亞臨界水提取蘆葦多酚的工藝優(yōu)化及抗氧化性能研究

劉莎

巴音郭楞職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆 庫爾勒 841000

蘆葦為多年生草本植物，是一種在水陸交錯帶中易生存的禾本科蘆葦屬植物，它繁殖能力強(qiáng)，具有極高的產(chǎn)量[1]。在水生植物的應(yīng)用中，蘆葦也是當(dāng)今國際公認(rèn)的挺水植物優(yōu)勢品種[2]。我國蘆葦資源豐富，主要分布在東北三江平原、黃河三角洲、新疆、河北白洋淀等地區(qū)[3]。其中,新疆博斯騰湖中生長的蘆葦有籍可查就有兩千多年的歷史，博斯騰湖蘆葦產(chǎn)區(qū)也是我國四大蘆葦產(chǎn)區(qū)之一[4]，該地區(qū)產(chǎn)出的蘆葦光熱條件好、光照時間長、早晚溫差大，蘆葦粗長[5]。然而一直以來蘆葦傳統(tǒng)的應(yīng)用領(lǐng)域主要集中在造紙、建筑等方面[6]，其實蘆葦也是很好的藥食同源植物，傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為蘆根具有養(yǎng)陰、清熱、利尿的解毒功能[7]，此外蘆葦體內(nèi)所含的活性類物質(zhì)還有較好的保健功效[8-10]。

植物多酚為單寧的前體化合物以及聚合物，它主要分為水解單寧和縮合單寧等，廣義上還包括小分子酚類化合物，如花青素、兒茶素、沒食子酸等天然酚類[11-12]。多酚是植物中重要的次生代謝產(chǎn)物，多酚類物質(zhì)可以通過提供氫原子或螯合劑來抑制氧化作用，這一作用，使其具有較強(qiáng)的抗氧化能力和清除自由基能力[13]。近年來，多酚類物質(zhì)的抗氧化性及其與小分子的協(xié)同抗氧化性能也備受關(guān)注[14]，其實多酚物質(zhì)除了具有抗氧化作用以外，還具有抑菌、抗癌等功效，因此植物多酚也被廣泛用于食品、藥品等諸多領(lǐng)域。

近年來，隨著現(xiàn)代中藥的不斷發(fā)展，多酚類物質(zhì)的提取工藝也不斷被優(yōu)化。除了常見的溶劑提取法以外，超聲波提取、微波輔助提取以及脈沖電場等技術(shù)也被廣泛運(yùn)用[15]。亞臨界水提取法是一種綠色、無化學(xué)溶劑殘留的高效提取方法，被應(yīng)用于眾多中藥、植物、食品中具有生物活性物質(zhì)的提取[16]。水在亞臨界狀態(tài)下會隨著溫度的變化由強(qiáng)極性向非極性過渡，這樣一種連續(xù)的過程勢必較大程度地提取出活性目標(biāo)物質(zhì)[17]，近些年該技術(shù)廣泛應(yīng)用于植物多酚的提取。本文旨在利用亞臨界水提取法找尋博斯騰湖中蘆葦多酚類物質(zhì)的最佳提取工藝，并對其提取物進(jìn)行抗氧化活性的初探。

1 材料

1.1 儀器

5300PC型紫外-分光光度計(上海元析儀器有限公司)；BS210S型電子天平(德國賽多利斯)；HH-SA超級恒溫水浴(金壇市醫(yī)療儀器廠)；CSF-1A超聲波發(fā)生器(上海超聲儀器廠)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；DHP-420電熱恒溫培養(yǎng)箱(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)；水熱反應(yīng)釜(上海貝倫儀器廠)。

1.2 試藥

蘆葦2017年10月采自新疆博斯騰湖畔及焉耆包兒海鄉(xiāng)開來提村，由巴音郭楞職業(yè)技術(shù)學(xué)院孫紅艷副教授鑒定為正品。

沒食子酸(中國食品藥品檢定研究院，批號：110831-200803)；乙醇、甲醇、丙酮、福林-酚試劑、無水碳酸鈉、鄰二氮菲、H2O2、FeSO4·7H2O、Na2HPO4、NaH2PO4(分析純)；二苯代苦味酰肼自由基(DPPH·，Sigma-Aldrich 公司)。

2 方法

2.1 樣品的預(yù)處理

將預(yù)曬干的蘆葦桿和葉分別在70 ℃下烘5 h后，粉碎并過80目篩，繼而避光干燥的環(huán)境中保存。

2.2 提取實驗

稱取1.0 g蘆葦葉分別以50 mL甲醇、乙醇(95%)、乙醇(50%)、丙酮為提取溶劑，提取溫度40 ℃，超聲頻率為30 kHz下提取30 min，減壓抽濾并定容至100 mL容量瓶中待測。

