不同產(chǎn)地地骨皮藥材水提液高效液相特征圖譜研究△

董丹華，劉玉軍，于帥，林倩，代龍，高鵬*

1.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2.齊河縣人民醫(yī)院 中藥房，山東 德州 251100

地骨皮又名枸杞皮、杞根、地節(jié)和紅月附根等，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]，因其根的形狀像細(xì)的骨頭而得名[2]。地骨皮為茄科植物枸杞LyciumchinenseMill.或?qū)幭蔫坭絃.barbarumL.的干燥根皮，具有清肺降火、涼血除蒸的功效[3]。地骨皮主產(chǎn)于河北、河南、山西、陜西、四川、江蘇、浙江等省，多為野生，以河南、山西產(chǎn)量較大[4]。地骨皮含有生物堿類、黃酮類、蒽醌類、苯丙素類、有機(jī)酸類等成分，已知的具體成分有甜菜堿、地骨皮乙素、地骨皮甲素、東莨菪內(nèi)酯等[5]。地骨皮作為臨床常用中藥，收載于2015年版《中華人民共和國藥典》，標(biāo)準(zhǔn)中無【含量測定】項(xiàng)，數(shù)據(jù)庫中有關(guān)其質(zhì)量分析的報(bào)道數(shù)量有限；因此，研究地骨皮的特征譜圖有利于藥材質(zhì)量的整體控制。湯劑作為中醫(yī)臨床最傳統(tǒng)、最常見的用藥形式，煎煮溶媒多選用水，因此對(duì)地骨皮藥材的水提液進(jìn)行特征圖譜研究更具有實(shí)用價(jià)值，能直接反映出入藥部位的真實(shí)質(zhì)量。

1 儀器和試藥

1.1 儀器

LC-2030型高效液相色譜儀(配有二極管陣列檢測器，DAD),Labsolutions工作站(日本島津公司)；XS105型分析天平(感量0.01 mg，METTLES TOLEDO)；YP10002型電子天平(感量0.01 g，上海光正醫(yī)療儀器有限公司)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；KQ2200DV型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；KDM型可調(diào)控溫電熱套(山東鄄城華魯電熱儀器有限公司)。

1.2 試藥

色譜純乙腈和甲醇(美國 Honeywell B & JACS公司)，色譜純?nèi)宜?美國天地試劑公司)，實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水。地骨皮乙素對(duì)照品(批號(hào)：164991-67-7，HPLC≥98%，上海源葉生物科技有限公司)。15批地骨皮藥材采集自不同產(chǎn)地(見表1)，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院萬鵬教授鑒定為茄科植物枸杞L.chinenseMill.的干燥根皮。

表1 地骨皮藥材樣品的來源

2 方法和結(jié)果

2.1 參照物溶液的制備

取地骨皮乙素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含2 mg的溶液，即得，將其置4 ℃冰箱中避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 供試品溶液的制備

取地骨皮粉末(過三號(hào)篩)約2 g，置于具塞錐形瓶中，加水50 mL，密塞，在電熱套中加熱回流1 h，放冷，濾過，取濾液25 mL，蒸干，殘?jiān)蛹状嫁D(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 色譜條件

以Intersil ODS-SP C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)柱為色譜柱，流動(dòng)相為乙腈(A)-0.3%三氟乙酸水(B)[6]，進(jìn)行梯度洗脫(0～3 min，10%A；3～55 min，10%～25%A；55～56 min，25%～10%A；56～60 min，10%A)，檢測波長為278 nm，流速為1.0 mL·min-1，進(jìn)樣體積為10 μL，柱溫為30 ℃。

在確定上述色譜條件的情況下，將供試品溶液和參照物溶液進(jìn)樣分析，得到地骨皮藥材水提液的特征圖譜和地骨皮乙素參照物圖譜，見圖1。以出峰時(shí)間穩(wěn)定、峰面積較大的4個(gè)峰為特征峰。將參照物圖譜和供試品圖譜中相應(yīng)色譜峰、保留時(shí)間進(jìn)行比較，確定供試品圖譜中的3號(hào)峰為地骨皮乙素。

