人體肝臟靶向性新型AAV 血清型載體的研發

寧秦潔， 陳 穎， 閆夢迪， 胡澤嵐， 吳 俠， 杜增民， 鄭 靜， 肖 嘯

（華東理工大學藥學院，神經分子藥理學實驗室，上海 200237）

基因治療（Gene Therapy）是通過基因水平改變來治療疾病的方法，即通過基因載體（通常為改造過的病毒）導入一段有獨立功能的基因進入體細胞，代替或糾正已經發生突變的基因進行獨立表達，發揮其原本應該有的功能。經過近三十年的發展，基因治療己經由最初用于單基因遺傳病的治療擴大到惡性腫瘤、感染性疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病、代謝性疾病等多種重大疾病的治療。

腺相關病毒（Adeno-associated Virus, AAV）是目前基因治療領域中最常用的病毒載體之一，是細小病毒家族的成員，具有約4.7 kb 的單鏈DNA 基因組[1-2]。AAV 基因治療的安全性、有效性和持續性表達已經在絕大多數基因治療的臨床試驗中得到了證實[3-11]。然而30%～40%的人群存在AAV中和抗體（Neutralizing Antibody, Nab），這些預先存在的AAV中和抗體，即使在適度的滴度下，也能夠在給予AAV 后阻止其成功轉導。因此會導致功能基因表達量的降低，甚至產生免疫毒性，這類患者都不適用目前的治療方案[10]。所有臨床研究中的一致觀察結果是針對AAV 轉導的肝細胞的免疫應答的風險取決于載體劑量[12-14]。這一觀察結果突出了一個基本的治療原則，即需要使用最低劑量，從而產生臨床效益，同時盡量減少不良事件的風險。

由于天然wt AAV（Wild type AAV）感染，在大部分人群中發現Nab，而新型AAV 血清型載體在人體內的中和抗體量較少，因此研發新型的AAV 血清型載體在一定程度上可以克服中和抗體對基因治療的影響。設計用于靶向遞送基因的AAV 衣殼的篩選（其通常依賴于序列分析和合理的肽插入）已經取得了一些成功，但是由于AAV 載體介導的免疫反應的發生以及載體包裝的報告基因的活性較低等因素的影響，這些新型AAV 載體可能不是最理想的基因治療載體[15-17]。

目前針對AAV 衣殼的設計優化的主要方法為合理設計、計算機生物信息學、自然發現和定向進化方法。合理設計即利用衣殼生物學和宿主細胞靶標的預先存在的知識來設計組織特異性或細胞特異性細胞外標記物或免疫逃避的衣殼。雖然可以改善衣殼向性，但它也可能對衣殼的其他特征產生負面影響，例如其穩定性；計算機設計是一種新的衣殼發現方法，利用計算方法來預測自然界中未見的新衣殼設計，能夠從現代衣殼重建祖先AAVs 是計算機設計的一種形式；自然發現即從自然界中發現新型AAV衣殼，但由于40%～80%的AAV 都有其相應的抗體，因此人源衣殼可能不是理想的基因治療載體；包含DNA shuffling、error prone-PCR 在內的定向進化技術能夠產生具有特定生物學特性和有利特征的AAV遺傳變體（例如，組織特異性靶向、免疫逃避和轉基因表達），再加上DNA shuffling 技術是對cap 基因改造能力最為有效的一種技術，它的主要優點是能夠將所有的AAV 血清型載體組合在一起產生許多獨特的衣殼組合，其可以具有不同且有利的載體特性，這避免單純研究一種血清型而發生偏差，且不會在搜索序列空間方面受到限制[18]。

本研究通過DNA shuffling 技術對8 種AAV（AAV1～AAV4，AAV6～AAV9）cap 基因序列進行DNA改組，利用wt Ad5 對Hep G2 細胞進行超感染，在Hep G2 細胞內復制AAV 顆粒，通過Hep G2 細胞篩選新型AAV 血清型載體，將不同AAV 血清型載體分別包裝目的基因GFP，觀察不同AAV血清型載體介導的綠色熒光的表達，同時對所篩選的新型血清型載體同其他血清型一起分別在小鼠中進行中和抗體的檢測。本文首次通過人肝癌Hep G2 細胞篩選新型AAV 血清型載體改變衣殼向性的同時增強基因的傳遞，逃避AAV 中和抗體。

