s，2H，NH）。

1.3.4 單炔基苯基卟啉（TPP-alkyne）的合成 將TPPNH2（0.50 g，0.79 mmol）、無水碳酸鉀（1.09 g，7.9 mmol）、3-溴丙炔（0.94 g，7.9 mmol）加入到50 mL 三口燒瓶中，之后加入20 mL 無水DMF，通氮氣30 min 后密封，油浴加熱至70 ℃ 反應24 h。反應結束后，用二氯甲烷溶解并用飽和氯化鈉水溶液洗滌3 次，有機相用無水硫酸鈉干燥，抽濾后濾液旋蒸濃縮，通過柱層析法以二氯甲烷/石油醚（體積比為1∶2）為洗脫劑進一步純化，產物在真空烘箱中干燥，得到紫色固體化合物TPP-alkyne（0.41 g，產 率78%）。1H-NMR（400 MHz，CDCl3，δ）：8.83（m，8H，β?H），8.20（m，6H，Ar?H），8.13（d，2H，Ar?H），7.75（m，9H，Ar?H），7.32（d，2H，Ar?H），4.41（s，2H，CH2），2.42（s，1H，CH），—2.75（s，2H，NH）。

1.3.5 單炔基苯基鋅卟啉（ZnTPP-alkyne）的合成 將TPP-alkyne（0.40 g，0.60 mmol）和二水合醋酸鋅（1.32 g，6.0 mmol）加入到500 mL 圓底燒瓶中，加入200 mL 二氯甲烷/甲醇（其體積比為3∶1）混合溶劑攪拌，室溫下反應2 h。反應結束旋干后用二氯甲烷復溶，抽濾棄去濾渣，濾液旋蒸濃縮后通過柱層析法以二氯甲烷為洗脫劑進一步純化，產物在真空烘箱中干燥，得到紫色固體化合物ZnTPP-alkyne（0.40 g，產率92%）。1H-NMR（400 MHz，CDCl3，δ）：8.94（m，8H，β?H），8.22（m，6H，Ar?H），8.13（d，2H，Ar?H），7.75（m，9H，Ar?H），7.32（d，2H，Ar?H），4.41（s，2H，CH2），2.42（s，1H，CH）。

圖2 親水性卟啉聚乙二醇半遙爪聚合物TPP-PEG 的合成路線Fig. 2 The synthesis procedure of hydrophilic porphyrin semitelechelic polymer TPP-PEG

1.3.6 聚乙二醇單甲醚對甲苯磺酸酯（PEG-OTs）的合成 以PEG2000-OTs 的制備為例，將聚乙二醇單甲醚PEG-OH（分子量Mn=2 000，4.0 g，2.0 mol）溶于30 mLTHF 中，緩慢加入5 mL 的氫氧化鈉（0.24 g，6 mmol）水溶液，攪拌均勻后冰水浴至0 ℃。將對甲基苯甲酰氯（0.92 g，4.8 mmol）溶于10 mLTHF 中，逐滴加入到反應瓶中。滴加完畢后，轉移至室溫下反應過夜，次日旋蒸除去THF，用二氯甲烷復溶，并用適量飽和氯化鈉水溶液洗滌3 次，有機相用無水硫酸鈉干燥旋蒸濃縮，濃縮液在200 mL 冰乙醚中沉淀3 次，抽濾濾餅放在真空烘箱中干燥，得到白色固體化合物PEG-OTs（3.5 g，產率81%）。1H-NMR（400 MHz，CDCl3，δ）：7.80（d，2H，Ar?H），7.34（m，2H，Ar?H），3.65（m，180H，CH2），3.31（s，3H，O?CH3），2.44（s，3H，Ar?CH3）。