注：A.地骨皮藥材水提藥液特征圖譜；B.地骨皮乙素參照物圖譜。圖1 地骨皮藥材水提液特征圖譜與地骨皮乙素參照物圖譜

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1精密度試驗(yàn) 取DGP-03粉末按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，取此供試品溶液按2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣6次，記錄各峰的保留時(shí)間和峰面積。以地骨皮乙素峰為參照峰(S)，計(jì)算各峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，其RSD分別為0.020%～0.36%、1.0%～2.1%，均小于3%，說明儀器精密度良好。

2.4.2穩(wěn)定性試驗(yàn) 取DGP-03粉末按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，取此供試品溶液按2.3項(xiàng)下色譜條件分別在 0、2、4、6、12 h 進(jìn)樣分析，記錄各峰的保留時(shí)間和峰面積。以地骨皮乙素峰為參照峰(S)，計(jì)算各峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，其RSD分別為0.030%～0.42%、1.4%～2.3%，均小于3%，說明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3重復(fù)性試驗(yàn) 取DGP-03粉末按2.2項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，分別按2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄各峰的保留時(shí)間和峰面積。以地骨皮乙素峰為參照峰(S)，計(jì)算各峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，其RSD分別為0.020%～0.33%、1.0%～2.8%，均小于3%，說明該方法重復(fù)性良好。

2.5 樣品測定

取15批地骨皮藥材樣品，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.3項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣，記錄圖譜及各峰的保留時(shí)間和峰面積。各樣品色譜圖見圖2，以3號(hào)峰的保留時(shí)間為參照，特征峰的相對(duì)保留時(shí)間見表2，其RSD為0.137%～0.370%。特征峰的相對(duì)峰面積見表3，其RSD為10.755%～57.948%。

注：1、2、3、4號(hào)峰為15批藥材特征峰。圖2 15批地骨皮藥材水提液特征圖譜

表2 15批地骨皮藥材水提液特征峰相對(duì)保留時(shí)間

表3 15批地骨皮藥材水提液特征峰相對(duì)峰面積

2.6 相似度評(píng)價(jià)

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件2012版”計(jì)算出不同產(chǎn)地15批地骨皮藥材水提液的HPLC特征圖譜的相似度，與共有模式比較，以平均數(shù)法計(jì)算15批藥材的相似度，其結(jié)果均大于0.95，見表4。表明不同產(chǎn)地的地骨皮藥材之間既有相關(guān)性又有區(qū)別，同一產(chǎn)地不同批次的地骨皮藥材具有相似性。該方法可用于地骨皮藥材的質(zhì)量控制。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用二極管陣列檢測器，對(duì)特征圖譜的檢測波長進(jìn)行選擇，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在278 nm下，色譜峰的數(shù)目最多，各峰面積最大，分離度好，基線平穩(wěn)，圖譜較美觀，因此選用278 nm作為檢測波長。同時(shí)優(yōu)化了流動(dòng)相洗脫梯度，最后確定最佳梯度洗脫程序(0～3 min，10%A；3～55 min，10%～25%A；55～56 min，25%～10%A；56～60 min，10%A)，色譜圖上各色譜峰分離良好，保留時(shí)間適中，峰形對(duì)稱。

地骨皮乙素屬于精胺生物堿，其藥理活性非常明顯，但是因其結(jié)構(gòu)特殊，極易分解[7]，所以將對(duì)照品溶液置4 ℃冰箱中避光保存。

由相似度計(jì)算結(jié)果可知，不同產(chǎn)地各批次地骨皮藥材的相似度均大于0.95，表明各產(chǎn)地地骨皮藥材有較高的相似性。由15批藥材相對(duì)峰面積RSD結(jié)果可知，不同產(chǎn)地地骨皮藥材的質(zhì)量存在差異，其中DGP-01、DGP-02、DGP-11、DGP-12的1號(hào)和2號(hào)特征峰峰面積明顯小于其他藥材，這4批藥材分別來自陜西西安和河南商丘，其可能與當(dāng)?shù)氐乩憝h(huán)境、種植模式或栽培方式有關(guān)[8]。

表4 15批地骨皮HPLC特征圖譜相似度計(jì)算結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)建立的方法重復(fù)性好、穩(wěn)定可靠、方法簡易，有利于地骨皮藥材質(zhì)量的整體控制，對(duì)含地骨皮的中藥復(fù)方制劑的物質(zhì)基準(zhǔn)研究有重大意義。