1 實驗部分

1.1 原料和試劑

AAV1～AAV4，AAV6～AAV9 共8 種血清型腺相關病毒、含有ITR 序列和氨芐抗性的pAAV-mcs、大腸桿菌TOP10、pAAV-GFP、pAd-Helper、wt Ad5 均為本實驗室所有；HEK293 細胞、Hep G2 細胞均購自ATCC 公司，Taq 聚 合酶、T4 連 接酶、DNase I 酶、Benzonase 酶均購自Takara 公司；膠回收試劑盒、Plasmid Max Kit（25）均 購 自Omega 公 司；Dneasy Blood&Tissue Kit（250）購自QIAGEN 公司；聚乙二醇（PEG 8000）、碘克沙醇、蛋白酶K 均購自Sigma-Aldrich 公司；Zeta-Probe GT 印跡膜購自Bio Rad 公司；各種限制性核酸酶、Silver SNAP 染色試劑盒II 購自Thermo Fisher Scientific 公司；胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）、磷酸緩沖鹽溶液（Phsphatte Buffered Saline，PBS）、DMEM 培 養 基（Dulbecco's Modified Eagle Medium）、雙抗（Penicillin-Streptomycin，Liquid）及胰蛋白酶（0.25 g/mL）均購自BI 公司。

1.2 實驗儀器

高速離心機（CR21N 型），購于日本日立公司；蛋白純化儀（NGC QUEST10 型）、蛋白純化收集器（Bio Frad 型），均購于美國Bio Rad（伯樂）公司；脫色搖床（翹板）（SK-R1807-E 型），購于大龍興創實驗儀器（北京）有限公司；超凈工作臺（SW-CJ-2FD 型），購于蘇凈安泰空氣技術有限公司；全溫落地搖床（ZWY-211C型），購于上海智城分析儀器制造有限公司；生化培養箱（SHP-250 型），購于上海精宏實驗設備有限公司；PCR 儀（Veriti DX 型），購于美國應用生物系統（ABI）公司；紫外透照臺（TL-TM FL-26 型），購于上海默威生物科技有限公司；臺式離心機（FRESCO21型），購于美國Thermo Fisher Scientific 公司；高壓滅菌鍋（80E 型），購于山東新華醫療器械股份有限公司；實時熒光定量PCR 儀（qTOWER3G touch 型），購于德國耶拿分析儀器公司。

1.3 實驗原理和方法

1.3.1 DNA shuffling DNA shuffling 是一種通過隨機片段化和聚合酶鏈反應（Polymerase Chain Reaction,PCR）重組對所選突變體基因庫進行體外同源重組的方法。用DNase I 處理來自基因或指向同源基因的序列變體以產生隨機DNA 片段。用同源DNA作為模板和引物進行PCR 擴增，將這些片段重新組裝成與原始大小相同的基因，但具有可變功能[19]。

1.3.2 細胞培養、轉染、病毒生產和純化 將HEK293細胞維持在含有體積分數10%FBS 的DMEM 培養基中。使用聚乙烯亞胺（Polyethyleneimine, PEI）通過三質粒轉染HEK293 細胞產生重組AAV[20-21]。在轉染后72 h 從培養基中收獲病毒顆粒。將細胞沉淀重懸于 含 有2 mmol/mL MgCl2、10 mmol/mL Tris（pH=8）中，凍融3 次，并用100 U/mL Benzonase 酶在37 ℃處理至少1 h。通過用含有500 mmol/mL 氯化鈉、體積分數為8% PEG 8000 試劑濃縮病毒培養基，并將離心后的沉淀重懸于Tris-MgCl2中，將其與裂解液合并[22]。然后將合并的裂解液的鹽離子濃度調節至500 mmol/mL ，在37 ℃下孵育30 min，并在2 000 g下離心得到澄清的裂解液。然后將澄清的裂解液分別用碘克沙醇密度梯度（15%，25%，40%和60%）離心，將病毒濃縮并儲存在磷酸鹽緩沖鹽水（0.001 g/L Pluronic F-68 + 0.2 mol/L NaCl）中[23]。

