枸杞木虱對寧夏枸杞生長的影響△

劉賽，李建領，2，楊孟可，喬海莉，郭昆，徐榮，徐常青*，陳君*

1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193；2.華潤三九醫藥股份有限公司，廣東 深圳 518110

寧夏枸杞LyciumbarbarumL.為茄科Solanaceae枸杞屬Lycium多年生落葉灌木，是我國西北地區的重要經濟作物，其干燥成熟果實枸杞子是我國傳統名貴中藥材[1]。寧夏枸杞在生長過程中極易遭受多種病蟲為害，枸杞木虱BactericeragobicaLoginova是寧夏枸杞產區的主要害蟲之一，在我國西北枸杞主產區普遍嚴重發生[2]。枸杞木虱每年發生4～5代，成蟲活躍善跳，1齡若蟲活動，2齡后固定在葉背取食，導致葉片干枯、早落，若蟲分泌物也易招致煤污病的發生[3]，嚴重時導致枝條干枯，樹勢衰弱，抽發新枝困難甚至整株病死，產量絕收[4]。此外，枸杞木虱還是枸杞另一重要害蟲枸杞癭螨的攜播越冬寄主[5-6]，枸杞癭螨能否爆發與枸杞木虱種群數量密切相關[7-8]。枸杞木虱對枸杞生產威脅極大，嚴重影響了枸杞子的產量和質量，已成為制約枸杞產業發展的重要因子。

木虱為刺吸式口器害蟲，主要在葉片、嫩梢和嫩芽上吸食寄主植物汁液，并不會直接破壞或殺死植物細胞；但由于其繁殖量大，種群數量多，過度吸食會對寄主植株產生影響[9]。枸杞木虱若蟲期體型微小、體色淡，在葉背隱蔽取食，發生初期不易察覺，生產中通常不注意防控，使得該蟲極易爆發成災；而且在后期即便將該蟲有效防控，其造成的損害也不可逆，嚴重影響枸杞樹當年及來年發枝。目前，枸杞木虱對枸杞的影響僅見防治及產量損失等宏觀研究[3，10]，對枸杞根系與生理生化等指標的影響少見報道，本研究以寧夏枸杞實生苗為試驗材料，通過人工接種枸杞木虱，對比分析枸杞木虱取食為害過程對寧夏枸杞根系生長、光合作用及生理生化的影響，分析闡明枸杞木虱的為害特點，為枸杞木虱的科學防治提供依據。

1 材料

1.1 供試植株與蟲源

枸杞實生苗：由寧夏枸杞(寧杞1號)種子培育，在光照培養箱中培養[(25±2)℃，60%±5% RH，16 h L∶8 h D]，至15～20片葉時備用。

枸杞木虱：采自中國醫學科學院藥用植物研究所枸杞試驗田，室內光照培養箱(溫濕度、光照同上)中枸杞實生苗上繁育保存。

1.2 儀器設備

光照培養箱(PRX-450 D，寧波賽福實驗儀器有限公司)；十萬分之一天平(XSE 205，梅特勒-托利多國際有限公司)；高速冷凍離心機[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]；DHG-9143BS-Ⅲ烘箱(無錫市蘇嘉試驗設備廠)；JXFSTPRP-CL全自動樣品研磨儀(上海實業發展有限公司)；紫外可見光分光光度計(UV-2550，日本島津公司)；調制葉綠素熒光成像系統IMAGING-PAM(德國WALZ公司)；佳能LiDE210掃描儀、WinFOLIA葉面積分析系統(Regent Instruments Inc.)；Digimizer圖像分析系統(MedCalc Software)。

1.3 化學試劑

總蛋白試劑盒(A045-2)、植物可溶性糖試劑盒(A145)、過氧化物酶(POD)試劑盒(A084-3)、苯丙氨酸轉氨酶(PAL)試劑盒(A137)、多酚氧化酶(PPO)試劑盒(A136)、植物總酚試劑盒(A143)、植物類黃酮試劑盒(A142)均由南京建成生物工程有限公司生產。

2 方法

2.1 枸杞木虱接種

室內培育帶有大量2齡木虱若蟲的葉片，接種于健康枸杞苗，使木虱若蟲主動轉移至枸杞葉片。24 h后檢查并保留2齡木虱若蟲50～60頭，去除多余若蟲。對照組為同期長勢一致的健康枸杞苗。

2.2 寧夏枸杞生長指標測定

接種木虱后第3、6、9、12天取樣，每次每處理取5株枸杞苗作為5個重復。取樣時將幼苗整株取出，根部浸于水中，輕抖去除泥土，洗凈后以蒸餾水潤洗，平鋪于試驗臺用濾紙吸干水分。使用掃描儀獲取葉片及根系圖像，聯合使用WinFOLIA和Digimizer軟件對葉片面積及根系長度進行測量分析。掃描結束后，測定地上部分及根系鮮質量，然后將其置于80 ℃烘箱內烘干至恒重，測定干質量。

