明目解毒方熏蒸對單純皰疹病毒性角膜炎HSV-1 及角膜CD4、CD14 的影響

鄭嘉琦，王蕾蕾，俞瑩

世界范圍內，單純皰疹病毒 （herpes simplex virus，HSV）的感染率約為40%，感染途徑為皮膚、眼睛和口腔粘膜，目前尚無臨床證實有效的疫苗，在治療上多選取抗病毒藥物[1]。HSV 感染顏面部后，常聚居在三叉神經內，一旦自身免疫力下降，潛伏的病毒就容易被激活，病毒攻擊角膜會造成角膜瘢痕，影響視力。因其具有難根治、易復發的特性，所以目前研究的重點在于抑制病毒的復制和提高機體免疫力。本研究運用明目解毒方熏蒸治療感染單純皰疹病毒性角膜炎（herpes simplex keratitis，HSK）的新西蘭大耳白兔，通過觀察治療后HSV-1 及免疫細胞CD4、CD14 的表達情況，評估其在臨床的應用價值，為臨床治療感染HSK 的患者提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康清潔級20 周齡新西蘭大耳白兔60 只（來源于上海市松江區車墩實驗動物良種場），雌雄不限，體重2.0～2.5 kg。實驗前裂隙燈檢查雙眼前節正常。動物及實驗適用條約符合國家科學技術委員會發布的《實驗動物管理條例》。動物許可證號：SCXK（滬）2012-0008。

1.2 藥物

中藥原液制備：按《中華人民共和國藥典》[2]的標準，明目解毒方（秦皮18 g、紫草15 g、野菊花15 g、大青葉15 g、薄荷后下6 g、防風12 g），煎煮成200 ml一袋的中藥液 （由上海中醫藥大學附屬曙光醫院中藥制劑室統一制作）。生藥濃度為0.4 g/ml。

1.3 試劑與儀器

ABI7500 實時定量PCR 儀（賽默飛，型號：Applied Biosystems 7500 Real-time PCR System）。單純皰疹病毒Ⅰ型 （HSV-1） 核酸擴增（polymerase chain reaction，PCR）熒光檢測試劑盒（中山大學達安基因股份有限公司），試劑盒用一對HSV-1 特異性引物和一條HSV-1 特異性熒光探針，用PCR 體外擴增法檢測HSV-1 DNA。免疫組化相關抗體：CD4、CD14 抗體（購自Biorbyt Ltd）。HSV-1 抗體 （購自Gene Tex 公司）。角膜固定液：4%多聚甲醛固定液（購自生工生物公司）。二甲苯溶液（購自生工生物公司）。無水乙醇（購自生工生物公司）。

磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）：稱 取NaCl 8.0 g、Na2HPO41.16 g、KH2PO40.2 g、KCl 0.2 g，加入超純水定容至1 L，并調pH 至7.3。磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）：1 L PBS 液加入聚山梨酯（吐 溫）1 ml 配 制 成PBST 液。DMEM 液 配 制：①DMEM 粉劑溶于1 L 滅菌注射用水中，NaHCO3調PH 值到7.2～7.4 左右（約3.2g）；②高壓滅菌0.22 μm濾膜的濾器過濾除菌；③37℃培養箱中行細菌培養，3 d 后觀察有無細菌生長；④使用時添加100 U/ml青鏈雙抗溶液，配制成1%濃度，加入FBS 溶液，定容至1 L。

1.4 方法

1.4.1 動物模型制備 固定實驗兔頭部，表面麻醉后，用刀片對兔角膜行以瞳孔緣為內徑的放射狀向外切開，共8 處，深度以劃開角膜上皮為標準。采用含病毒濃度為4×107PFU/ml 的DMEM 7 μl 滴于放射狀劃開角膜上皮的角膜表面，使角膜暴露10 s 后放開開瞼器，閉合眼瞼輕輕按摩5 s。病毒接種后每日用林可霉素眼藥水滴眼2 次預防細菌感染。病毒接種48 h 后出現角膜上皮點狀或樹枝狀缺損，標志造模成功（圖1）。

1.4.2 分組 新西蘭大耳白兔60 只，隨機分成4 組，空白組6 只，模型組、對照組、聯合組各18 只。除空白組外，皆給予眼表HSV-1 病毒接種造模，默認右眼為實驗眼。

1.4.3 給藥方法 模型組：不予藥物治療；對照組：阿昔洛韋滴眼液 （正大福瑞達 國藥準字H37021119）滴眼，每日3 次，每次1 滴；聯合組：阿昔洛韋滴眼液滴眼（用法同前），同時給予明目解毒方熏蒸治療；空白組無操作。