1.3.7 末端含疊氮基聚乙二醇單甲醚化合物（PEGN3）的合成 將化合物PEG2000-OTs（2.17 g，1.0 mmol）、疊氮化鈉（0.65 g，10 mmol）加入25 mL 圓底燒瓶中，加入10 mL 無水DMF 攪拌溶解，50 ℃ 油浴反應48 h。反應結束后抽濾棄去濾渣，濾液中加入二氯甲烷溶解，并用適量飽和氯化鈉水溶液洗滌3 次，有機相用無水硫酸鈉干燥旋蒸濃縮，濃縮液在200 mL 冰乙醚中沉淀3 次，抽濾濾餅放在真空烘箱中干燥，得到白色 固 體 化 合 物PEG-N3（1.77 g，產 率87%）。1HNMR（400 MHz，CDCl3，δ）：3.58（m，180H，CH2），3.31（s，3H，O?CH3）。

1.3.8 “點擊化學”偶聯反應合成鋅卟啉半遙爪聚合物（ZnTPP-PEG2000） 將化合物ZnTPP-alkyne（100 mg，0.137 mmol） 、 化 合 物PEG2000-N3（ 419 mg， 0.206 mmol）和抗壞血酸鈉（136 mg，0.685 mmol）加入到50 mL 三口燒瓶中，再加入20 mL THF 攪拌溶解，抽真空、通氮氣反復3 次后繼續通氮氣30 min，將五水合硫酸銅（34 mg，0.137 mmol）溶于1～2 mL 去離子水后用注射器迅速加入到反應瓶中，繼續通氮氣10 min后密封，50 ℃下反應48 h。反應結束后旋蒸除去溶劑，加入50 mL 二氯甲烷溶解，用飽和氯化鈉水溶液洗滌3 次，有機相用無水硫酸鈉干燥后旋蒸濃縮，通過柱層析法以二氯甲烷/甲醇（其體積比為20:1）為洗脫劑進一步純化，產物在真空烘箱中干燥，得到紫色固體化合物ZnTPP-PEG2000（237 mg，產率62%）。1HNMR（ 400 MHz， CDCl3， δ） ： 8.87（ m， 8H， β?H） ，8.19（m，6H，Ar?H），8.04（d，3H，Ar?H），7.74（m，9H，Ar?H），7.30（d，2H，Ar?H），4.87（s，2H，CH2），3.57（m，180H，CH2），3.36（s，3H，O?CH3）。

1.3.9 卟啉半遙爪聚合物（TPP-PEG2000）的合成 將化合物ZnTPP-PEG2000（100 mg，0.036 mmol）加入到25 mL圓底燒瓶中，用10 mL 二氯甲烷溶解后加入1.0 mL濃鹽酸，室溫下攪拌反應2 h。反應結束后，加入適量三乙胺調節pH 使溶液呈堿性，抽濾棄去濾渣后濾液用飽和氯化鈉水溶液洗滌3 次，二氯甲烷萃取，有機相用無水硫酸鈉干燥后旋蒸濃縮，通過柱層析法以二氯甲烷/甲醇（其體積比為20:1）為洗脫劑進一步純化，產物在真空烘箱中干燥，得到紫色固體化合物TPP-PEG2000（ 89 mg， 95%） 。1H-NMR（ 400 MHz，CDCl3，δ）：8.85（m，8H，β?H），8.21（m，6H，Ar?H），8.04（d，3H，Ar?H），7.76（m，9H，Ar?H），7.30（d，2H，Ar?H） ， 4.87（ s， 2H， CH2） ， 3.57（ m， 180H， CH2） ，3.36（s，3H，O?CH3），—2.78（s，2H，NH）。

分子量為1 000 和5 000 的卟啉聚乙二醇半遙爪聚合物（TPP-PEG1000、TPP-PEG5000）的合成方法同上。

1.4 紫外-可見光檢測

取100 μLTPP 質量濃度為1.0 mg/mL 的DMSO溶液，在超聲條件下滴入2.0 mL 去離子水中，用透析袋透析除去有機溶劑，加適量去離子水稀釋成質量濃度為10 μmol/L 的溶液。用同樣的方法得到TPPPEG1000、TPP-PEG2000和TPP-PEG5000的組裝溶液。利用紫外-可見分光光度計檢測各溶液的紫外-可見光光譜。