1.3.3 斑點印跡（Dot Blot） 首先將2 μL 樣品與300 U的DNase I 在25 mL 限制酶緩沖液中于37 ℃溫育1 h，然 后 補 充1 mL、0.5 mol/L 乙 二 胺 四 乙 酸，調 節pH 為8.0，在100 ℃溫育10 min。隨后，加入1 mL蛋白酶K 混合物（4 mL、體積分數為10%十二烷基硫酸鈉，4 mL或5 U 蛋白酶K，6 mL H2O）并將樣品在50 ℃溫育1 h。然后將蛋白酶K 反應物用H2O 稀釋至100 mL，并用H2O 將5 mL 稀釋的樣品進一步稀釋至300 mL，然后按照試劑盒說明的方法用30 ku截留分子量的Ultra-0.5 mL 離心裝置處理。將回收的樣品和線性化的標準品的系列稀釋液在0.4 mol/L NaOH 中進行1∶20 稀釋，然后轉移至Zeta-Probe GT印跡膜。交聯后，用來自Hybrisol I 中的載體質粒的EcoRI-PstI 片段探測膜，并根據標準方法洗滌。在暴露于存儲熒光屏之后，使用圖像分析軟件對圖像進行定量。在本研究中，斑點雜交技術用于AAV 基因治療載體滴度測定，因為斑點印跡技術是測定 AAV基因組滴定的強有力的方法[24]。

1.3.4 銀染（Silver staining） 采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法： 在5%～12%凝膠上分離指示體積的樣品，用Silver SNAP 染色試劑盒II 進行銀染色，以檢測病毒包裝過程中空殼與實心的比例。1.3.5 AAV 中和抗體檢測技術 中和抗體檢測參考基于細胞體外轉導抑制的測定方法[25-27]。Nabs 效價被定義為血清的最高稀釋度。將表達熒光素酶的AAV 載體直接注射到6～8周齡的C57BL/6 小鼠的肝臟中。兩周后鏡下觀察轉基因的表達[25]，利用酶聯免疫 吸 附 測 定 技 術（Enzyme Linked Immune Sorbent Assay, ELISA）測定抗AAV 抗體的總量[28]。將對照和測試樣品按照1：20 稀釋，然后一式兩份添加至每毫升中含有1.08×1012個 capsid AAV 的平板上[29]。

2 結果與討論

2.1 新型AAV 血清型載體的研發

2.1.1 突變體基因庫的產生 通過DNA shuffling 技術構建了AAV 血清型載體的突變體基因庫如圖1 所示。本研究選擇8 種（AAV1～AAV4，AAV6～AAV9）用于cap 基因的DNA 改組，因為已顯示AAV5 血清型載體與其他AAV 血清型載體相比具有最大的序列變異，并可能降低體外重組的效率。從質粒文庫中挑選隨機克隆用于檢查重組AAV cap 基因的序列變異和生存力。每個病毒顆粒的 cap 基因型和表型都是一對一的對應關系，有利于連續篩選AAV 突變體基因庫。

圖1 通過DNA shuffling 技術構建AAV 突變體基因庫Fig. 1 Construction of AAV mutant gene library by DNA shuffling

為構建隨機嵌合AAV 突變體基因庫，使用AAV血清型載體1、2、3、4、6、7、8 和9 作為PCR 模板。通過引物1（5'-CCC-AAGCTTCGATCAACTACGC AGACAGGTACCAA-3'）和引物2（5'-ATAAGAATGCGGCCGC-AGAGACCAAAGTTCAACTGAAACGA-3'）擴增衣殼基因。擴增后，使用DNase I 處理獲得cap 基因混合物，處理后樣品將得到許多DNA 小片段，并以相等比例混合用于DNA 改組[30]。將4 μg DNA 模板用0.04 U 的DNase I 酶在15 ℃下短暫處理。通過瓊脂糖凝膠電泳純化大小為300～1 000 bp的DNA 片段，變性，再退火并通過DNA 聚合酶修復以重新組裝隨機衣殼基因。通過使用DNA 聚合酶和引物1或引物2 進行擴增。PCR 程序是95 ℃，10 min；30 個循環的95 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，1 min；72 ℃，3 min。然后用Hind III 和Not I 消化PCR 產物，并連接到含有AAV2 Rep 基因和反向末端重復序列的并且經過Hind III 和Not I 消化的質粒骨架中。通過將上述連接的DNA 轉化到DH10B 大腸桿菌細胞中獲得隨機感染質粒文庫（pIRC）。挑選隨機克隆用于限制酶分析和293 細胞中的復制和包裝。最后將構建的新型病毒包裝質粒同pAd-Helper 質粒共同轉染HEK293細胞生產改組的感染性AAV 文庫。