明目解毒方熏蒸：將實驗兔放置于實驗盒中，固定頭部，0.5%愛爾卡因滴眼液點眼后，用開瞼器撐開眼瞼，取中藥液100 ml（曙光醫院制劑室制作）兌蒸餾水200 ml，置于中藥熏蒸器中，加入冰片1 g，利用蒸汽行眼部熏蒸，通過距離調整控制蒸汽溫度為34.0±0.5℃。每日1 次，每次15 min。

1.5 觀察指標

免疫組化SP 法檢測角膜組織CD4、CD14、HSV-1 的表達：石蠟切片，將角膜標本置于4%多聚甲醛固定液中，固定24 h 后，取材、脫水、石蠟包埋，切片厚4 μm。脫蠟，脫二甲苯至水（無水乙醇2 缸，分別浸泡2 min；90%乙醇和80%乙醇分別浸泡2 min；自來水沖洗5～7 min；純水浸泡5 min×1 次，PBST 液清洗5 min×2 次），3%H2O2加蓋避光浸泡20 min 滅活內源性過氧化物酶活性?？乖迯停篜BST 液清洗10 min×3 次；0.1 M 檸檬酸鈉緩沖液浸泡切片，在微波爐中加熱，保持溶液溫度在98～100℃，持續30 min，將切片從微波爐取出，等待溶液自然冷卻至室溫。PBST 液清洗10 min×3 次；0.1%曲拉通100浸泡10 min 增加膜通透性。封閉：PBST 液清洗10 min×3 次；將切片擦干；滴加10%山羊血清（100 μl原液+900 ul PBS），室溫孵育60 min。滴加一抗：（NR2A 原液2μl+10%山羊血清400μl+5%BSA100μl），放置于4℃冰箱過夜；滴加二抗：濃度為1：250 二抗原 液4 μl+10%山 羊 血 清800 μl+5%BSA 200 μl），37℃恒溫培養箱孵育30 min；擦干切片。顯色、復染、封片：滴加DAB 顯色劑，蘇木素復染；乙醇脫水、二甲苯透明；中性樹膠封片。

Real-time PCR 檢測角膜HSV-1 的含量： 采用HSV-1 PCR 熒光檢測試劑盒。每個樣本加入200 μl滅菌生理鹽水勻漿，12000 rpm 離心5 s，去上清，沉淀加入滅菌生理鹽水1 ml，振蕩混勻，12000 rpm 離心5 min，取上清，沉淀中加入50 μl DNA 提取液充分混勻，100℃恒溫處理10 min，12000 rpm 離心5 min。PCR 擴增，置入實時定量PCR 儀樣品槽內，根據分析后圖像調節Baseline 的start 值、stop 值以及Threshold 的value 值，使Std curve 窗口下的標準曲線圖達到最佳。Analyze 自動分析結果。

1.6 臨床表現特征及評價標準

參照Ando 計分法[3]及Trousdale 記分法[4]，角膜上皮及基質損害的嚴重程度用0～4 分評分。

（1）上皮病變計分依據上皮表面病變的面積大?。? 分 無上皮病變；1 分 上皮病變面積＜25%；2 分25%≤上皮病變面積＜50%；3 分50%≤上皮病變面積＜75%；4 分75%≤上皮病變面積＜100%。

（2）角膜基質混濁的評分標準：0 分 角膜基質清晰透明；1 分 角膜基質稍混濁；2 分角膜基質中度混濁，可透見后部虹膜特征；3 分角膜基質重度混濁，但仍可判斷瞳孔緣的位置；4 分角膜基質完全混濁，失去了后部特征。

（3）角膜新生血管的評分標準：0 分 無新生血管長人角膜；1 分新生血管向心性生長，但未達到瞳孔中央或未超過角膜半徑；2 分新生血管達到瞳孔中央或超過角膜半徑。

1.7 統計學方法

采用SPSS18.0 統計軟件處理。計量資料符合正態分布用（）表示，采用方差分析；不符合正態分布用中位數（四分位間距）表示，采用秩和檢驗。

2 結果

2.1 明目解毒方熏蒸治療HSK 的臨床體征評分

造模后3 組間臨床體征評分比較，差異無統計學意義（F=0.258，P=0.738）。治療1 d、3 d、7 d 后，3組間臨床體征評分分別進行比較，差異無統計學意義（F1d=1.667，P=0.213；F3d=0.389，P=0.802；F7d=1.275，P=0.604）（表1）。但統計各組總評分，模型組的評分逐漸上升，對照組及聯合組評分在治療7 d 后下降。