1.5 1O2 檢測

以1,3-二苯基異苯并呋喃（DPBF）作為1O2捕獲劑，因為卟啉分子在光照下產生的1O2能夠破壞DPBF 的化學結構，使其在紫外可見光區域的吸光度明顯下降，從而檢測1O2的產生。分別配制質量濃度為10 μmol/L 的TPP、TPP-PEG1000、TPP-PEG2000和TPPPEG5000組裝溶液，取2.0 mL 于石英比色皿中，以不加DPBF 的待測試樣為基線進行校正。加入10 μL質量濃度為5 mg/mL DPBF 的DMF 溶液。在波長為655 nm、功率為0.6 W/cm2的激光燈下光照10 s后檢測溶液的紫外-可見光吸收光譜。

1.6 組裝體粒徑的測試

將組裝后的溶液置于光程1 cm 的石英比色皿中，利用動態光散射（DLS）分析儀對TPP、TPPPEG1000、TPP-PEG2000和TPP-PEG5000的組裝溶液進行粒徑的測定。

1.7 細胞毒性實驗

選擇HeLa 細胞來評估TPP-PEG 的細胞暗毒性。首先將HeLa 細胞接種在96 孔板上，密度為每孔5×103個細胞，在37 ℃培養箱中培養24 h 后，在孔板中分別加入相同質量濃度卟啉的TPP、TPPPEG1000、TPP-PEG2000、TPP-PEG5000溶液，培養24 h 后加入含質量分數為10% 3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）（5 mg/mL 磷酸緩沖鹽溶液，PBS 溶液）的DMEM 培養基繼續培養4 h。然后吸出含有MTT 的培養基，每孔加入150 μL DMSO，用分光光度計酶標儀（Thermo Multiskan MK3 光譜儀）檢測492 nm 處的吸光度。細胞存活率（Rc）計算如下式：

其中，ODtest為加入樣品后溶液的吸光度，ODcontrol為沒加樣品的溶液吸光度，ODbackground為空的孔板的吸光度。

細胞光毒性實驗采用上述類似的方法來評估TPP、TPP-PEG1000、TPP-PEG2000、TPP-PEG5000的體外光毒性：將樣品加入孔板中后培養24 h，用波長為655 nm 激光燈（功率為0.6 W/cm2）照射10 min，放于37 ℃培養箱中培養24 h。最后加入MTT 以及DMSO利用分光光度計酶標儀檢測細胞的存活情況。

2 結果與討論

2.1 化合物的合成與分析

化 合 物TPP-NH2，TPP-alkyne，ZnTPP-alkyne 的核磁共振氫譜如圖3 所示。圖3(a)中化學位移在8.83、?2.75 處的信號峰屬于卟啉環上的特征峰，而化學位移在8.20～7.00 處的信號峰屬于苯環上的質子峰，化學位移在4.00 處的信號峰則屬于苯環上氨基（—NH2）的質子峰，這些都表明實驗已成功合成出TPP-NH2。通過TPP-NH2與3-溴丙炔取代反應得到單炔基苯基卟啉TPP-alkyne，其1H-NMR 譜（圖3(b)）中明顯多出了化學位移在4.42 處的亞甲基（—CH2—）和2.41 處的炔基（—CH）的質子峰，說明實驗已合成出TPP-alkyne。卟啉分子中心具有較強的與金屬離子配位能力，在進行點擊化學反應之前，要引入金屬離子進行配位。在此采用醋酸鋅與卟啉配位絡合，得到單炔基苯基鋅卟啉ZnTPP-alkyne，其1H-NMR 譜（圖3(c)）中化學位移在?2.75 處的卟啉核心特征峰消失，表明鋅離子成功絡合。