稱取0.5 g蘆葦葉放入25 mL水熱反應(yīng)釜中，加入15 mL蒸餾水，待烘箱溫度升至180 ℃時將反應(yīng)釜放入烘箱預(yù)熱5 min后開始計時。反應(yīng)2 h后，取出反應(yīng)釜水冷20 min減壓抽濾，并定容至100 mL容量瓶中待測。

分別對亞臨界提取方法中的溫度、料液比、時間3個因素進(jìn)行單因素及正交試驗優(yōu)化。

2.3 定量實驗

真空干燥至恒重的沒食子酸為對照品，移取質(zhì)量濃度分別為0.86、17.72、35.44、53.16、70.88、88.6 μg·mL-1的溶液1 mL于10 mL容量瓶中，依次加入1 mL去離子水，0.5 mL福林-酚試劑，混勻靜置5 min，加入26.7%Na2CO3溶液1.5 mL。室溫避光待反應(yīng)2 h后于760 nm下測定吸光度[18]。

2.4 抗氧化實驗

以甲醇為溶劑配制成濃度為0.04 mg·mL-1的DPPH·溶液，取1 mL樣品于試管中，加入3 mL DPPH·溶液，常溫避光放置40 min后，于517 nm處測其吸光度(A樣)(空白對照組用1 mL甲醇代替樣品)測其吸光度(A空)[19]。DPPH·清除率按公式(1)計算。

E=[1-A樣/A空]×100%

(1)

取0.75 mmol·L-1鄰二氮菲溶液1 mL于比色管中，依次加入PBS液2 mL、蒸餾水1 mL，混勻后加0.75 mmol·L-1硫酸亞鐵液1 mL，0.01% H2O21 mL，在37 ℃下反應(yīng)60 min，于536 nm處測其吸光度(AP值)；以1 mL蒸餾水代替AP值實驗過程中的1 mL H2O2(AB值)；以1 mL試樣液代替AP值實驗過程中的1 mL蒸餾水(AS值)[20]。·OH清除率按公式(2)計算。

d=[(AS-AP)/(AB-AP)]×100%

(2)

2.5 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)采用Excel 2007及Origin 8.0軟件處理。

3 結(jié)果討論

3.1 福林酚測定多酚方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線

以吸光度為縱坐標(biāo)，沒食子酸質(zhì)量濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.010X+0.066 27，線性范圍8.86～88.6 μg·mL-1，r=0.999 2(n=6)。

3.2 提取溶劑對多酚提取率的影響

不同提取溶劑對多酚提取率的影響見圖1。

圖1 不同溶劑對多酚提取率的影響

由圖1可知，亞臨界水對蘆葦多酚的提取率與實驗所選有機(jī)及復(fù)配溶劑提取率較為接近。但考慮到亞臨界水提取法無毒、無溶劑殘留、提取效率高、能耗低、適合食品及藥品生產(chǎn)等諸多優(yōu)勢[21]，因此本文著重優(yōu)化了亞臨界水提取蘆葦多酚的工藝條件。

3.3 單因素試驗

3.3.1料液比對提取率的影響 由圖2可知，多酚提取率隨著料液比的減小整體呈現(xiàn)上升趨勢，其中在1∶10～1∶40上升速率最快，而越過1∶40上升趨勢趨于平緩，但考慮到料液比繼續(xù)減小會給后期濃縮帶來較大的工作量，因此料液比初選為1∶40。

圖2 料液比對多酚提取率的影響

3.3.2溫度對提取率的影響 見圖3。

圖3 溫度對多酚提取率的影響

由圖3可知，多酚提取率隨著反應(yīng)溫度的升高整體呈現(xiàn)上升趨勢，其中在140～160 ℃上升速率最快，而越過180 ℃提取率基本維持不變，考慮到溫度繼續(xù)加大會使得工藝能耗加大，因此溫度初選為180 ℃。

3.3.3時間對提取率的影響 見圖4。

圖4 時間對多酚提取率的影響

由圖4可知，提取時間越長多酚的提取率升高，這是一個累積的過程。其中在60 min后提取率變化較為平緩，但考慮到到溶出時間加長可能會增加雜質(zhì)的溶出量，這樣會給后期的純化帶來較大工作量，綜合分析提取時間初選為60 min。

3.3.4正交試驗結(jié)果 根據(jù)單因素試驗結(jié)果選定了一定范圍的提取溫度、提取時間及料液比L9(34)正交表進(jìn)行試驗，結(jié)果見表1。