2.3 葉片光合參數測定

接種木虱后第3、6、9、12天進行葉綠素熒光測定，每次每處理取10株枸杞苗作為10個重復。測定前將枸杞苗暗處理30 min。接種第12天后，將處理與對照葉片同時置于葉綠素熒光成像系統載物盤，獲得熒光參數成像。測定葉綠素熒光參數時，活化光打開前首先測定1次初始熒光值(Fo)和最大熒光值(Fm)，然后在自然光照下啟動系列飽和脈沖，施加多次飽和閃光脈沖[6000 μmol·(m2·s-1)-1，脈沖時間為2 s]，每隔20 s測定1次，直至脈沖終止，取最后6次飽和閃光脈沖測量值的平均值，計算PSⅡ實際光合效率Yield，計算方法見參考文獻[11]。

2.4 生理生化測定材料取樣及測定

取樣：接種木虱后第3、6、9、12天分別取樣，每次每處理5個重復，每個重復采集6株枸杞苗。取樣前，清除葉片上枸杞木虱若蟲及蜜露，以蒸餾水沖洗去除各處理葉片的葉表灰塵，水分揮干后沿葉柄基部剪下葉位相近葉片，將葉片剪碎混勻，稱量后裝入離心管，迅速投入液氮中速凍30 s，置于-80 ℃冰箱保存。

樣品前處理：每個測定指標5個重復，每個重復取樣100 mg，使用全自動樣品研磨儀在60 HZ、-20 ℃條件下振蕩研磨90 s。

測定方法：可溶性蛋白測定使用總蛋白試劑盒(A045-2)，反應后在595 nm處測定吸光度。可溶性糖測定使用植物可溶性糖試劑盒(A145)，反應后在620 nm處測定吸光度。POD測定使用POD試劑盒(A084-3)，反應后在420 nm處測定吸光度。PAL測定使用PAL試劑盒(A137)，反應后在290 nm處測定吸光度。PPO測定使用PPO試劑盒(A136)，反應后在420 nm處測定吸光度。總酚測定使用植物總酚試劑盒(A143)，反應后在760 nm處測定吸光度。類黃酮測定使用植物類黃酮試劑盒(A142)，反應后在502 nm處測定吸光度。各測定指標的具體操作方法參照相應試劑盒使用說明。

2.5 數據分析

實驗數據使用SPSS(v21，IBM)進行顯著性分析。采用t檢驗法(t-test)對不同處理總蛋白，可溶性糖，植物POD、PAL、PPO活性，植物總酚，植物總黃酮，葉綠素熒光參數及葉片面積、根系長度，地上部分和地下部分鮮質量、干質量進行統計學分析。*P<0.05,**P<0.01表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 枸杞木虱對枸杞植株生長的影響

枸杞木虱為害可顯著影響寧夏枸杞植株的生長。接種第3天，枸杞葉片面積和根系長度變化并不顯著，隨著接種天數的增加，枸杞木虱取食量逐漸增加，枸杞葉片及根系生長與對照相比受到顯著抑制，第12天時，葉片面積和根系長度分別比對照減少了54.7%和47.3%。枸杞木虱為害顯著抑制了枸杞植株地上、地下部分鮮質量及干物質積累，隨為害時間的延長，植株地上、地下部分生長受到持續抑制，至第12天時，枸杞地上、地下部分鮮質量分別比對照組減失了52.1%和62.0%，干質量分別比對照組減失了60.0%和60.6%(見圖1)。

3.2 枸杞木虱對枸杞葉片葉綠素熒光參數的影響

枸杞木虱為害可導致枸杞葉片光合效率下降(見表1)。Fo、Fm和PSⅡ實際光合效率Yield在接種枸杞木虱第3天與對照組差異無統計學意義，但隨著枸杞木虱接種天數的增加，Fo、Fm和Yield開始顯著下降，至第12天時，Fo、Fm和Yield分別比對照下降了15.7%，37.5%和28.8%。接種枸杞木虱第12天時，同一葉片不同部位之間各熒光參數有所差異(見圖2)，葉片基部光合能力高于葉尖，表現出熒光異質性。枸杞木虱降低了枸杞葉片光合能力，同時加劇了葉片基部與葉尖之間的差異。

注：A. 枸杞木虱為害對枸杞葉片面積和根系長度的影響；B. 枸杞木虱為害對枸杞植株地上、地下部分鮮質量的影響；C. 枸杞木虱為害對枸杞植株地上、地下部分干質量的影響；*或#P<0.05；**或##P<0.01；ns表示差異無統計學意義(P>0.05)。圖1 枸杞木虱為害對枸杞植株生長的影響