PEG-OH 與TsCl 反應得到聚乙二醇單甲醚對甲苯磺酸酯（PEG-OTs），以PEG2000為例，其1H-NMR 譜（圖4(a)）中化學位移在7.80 處和7.34 處的信號峰是苯環上的質子峰，3.64、3.37 處的峰分別是聚乙二醇高分子鏈上的亞甲基（—CH2—）和甲基（—CH3）的特征質子峰，化學位移在2.44 處的信號峰是苯環上甲基的質子峰。PEG-OTs 與NaN3發生取代反應，得到末端含疊氮基的聚乙二醇高分子PEG2000-N3，其1HNMR 譜（圖4(b)）中 化 學 位 移 在7.80、7.34 處 和2.44 處的信號峰明顯消失，表明疊氮基已取代對甲苯磺酸基，實驗已成功合成出PEG2000-N3。

ZnTPP-alkyne 和PEG-N3的點擊化學反應以硫酸銅/抗壞血酸鈉為催化劑，由于還原產生的一價亞銅離子（Cu+）很容易被氧化，因此在反應前體系中通氮氣進行保護。通過水洗、柱層析等方法除去催化劑和未反應物，得到產物鋅卟啉半遙爪聚合物ZnTPP-PEG。 以TPP-PEG2000為 例， 其1H-NMR 譜（圖5(a)）中既有卟啉分子的信號峰，也有聚乙二醇的信號峰，表明成功合成出ZnTPP-PEG2000。加入鹽酸除去ZnTPP-PEG 卟啉中心配位的鋅離子，之后加入三乙胺以除去過量的酸并將卟啉分子去質子化，進一步純化后得到TPP-PEG2000。相比于ZnTPPPEG2000，TPP-PEG2000的1H-NMR 譜（圖5(b)）中明顯出現化學位移在?2.78 處的信號峰，表明已除去Zn2+，成功合成了卟啉半遙爪聚合物TPP-PEG2000。

圖3 化合物TPP-NH2 (a)；TPP-alkyne (b)和ZnTPP-alkyne(c)的核磁共振氫譜Fig. 3 1H-NMR spectra of TPP-NH2 (a); TPP-alkyne (b) and ZnTPP-alkyne (c)

圖6 是卟啉小分子TPP 和不同鏈長聚乙二醇的卟啉半遙爪聚合物光敏劑TPP-PEG 在水中的紫外-可見光譜，從圖中可以看出，TPP-PEG 在420 nm 處有一個強烈的吸收峰（S 帶，卟啉的特征吸收峰），在500～700 nm 區域有比較弱但很寬的吸收峰（Q 帶），同時在655 nm 處有一個較弱的吸收峰。TPP 小分子在420 nm 處的吸收峰有明顯的紅移（8～9 nm）并且吸收峰變寬，說明水溶性很差的光敏劑卟啉分子在水中發生嚴重的π-π 堆積。

圖4 聚合物PEG2000-OTs(a) 和PEG2000-N3(b) 的核磁共振氫譜 Fig. 4 1H-NMR spectra of PEG2000-OTs (a) and PEG2000-N3 (b)

2.2 1O2 的測定與比較

大多數光敏劑都是疏水性的，在水溶液中很容易聚集，導致1O2的產率大大下降。在卟啉分子上引入親水性的高分子鏈如聚乙二醇，能夠極大地改善了光敏劑的水溶性，減少其π-π 堆積從而提高1O2的產率。以DPBF 為1O2的捕獲試劑，光敏劑產生的1O2越多，DPBF 降解得就越快，其紫外可見光區域的吸光度下降的越多。圖7 分別示出了在TPP、TPPPEG1000、TPP-PEG2000、TPP-PEG5000水溶液中DPBF 的紫外-可見光吸光度隨光照時間的變化情況。從圖7(a)中可以看出，在卟啉小分子TPP 水溶液中，隨著光照時間的延長，DPBF 的吸光度基本上沒有太大變化，這是由于卟啉分子由于π-π 堆積而處于淬滅狀態，無法產生大量的1O2。當為TPP-PEG 時，DPBF 的吸光度隨著光照時間的增長迅速下降（圖7b～7d），說明TPP-PEG 在光照下產生了大量的1O2。由圖7 中可以看出，TPP-PEG 樣品中的DPBF 吸光度的每10 s間隔的下降幅度比TPP 中的吸光度下降幅度大。