2.1.2 從突變體基因庫篩選靶向肝臟的突變體 圖2 示出了篩選獲得的AAVXL12 capsid 突變體。如圖2（a），我們用腺病毒wt Ad5 對Hep G2 細胞進行超感染，允許擴增內化的AAV 文庫克隆。回收擴增的AAV 并進行兩輪選擇以富集AAV 文庫，同時與Hep G2 細胞結合、內化，在Hep G2 細胞內復制AAV 顆粒。從病毒中提取基因組DNA，并以此為模板，將最終回收到的 AAV capsid 的 DNA 區域通過 PCR 進行擴增。擴增得到的cap 基因再次插入到攜帶有AAV2 rep 基因和ITR 序列的質粒中，獲得的質粒進行測序鑒定。如圖2（b），將用于wt Ad5 輔助細胞（pAd-Helper），AAV Rep 和cap（pAAV-rep/cap，即新型血清型載體）和表達基因的AAV 載體（pAAV-GFP）三質粒共同轉染HEK293 細胞。在轉染后的第3 d，收獲重組AAV 并進行純化以獲得純化的病毒。通過幾輪篩選后，最終富集獲得一種衣殼蛋白cap 突變體AAVXL12。將攜帶GFP 基因的不同AAV 血清型載體同所篩選到的新型血清型載體AAVXL12 分別以同一滴度感染Hep G2 細胞，在感染之后的48 h，通過熒光成像檢測不同血清型載體介導GFP 基因表達。圖2（c）示出了7 種不同AAV 血清型載體的熒光強度。從圖2（c）能夠明顯看出AAVXL12的熒光強度最強，其次是AAV8、AAV9，而AAV1、AAV2、AAV6和AAV7 的熒光強度顯示最弱，基本無熒光。

2.2 AAVXL12 cap 序列的組成

AAVXL12 衣殼的序列組成如圖3 所示，用Align X 將AAVXL12 的測序結果與AAV1～AAV4、AAV6～AAV9 cap 序列進行對比，發現AAVXL12 cap 基因序列由AAV1、AAV2、AAV6、AAV7、AAV8 5 種AAV 的cap 基因序列組成，全長2 103 bp。

圖2 篩選獲得新型AAV 血清型載體AAVXL12 capsid 突變體Fig. 2 Screening for a new AAV serotype vector AAVXL12

圖3 AAVXL12 cap 的序列組成Fig. 3 Composition of the AAVXL12 cap sequence

2.3 AAV 中和抗體檢測

將篩選出來的AAVXL12 與AAV8 用同一病毒量分別感染健康小鼠的肝臟來進行中和抗體的檢測，結果如圖4 所示。從圖4 中看出，所篩選到的新型AAVXL12 血清型載體的Nab 陽性率在30%左右。而AAV8 陽性率在90%左右。因此，AAVXL12更加適用于基因治療的研究。

圖4 不同AAV 血清型在小鼠中的中和抗體滴度檢測Fig. 4 Detection of neutralizing antibody titers in different AAV serotypes in mice

3 討 論

迄今為止，已從各種物種中分離出超過100 種AAV 基因型，包括山羊、牛、非人靈長類動物和人類[31-32]。目前適用于基因治療的AAV 血清型載體對不同的組織器官具有不同的感染能力[32]。雖然有個別AAV 血清型載體對小鼠肝臟組織感染能力較強（如AAV8），但普遍特異性較差，同時也會對其他組織器官存在較強的感染能力。在應用于基因治療研究中時，往往會造成副作用。為了設計具有組合特性的載體，本文通過DNA 改組得到 AAV 衣殼基因文庫并進行篩選。本文研究的主要優點是避免血清型偏差的限制。研究結果表明：通過人肝癌Hep G2 細胞篩選到了肝臟高親和力的新型突變體AAVXL12，增強了對肝細胞的趨向性的同時減少了中和抗體的產生。新型血清型AAVXL12最大的優勢是對肝臟的高親和力，從而大大增強肝細胞基因轉導效率，將其用于基因治療時，只需要很少的用量就能達到理想的治療效果。因此將基因載體的用量及可能的細胞免疫應答最小化。這一創新載體大大增加了基因治療用藥人群，降低了毒副作用。但是新型血清型AAVXL12 對其他組織器官的感染力還需要進一步研究，之后我們將通過攜帶熒光蛋白的AAVXL12 載體靜脈注射到小鼠中，并通過測定肝臟和幾個對照器官中的熒光素酶活性的方法來檢測AAVXL12 對其他組織器官的感染效果。