表1 枸杞木虱對枸杞葉片熒光參數的影響

注：**差異有統計學意義(P<0.01)。

注：CK為對照葉片；P為木虱為害的葉片；每個子圖上的數字為實際測定值，單位為任意單位。圖2 枸杞木虱接種第12天后枸杞葉片熒光參數成像

3.3 枸杞木虱對枸杞葉片生理生化的影響

枸杞木虱可導致枸杞葉片可溶性蛋白和可溶性糖含量降低(見表2)。木虱接種第36天與健康葉片相比差異無統計學意義，但隨著枸杞木虱生長發育及取食量的不斷增加，枸杞葉片可溶性蛋白和可溶性糖含量均顯著下降，至第12天時，葉片可溶性蛋白和可溶性糖分別下降了15.9%和23.67%。枸杞木虱對枸杞葉片POD、PAL和PPO的影響無規律性變化。POD活力在枸杞木虱接種第3天時稍有上升，隨后下降，至接種第9天時顯著下降23.8%。枸杞木虱可致PAL活力整體呈下降趨勢，但僅在第6天時才與對照有顯著差異。枸杞木虱接種對PPO活力的影響表現出誘導效應，第3天和第6天時與對照無顯著差異，至第9天時顯著升高，第12天時又顯著下降。枸杞木虱為害后可導致葉片總酚、類黃酮含量降低，除第9天無顯著差異外，其他取樣時間點均表現出顯著下降趨勢。

4 討論

枸杞木虱為害可顯著影響枸杞植株的正常生長，不但使地上部分生長受阻，而且還顯著抑制根系生長。枸杞木虱取食量大，對植物營養的爭奪明顯，實驗中在接種木虱第12天后枸杞幼苗即開始出現脫水萎蔫現象，生產中寧夏枸杞被木虱為害嚴重后也會導致葉片萎蔫，甚至枝條干枯，推測枸杞木虱取食量大是影響枸杞抽條發芽的主要原因。有研究顯示木虱類害蟲可抑制植物根系生長，如Nissinen等[12]發現胡蘿卜Daucuscarota被胡蘿卜木虱Triozaapicalis為害后，可導致胡蘿卜地下部分明顯縮小，本研究也發現枸杞木虱顯著影響枸杞根系正常生長，推測這是導致被害枸杞植株恢復慢，甚至病死的重要原因。

表2 枸杞木虱對寧夏枸杞生理生化的影響

注：*P<0.05；**P<0.01。

枸杞木虱若蟲通常固定在枸杞葉片背面刺吸為害，其對葉片的影響是漸進的且肉眼無法分辨，僅當枸杞遭受嚴重損傷時，枸杞葉片才出現發黃或干枯等明顯癥狀。葉綠素熒光成像系統可以實時原位探測和研究植物光合生理變化及各種外界因子對其細微影響，具有快速、靈敏和非破壞性等優點[13-14]。接種枸杞木虱第6天，枸杞葉片葉綠素熒光參數值開始下降，且隨為害時間的延長，熒光參數下降越顯著，推測枸杞木虱取食為害枸杞葉片后，PSⅡ活性中心受到傷害，破壞了葉片光合機能，影響光合作用的正常進行，這與張文英等[15]利用LI-6400光合儀測定研究鴨腳樹星室木虱Pseudophacopteronalstonium對糖膠樹Alstoniascholaris致癭后的結果類似，與陳建明、Watanabe等[16-17]關于水稻褐飛虱刺吸為害引起水稻葉片葉綠素崩解，光合作用強度下降，蛋白質分解，導致植株產生“虱燒”現象類似。

植物POD、PAL和PPO是植物體內重要的防御酶，參與活性氧清除[18]，酚類、木質素、生物堿[19]以及醌類等相關抗性物質的合成[20]，其中植物總酚和類黃酮對植食性節肢動物的取食和生長發育有抑制作用[21-22]，這些防御酶及抗性物質對增強植物抗病蟲能力具有重要作用。本研究的結果顯示，枸杞木虱為害可顯著降低枸杞植株營養，但并未引起枸杞抗性相關酶(POD、PAL、PPO)活性和次生物質總酚(單寧為主)、類黃酮含量顯著升高，甚至出現降低，與柑橘木虱Diaphorinacitri抑制柑橘Citrusreticulata或九里香Murrayapaniculata葉片防御酶(SOD、POD等)活性[23]、桉樹木虱Glycaspisbrimblecombei抑制桉樹Eucalyptuscamaldulensis葉片多酚類物質含量[24]的研究結果類似。同時，枸杞木虱也可能通過大量攝取植物營養，導致植物體內合成防御酶原料不足而使其活性受到抑制，酚類物質合成減少[24-25]，具體原因有待進一步研究。