圖5 半遙爪聚合物ZnTPP-PEG2000 (a)和TPP-PEG2000 (b)的核磁共振氫譜Fig. 5 1H-NMR spectra of ZnTPP-PEG2000 (a) and TPP-PEG2000 (b)

圖6 TPP、TPP-PEG1000、TPP-PEG2000 和TPP-PEG5000 在水溶液中的紫外-可見光譜Fig. 6 UV-Vis spectra of TPP、TPP-PEG1000、TPP-PEG2000 and TPP-PEG5000 in aqueous solution

為了更清楚地比較各樣品的1O2產生能力，本文選取423 nm 處DPBF 的吸光度隨光照時間的變化情況作圖并比較。圖8 所示為TPP 和不同PEG 鏈長的TPP-PEG 樣品溶液中DPBF 在423 nm處的紫外-可見光吸光度隨光照時間的變化情況?？梢灾庇^地看到，在TPP-PEG1000溶液中DPBF吸光度下降得最快，其次是TPP-PEG2000溶液，TPP-PEG5000溶液中DPBF吸光度下降得較慢，TPP 溶液下降最慢，說明與TPP 小分子光敏劑相比較，TPP-PEG 在光照下能夠更快地產生1O2，并且其產生速度與所連接親水段聚乙二醇的鏈長成相反關系。

圖7 TPP(a)、 TPP-PEG1000(b)、 TPP-PEG2000(c)和 TPPPEG5000(d)水溶液每10 s 光照后，DPBF 的紫外-可見光吸收光譜Fig. 7 UV-Vis absorption spectra of DPBF in TPP (a); TPPPEG1000 (b); TPP-PEG2000 (c); TPP-PEG5000 and (d)solution after irradiation every 10 s

圖8 TPP、TPP-PEG1000、TPP-PEG2000 和TPP-PEG5000 水溶液中DPBF 在423 nm 處的紫外-可見光吸收光度隨光照時間的變化Fig. 8 Plots of DPBF’s UV-Vis absorbance at 423 nm with irradiation time in TPP、TPP-PEG1000、TPP-PEG2000 and TPP-PEG5000 aqueous solution

2.3 納米組裝體的粒徑

為了探究聚乙二醇鏈長對1O2產率影響的原因，我們進一步測量了TPP、TPP-PEG1000、TPP-PEG2000和TPP-PEG5000組裝體的粒徑。未經聚乙二醇修飾的自由卟啉的疏水性很強，在水溶液中形成肉眼可見的聚集體，溶液呈渾濁狀。而經過PEG 高分子的修飾后，卟啉的親水性大大提高，在水相環境中可自組裝成納米膠束，以疏水性卟啉為內核、親水性聚乙二醇為外殼，宏觀上為澄清溶液（圖9）。圖10是各樣品的流體力學直徑示意圖，從圖中可以看出，卟啉小分子的流體動力學直徑可達1 000 nm，多分散性也比較 寬（ PDI=0.523） ， 而 組 裝 體TPP-PEG1000、 TPPPEG2000和TPP-PEG5000的流體動力學直徑隨著PEG 鏈長的增加而增加，分別為5、10、22 nm，這是因為高分子的鏈長越長，組裝體中親水的PEG 層越厚，納米粒子的粒徑自然越大。1O2是一種高度活性物質，壽命很短（半衰期：0.03～0.18 ms），只能在很有限的范圍內（<0.02 μm）才能發揮作用[2,24]。由于鏈長較短的TPP-PEG 形成的組裝體粒徑較小，產生的1O2可以迅速擴散，與DPBF 反應使其以較快的速率降解；而鏈長較長的TPP-PEG 組裝形成的納米膠束粒徑較大，產生的1O2擴散相對較慢，使得DPBF 降解也較慢，從而表現出1O2的產率與PEG 鏈長成負相關的現象。