表1 亞臨界水水提取蘆葦多酚工藝正交試驗結(jié)果

由表1數(shù)據(jù)可知，在選定的因素范圍之內(nèi)，影響蘆葦提取率最大的因素為反應(yīng)溫度，其次為反應(yīng)時間，再次為料液比。其中反應(yīng)溫度越高、反應(yīng)時間越長、料液比越大越有利于多酚的溶出。經(jīng)過正交試驗極差分析，發(fā)現(xiàn)優(yōu)化工藝條件為浸提溫度200 ℃、料液比1∶30、浸提時間為120 min，而試驗組合中最佳工藝條件確為浸提溫度200 ℃、料液比1∶40、浸提時間為120 min。經(jīng)過分析兩者結(jié)果略有差異，為了確定最優(yōu)的工藝條件，還應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行料液比的驗證實驗。因此，在浸提溫度200 ℃、浸提時間為120 min的條件下，實驗又測定了料液比為1∶30和1∶40時的多酚提取率，結(jié)果顯示當(dāng)料液比為1∶30時，提取率為(3.87±0.02)%；當(dāng)料液比為1∶40時，提取率為(4.16±0.06)%。

從結(jié)果分析，料液比1∶40的提取率明顯高于1∶30，由此確立最佳料液比為1∶40。因此最優(yōu)提取工藝條件為浸提溫度200 ℃、料液比1∶40、浸提時間為120 min。

3.3.5放大試驗結(jié)果 放大試驗是在提取溫度200 ℃、提取時間120 min、料液比1∶40的最優(yōu)提取條件下將物料放大100倍完成的測定。結(jié)果顯示，放大試驗的多酚提取率為(3.53±0.02)%。

經(jīng)對比，放大試驗的提取率小于原試驗提取率，原因可能在于物料增多后靜置反應(yīng)容器反應(yīng)可能不均勻，導(dǎo)致未能高效地提取多酚。后期可通過振蕩或超聲、微波輔助預(yù)處理等手段加以提高。

3.3.6水、陸生蘆葦葉、莖多酚的測定結(jié)果比較 在已優(yōu)化的最優(yōu)提取工藝條件下，分別以水生蘆葦葉、莖及陸生蘆葦葉、莖4種原料為試材，測定其多酚含量依次：水生蘆葦葉4.22%、水生蘆葦莖3.36%、陸生蘆葦葉3.50%、陸生蘆葦莖3.49%。水生蘆葦葉中多酚含量明顯高于其他3種試材。

3.3.7蘆葦葉、莖抗氧化實驗結(jié)果 在已優(yōu)化的最優(yōu)提取工藝條件下，分別提取了以水生蘆葦葉、莖及陸生蘆葦葉、莖4種原料的多酚試樣，進(jìn)行了·OH和DPPH·自由基的清除能力測定，結(jié)果見表2，

表2 ·OH和DPPH·自由基的清除能力 %

結(jié)果可知，在相同提取工藝條件下，水生蘆葦葉中多酚含量明顯高于水生蘆葦莖中多酚含量，同時也高于陸生蘆葦植株中葉、莖中多酚的含量，而陸生蘆葦植株葉、莖多酚含量無明顯差異。水生蘆葦葉清除自由基的能力明顯高于其他3個樣品，特別是在清除DPPH·實驗中有著絕對的優(yōu)勢，而清除·OH的能力也與多酚總量的大小有著密切關(guān)系(r為0.939 3)。此外陸生蘆葦葉、莖中多酚含量相差無幾，但清除DPPH·卻存在很大差異，這應(yīng)該是由于植株不同部位多酚種類的差異性帶來的結(jié)果。

4 結(jié)論

通過單因素及正交試驗，亞臨界水提取法在蘆葦葉多酚的提取過程中對工藝影響因素的大小依次為浸提溫度>浸提時間>料液比。最終篩選的最優(yōu)工藝條件為浸提溫度200 ℃、料液比1∶40(g∶mL)、浸提時間為120 min，在此優(yōu)化條件下多酚提取率可達(dá)4.22%。

通過2種不同的抗氧化能力測定體系，選擇了水、陸生植株的葉、莖部位進(jìn)行抗氧化實驗，結(jié)果表明，不同樣品的多酚提取物均能對·OH和DPPH·自由基有一定的清除能力，特別是在清除·OH的實驗中，清除能力與總多酚含量有明顯的量效關(guān)系，即多酚含量越高清除能力越強(qiáng)。此外，在相同的提取工藝下，水生蘆葦葉中的多酚含量較其他樣品有絕對的優(yōu)勢，并且在相同濃度下，對DPPH·的清除能力也是最強(qiáng)的。而比較了陸生蘆葦中葉與莖多酚提取物的清除DPPH·能力后，也發(fā)現(xiàn)蘆葦葉多酚提取物的效果更佳，同等濃度下，葉多酚的清除率可達(dá)莖多酚清除率1.9倍，這可能是兩部分的多酚種類存在較大差異的結(jié)果。綜合以上結(jié)果，蘆葦多酚提取物，可作為較好的天然抗氧化劑來源被加以利用。