表1 治療前后臨床體征評分（，n=18）

表1 治療前后臨床體征評分（，n=18）

2.2 Real-time PCR 檢測角膜HSV-1 含量

治療1 d 后，3 組角膜HSV-1 的含量比較采用秩和檢驗，差異無統計學意義（Z=0.816，P=0.518）。治療3 d 后，模型組6 個樣本皆可檢測出HSV-1；對照組4 個樣本低于檢測下限未檢出，2 個樣本檢出；聯合組均未檢出。3 組檢出率比較，采用卡方檢驗，差異有統計學意義（χ2=12.600，P=0.002）。治療7 d后，模型組6 個樣本皆檢出HSV-1，對照組、聯合組病毒含量均低于檢測下限，未檢出。3 組檢出率比較，差異有統計學意義（χ2=18.000，P=0.000）（表2）。

2.3 免疫組化SP 法檢測角膜HSV-1 表達

患眼HSV-1 表達主要位于角膜上皮，基質內也可見表達。治療3 d 后，模型組及對照組在角膜上皮及基質內均可見HSV-1 表達，聯合組角膜上皮及基質內呈現弱表達（圖2）。治療7 d 后，模型組角膜上皮表達較強，對照組角膜上皮及基質內皆可見表達，聯合組僅在角膜上皮可見少量表達（圖3）。

表2 治療后各時間點角膜HSV-1 含量[中位數（四分位間距），n=6]

2.4 免疫組化SP 法檢測角膜CD4 表達

CD4 表達于角膜基質，少量于角膜上皮。治療3 d后，空白組、模型組、對照組、聯合組的CD4 檢出率分別為16.67%，83.33%，66.67%，66.67%，模型組CD4 表達較空白組、對照組及聯合組表達均增強；對照組和聯合組表達相當。治療7 d 后，CD4 檢出率分別為33.34%，100.00%，83.30%，83.30%，模型組CD4 表達較空白組增強明顯，較聯合組及對照組增強；聯合組較對照組略增強（圖4、5）。

2.5 免疫組化SP 法檢測角膜CD14 表達

CD14 表達于角膜上皮及基質內。治療3 d 后，空白組、模型組、對照組、聯合組CD14 的檢出率分別為0、66.67%、66.67%、100.00%；治療7 d 后，4 組的檢出率分別為33.34%，83.34%，33.34%，50.00%。治療3 d 后，模型組CD14 表達較空白組明顯增強，聯合組較對照組、模型組明顯增強；治療7 d 后，模型組CD14 表達較空白組明顯增強，聯合組較對照組表達增強（圖6、7）。

圖2 治療3 d 后各組膜HSV-1 表達免疫組化染色圖片。2A 模型組，角膜上皮及基質內可見HSV-1 表達（黑色箭頭）；2B 對照組，角膜上皮及基質內HSV-1 表達（黑色箭頭）；2C 聯合組，角膜上皮HSV-1 表達較弱，基質內可見表達（黑色箭頭）

圖3 治療7 d 后各組角膜HSV-1 表達免疫組化染色圖片。3A 模型組，上皮內HSV-1 表達明顯（黑色箭頭）；3B 對照組，上皮及基質內可見HSV-1 表達（黑色箭頭）；3C 聯合組，上皮內可見HSV-1 表達（黑色箭頭）

圖4 治療3 d 后各組角膜CD4 表達免疫組化染色圖片。4A 空白組，基質內可見CD4 表達（黑色箭頭）；4B 模型組，上皮及基質內可見CD4 表達（黑色箭頭）；4C 對照組，基質內可見CD4 表達（黑色箭頭）；4D 聯合組，基質內可見CD4 表達（黑色箭頭）

圖5 治療7 d 后各組角膜CD4 表達免疫組化染色圖片。5A 空白組，基質內可見CD4 表達（黑色箭頭）；5B 模型組，基質內可見CD4 強表達（黑色箭頭）；5C 對照組，基質內可見CD4 表達（黑色箭頭）；5D 聯合組，CD4 表達較對照組略明顯（黑色箭頭）

圖6 治療3 d 后各組角膜CD14 表達免疫組化染色圖片。6A 空白組；6B 模型組，基質內可見CD14 表達（黑色箭頭）；6C 對照組，基質內可見CD14 表達（黑色箭頭）；6D 聯合組，基質內CD14 表達明顯（黑色箭頭）

圖7 治療7 d 后各組角膜CD14 表達免疫組化染色圖片。7A 空白組，角膜上皮可見CD14 表達（黑色箭頭）；7B 模型組，基質內可見CD14 表達（黑色箭頭）；7C 對照組，基質內可見CD14 表達（黑色箭頭）；7D 聯合組，基質內可見CD14 表達（黑色箭頭）