2.4 細胞毒性實驗

通過MTT 測定法研究不同質量濃度的TPP、TPP-PEG1000、TPP-PEG2000和TPP-PEG5000組 裝 溶 液的HeLa 細胞活性如圖11 所示。當細胞沒有用655 nm激光照射時，隨著卟啉質量濃度的升高，細胞的存活率逐漸下降。當卟啉質量濃度最高為15.000 μg/mL時，加入TPP 溶液的細胞存活率約為80%，而加入自組裝體的溶液的細胞存活率約為90%，說明在沒有接枝PEG 高分子鏈的情況下，TPP 的生物相容性較差，細胞暗毒性較高，而在卟啉分子上修飾了不同鏈長的PEG 后，TPP 的生物相容性有比較明顯的改善，并且它們之間的細胞暗毒性沒有顯著差異。

圖9 TPP、TPP-PEG1000、TPP-PEG2000、TPP-PEG5000 水溶性的對比圖Fig. 9 Photographs showing the different water-solubility of TPP、TPP-PEG1000、TPP-PEG2000 and TPP-PEG5000

圖10 TPP 、TPP-PEG1000、TPP-PEG2000 和TPP-PEG5000各組裝體的流體力學曲線Fig. 10 Hydrodynamic curves of TPP, TPP-PEG1000, TPPPEG2000 and TPP-PEG5000 assemblies

當用655 nm 激光照射時，TPP 和TPP-PEG 都能夠產生1O2殺死HeLa 細胞，其細胞存活率隨著卟啉質量濃度的升高有著明顯的下降。當卟啉質量濃度最高為15.000 μg/mL 時，加入TPP 溶液的細胞存活率為65%，而加入自組裝體的溶液的細胞存活率分別為20%、30%、35%，說明沒有接枝PEG 鏈的TPP 光動力效果較差。而接枝PEG 高分子鏈之后，由于親水的PEG 提高了卟啉聚合物的親水性，減少了卟啉之間的π-π 堆積，1O2產率較高，光動力效果得到很大的改善。從圖中可以直觀地看到，在相同的卟啉質量濃度下，細胞存活率與所接枝的PEG 鏈長成相反關系，這也與前面以DPBF 為探針檢測1O2的結果相符。

圖11 MTT 法檢測不同質量濃度的TPP、TPP-PEG1000、TPP-PEG2000 和TPP-PEG5000 溶液的HeLa 細胞毒性無光照（a）；655 nm 光照10 min（b）Fig. 11 The cytotoxicity of HeLa cells measured by MTT assay with various concentrations of TPP, TPP-PEG1000、TPPPEG2000 and TPP-PEG5000 solution without laser irradiation (a) , with 655 nm laser irradiation for 10 min(b)

3 結 論

（1）本文成功設計合成了一類親水性的卟啉半遙爪聚合物TPP-PEG。由于PEG 分子極好的親水性，TPP-PEG 在水溶液中能夠穩定存在，有效地減少了卟啉分子之間的π-π 堆積，提高了光敏劑的單線態氧產率，同時改善了生物相容性。

（2）聚乙二醇的鏈長對TPP-PEG 的光動力療效有較大的影響。實驗結果表明，卟啉半遙爪聚合物中的親水性聚乙二醇鏈越短，組裝體的粒徑就越小，其1O2產率越高，MTT 細胞實驗的光毒性也驗證了這一結果。因此，這種卟啉半遙爪聚合物可以用做潛在的大分子光敏劑用于光動力療法，并且聚合物的性質，鏈長等對其光動力治療效果有較大的影響。