3 討論

HSK 是一種感染HSV，尤其是HSV-1 引起的致盲性角膜疾病[5]。對HSK 的治療與研究，一直為眼科醫生所關注。早在《證治準繩·雜病·七竅門》[6]中，根據其病證特點，將其形象地命名為“聚星障證”。治療方面，在醫學尚不發達的古代，中醫外治法與中藥口服相輔相成，多采用熏洗、點眼等方式。隨著現代醫學的進步，中藥制劑普遍由于劑型的問題被西藥所取代，中藥洗劑也由于顆粒較粗、制劑進入眼內、酸堿性造成眼表損傷等問題被淘汰。而中藥熏蒸療法是利用中藥液隨熱蒸汽溢出的中藥粒子而發揮作用，對眼表更為安全，兼有的熱作用又能促進血液循環，增加眼表的舒適度，因而仍被沿用。中藥液多采用清熱解毒或祛風清熱之藥物，用于包括病毒性角膜炎在內的眼表感染性疾病。此次研究中，可能由于樣本量的原因，統計學上雖然并未顯示差異，但仍可觀察到聯合組評分低于單純滴眼液治療，佐證了明目解毒方熏蒸的臨床療效。

從Realtime-PCR 檢測及免疫組化HSV-1 在角膜的表達兩方面證實，明目解毒方熏蒸能有效地清除角膜組織HSV-1。明目解毒方有疏風清熱，解毒明目之效。中醫學中認為聚星障多由風熱之邪外侵，上犯于目所致，且黑睛病變屬肝，故組方多選歸肝經，并具有清熱、疏風、涼血作用的藥物，以發揮其循經直達病所的優勢。秦皮、野菊花、大青葉都具有很好的抑制HSV-1 病毒的作用[7-8]。同時，中藥熏蒸的熱物理效應也對病毒產生一定的影響。由于大多數病毒對于熱敏感，因而熱療也被廣泛用于治療病毒感染性疾病。在治療帶狀皰疹病毒感染時，現代醫學多采用微波熱療，微波照射在病患局部使該處溫度維持在39～42℃，同時配合使用一些抗病毒藥物，有很好的治療效果。有學者報道[9]局部的溫熱治療對于帶狀皰疹患者有明顯的療效。因此，中藥熏蒸對于HSK 的病毒抑制作用顯著。阿昔洛韋主要是與胸苷激酶相互作用，阻止HSV 復制，但胸苷激酶發生突變，新的抗阿昔洛韋菌株已經出現[10]，中藥熏蒸治療可能為進一步開發新的抗皰疹病毒藥物提供一定的支持。

HSK 是HSV 與機體免疫系統相互作用的結果，免疫反應猶如雙刃劍，一方面抵御病毒的侵襲，同時不斷放大的免疫反應又是造成機體損傷的原因。而免疫T 淋巴細胞介導的細胞免疫被認為是主要方面，其中CD4+T 細胞[11]在角膜的浸潤，尤其是Thl 細胞被認為在HSK 的發生發展過程中起關鍵作用。研究中也發現，HSK 眼的角膜CD4 細胞大量表達，且在病變嚴重的部位表達更明顯，對照組及聯合組的CD4 表達皆低于模型組。但在治療7 d 后，聯合組的CD4 表達較對照組略明顯，雖然并不顯著，但疾病后期，CD4 局部的浸潤可能造成加重免疫損傷的風險。因此，如何利用好中藥熏蒸清除病毒的作用，同時又避免加重角膜損傷，是關鍵的問題，仍需進一步評估中藥熱熏蒸對局部炎癥反應的影響。

CD14 是一種存在于單核細胞、巨噬細胞等細胞表面的白細胞分化抗原，在角膜上皮表達，并在調節角膜上皮Toll 樣受體4 （toll-likereceptor4，TLR4）時起重要作用[12]。此次實驗也發現HSK 時角膜上皮及基質內都有CD14 的表達，且發現治療后3 d、7d 聯合組的表達明顯增強。王如然等[13]報道中藥熏蒸在創面的愈合方面促進了巨噬細胞的激活，增加其吞噬功能。因而推斷另一方面，中藥熏蒸可能增強了單核細胞、巨噬細胞的功能，發揮對病毒的清除作用。有報道[14]指出，中藥熏蒸可減少創面滲出液中的基質金屬蛋白酶2 的含量，增加血管內皮生長因子及基質金屬蛋白酶抑制劑1 的含量，有效促進創面的愈合。

由此可見，中藥熏蒸治療HSK 在病毒的抑制和清除方面起到了積極的作用，因此，在疾病的早期運用會產生較好的效果。但疾病后期，如以免疫炎癥反應為主，則其對CD4 細胞浸潤和局部免疫反應的影響，仍需進一步研究，這也為臨床如何合理應用中藥熏蒸治療HSK 提供參考依據。